APOLIPOPROTEINE A-I (Ref. NPP13), B (Ref. NPP14) - Radim S.p.A.

APOLIPOPROTEINE A-I (Ref. NPP13), B (Ref. NPP14)
REAGENTI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLE
APOLIPOPROTEINE A-I (Apo A-I) E B (Apo B) NEL SIERO UMANO CON METODO
NEFELOMETRICO
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
APPLICAZIONI CLINICHE
Le Apolipoproteine sono componenti proteiche che si accompagnano solitamente a una
consistente parte lipidica. Le Apolipoproteine Apo A-I e Apo B sono associate, rispettivamente,
all' HDL (High Density Lipoprotein) ed all' LDL (Low Density Lipoprotein) e presentano funzioni
opposte.
La Apo A-I ha il ruolo di attivare l'enzima (Lecitina-Colesterolo-Aciltransferasi) che esterifica il
colesterolo. Questo, una volta esterificato, può essere trasportato nel fegato ed eliminato.
Concentrazioni ridotte di Apo A-I si associano a rischio di aterosclerosi, anche in presenza di
normale concentrazione di Apo B. In pazienti con lesioni vasali aterosclerotiche, epatite acuta,
cirrosi e nei pazienti trattati con insulina si registrano livelli di Apo A-I molto bassi.
La Apo B, invece, partecipa al trasporto del colesterolo dal fegato alle cellule. Elevate
concentrazioni di questa Lipoproteina concorrono all'aumento di rischio di aterosclerosi e si
verificano in pazienti con alterazioni vasali in atto.
La determinazione quantitativa delle Apolipoproteine Apo A-I ed Apo B risulta più attendibile, ai
fini della valutazione del rischio aterosclerotico, rispetto alla misurazione del solo colesterolo
(HDL ed LDL). Tale rischio viene espresso come rapporto tra Apo B / Apo A-I ed è tanto più
elevato quanto lo è il suo quoziente.
PRINCIPIO DEL METODO
Le Apolipoproteine contenute nel siero umano formano degli immunocomplessi reagendo con
gli anticorpi specifici. Sfruttando il fenomeno della diffrazione della luce che questi
immunocomplessi provocano, si è in grado, per mezzo del nefelometro, di misurare l'intensità
della luce diffratta, che risulta proporzionale alla concentrazione delle Apolipoproteine presenti
nel campione in esame. La valutazione avviene per confronto con un calibratore a
concentrazione nota.
REAGENTI CONTENUTI NELLA CONFEZIONE
− I reagenti devono essere conservati a 2°-8°C. Durante la conservazione, l'antisiero può
presentare flocculazioni o intorbidamenti che non dipendono da contaminazioni e che non
influiscono sull'attività. In questi casi è necessario filtrare l'antisiero prima dell'uso. Allo
scopo, si consiglia di usare filtri monouso con un diametro dei pori di 0.45 5m.
− La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta e si riferisce al
componente conservato chiuso a 2°-8°C.
• A/S Antisiero: 1 flacone (2 mL) di antisiero policlonale, ottenuto in capra, contro
Apolipoproteina A-1 o B umana altamente purificata. Conservante: NaN3 (

MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
L'antisiero deve essere utilizzato con i seguenti reagenti:
• Calibratore Apolipoproteine, (Ref. NCPP1APO)
• Controllo Apolipoproteine, (Ref. NCPP2APO)
• Diluente, (Ref. NDPP1)
• Tampone di reazione, (Ref. NDPP2)
• Tampone Supplementare, (Ref. NSPP1) (solo per il kit Ref. NPP13)
• Nefelometro Delta (Ref. 010138)
• Altro materiale di consumo e attrezzature sono descritte nel manuale d'uso del Nefelometro
Delta.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme:
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni e reagenti; a tal fine è consigliabile
usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti
norme di sicurezza:
− Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e
durante il dosaggio.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio.
− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire
accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la
pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le
modalità sotto riportate.
− I reagenti per cui non si fornisce la scheda di sicurezza non contengono sostanze chimiche
pericolose o se presenti, queste sono al di sotto dei limiti di concentrazione definiti nel
D.Lgs.285/98 e nella direttiva CEE 91/155.
− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive CEE
(91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in
automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER 180103;
devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere effettuato su campioni di siero umano fresco. I campioni di siero devono
essere completamente coagulati e, dopo essere stati centrifugati, non devono contenere
particelle o tracce di fibrina in sospensione; prima del dosaggio, accertarsi che i campioni siano
perfettamente limpidi. Pertanto, campioni fortemente lipemici o campioni congelati, che dopo lo
scongelamento si presentano torbidi, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10' a
ca.15000 g). Dopo quest'ultima, al di sopra del siero si dispongono i chilomicroni ed i lipidi liberi,
per il test si utilizza la parte chiara. I campioni di siero possono essere conservati a 2°-8°C per 8
giorni, per tempi più lunghi (1 anno) si consiglia di congelarli a -20°C. Evitare ripetuti
congelamenti e scongelamenti.
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PROCEDIMENTO OPERATIVO
− Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento
− Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente (15°-25°C).
− Seguire il procedimento operativo descritto sul manuale d'uso del Nefelometro Delta, che
prevede l'allestimento di quanto segue:
− Curva di calibrazione: viene preparata automaticamente dallo strumento mediante
diluizioni seriali del Calibratore (Ref. NCPP1APO) con l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Le
diluizioni effettuate vengono quindi impiegate per la calibrazione, che rimane valida purché il
dosaggio dei sieri di controllo rientri nei limiti attesi. La calibrazione deve essere
necessariamente ripetuta ogni qualvolta si utilizzi un nuovo lotto di antisiero.
− Campioni: prima del dosaggio, i sieri vengono diluiti automaticamente dallo strumento alla
diluizione di 1:20 utilizzando l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Qualora i valori dei campioni
siano al di fuori dell'ambito di misura è opportuno ripetere il test, utilizzando una diluizione
maggiore o minore.
CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO
Per ogni serie di campioni e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di antisiero, è necessario
effettuare un controllo di accuratezza e di precisione, utilizzando il Controllo per Apolipoproteine
(Ref. NCPP2APO). Il controllo viene trattato come i campioni in esame. Per i limiti attesi di tali
controlli fare riferimento alla relativa tabella fornita a corredo della confezione del controllo
stesso.
CALCOLO DEI RISULTATI
La valutazione dei campioni viene eseguita in modo automatico, mediante elaborazione dei
risultati con una funzione logit-log.
VALORI NORMALI
I valori di Apo A-I ed Apo B sotto riportati sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun
laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento :
Proteina siero
Apo A-I donne: 1.25 - 2.15 g/L uomini: 1.10 - 2.05 g/L
Apo B donne: 0.55 - 1.25 g/L uomini: 0.55 - 1.40 g/L
Apo B / Apo A-I donne: 0.30 - 0.90 g/L uomini: 0.35 - 1.00 g/L
CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
SPECIFICITA'
Gli Antisieri utilizzati risultano essere specifici per la determinazione delle rispettive
Apolipoproteine umane (Apo A-I, Apo B).
SENSIBILITA'
La sensibilità della determinazione viene definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e
dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nel calibratore.
Gli ambiti di misura sono riportati nel manuale d'uso del Nefelometro Delta.
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PRECISIONE
La precisione è stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio.
Intra-saggio Inter-saggio
Proteina n° repl. Valore medio [g/L] CV % n° repl. Valore medio [g/L] CV %
Apo A-I 15 1.60 4.33 15 1.60 2.62
Apo B 15 1.06 3.97 15 1.11 4.10
CORRELAZIONE TRA METODI
Campioni di siero sono stati esaminati con gli antisieri Radim anti-Apolipoproteine umane Apo
A-I(y) o Apo B(y). Tali risultati sono stati messi a confronto con un sistema nefelometrico di
riferimento (x). Le correlazioni dei risultati sono riportate nella tabella sottostante:
Proteina Regressione lineare Coeff. di correlazione n° sieri
Apo A-I y = 0.96 x + 0.04 g/L 0.997 125
Apo B y = 0.98 x + 0.26 g/L 0.997 132
LIMITI DEL TEST
La presenza di torbidità o di particelle può interferire nell'esecuzione del test. Si raccomanda,
pertanto, di rimuovere mediante centrifugazione eventuali particelle dovute a sieri non
completamente coagulati, a denaturazione proteica o presenti. Per motivazioni tecniche relative
alla produzione e/o all'invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con i sieri di controllo e
con i sieri per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo
utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti facendo riferimento a valori
specifici per i diversi metodi utilizzati.
Si possono verificare interferenze nella determinazione delle Apolipoproteine in presenza di
campioni iperlipemici o con elevata concentrazione di trigliceridi. In questi casi si possono
ridurre tali interferenze eseguendo una maggiore diluizione del campione.
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APOLIPOPROTEIN A-I (Ref. NPP13), B (Ref. NPP14)
REAGENTS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF HUMAN APOLIPOPROTEIN A-I
(Apo A-I) and B (Apo B) IN HUMAN SERUM WITH NEPHELOMETRIC METHOD
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
CLINICAL APPLICATIONS
Apolipoproteins are the proteic components of lipoproteins. Apolipoprotein A-I is associated to
HDL (High Density Lipoprotein) and Apolipoprotein B to LDL (Low Density Lipoprotein); they
have opposite role.
Apo A-I activates Lecithin-Cholesterolo-Acyltransferase which catalyses the esterification of
cholesterol. The resulting esterified cholesterol can be transported to the liver, metabolized and
excreted. Decreased Apo A-1 level may be a risk factor for atherosclerotic processes, even if
the concentrations of Apo B are normal. Person with atherosclerotic vascular changes, acute
hepatitis, hepatic cirrhosis and insulin-treated diabetics frequently exhibit decreased levels of
Apo A-1. Apo B is involved in transporting cholesterol from the liver to the vessel cell. Elevated
levels of this protein are frequently found in patients with atherosclerotic vascular changes and
are a risk factor for the atherosclerosis.
The assay of Apolipoproteins A-1 and B has a greater prognostic power, in assessing the risk of
atherosclerosis, than the sole determination of HDL and LDL cholesterol. A parameter for
extimating this risk is the quotient Apo B/Apo A-1: the higher the quotient, the greater the risk of
atherosclerosis.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The human serum Apolipoprotein A-1 and B form immune complexes with specific antibodies.
With the light diffraction phenomenon produced by these complexes it is possible to measure
the intensity of scattered light using a nephelometer. This intensity is proportional to the
concentration of the relevant Apolipoprotein A-1 and B in the sample. The result is evaluated by
comparison with a calibrator of known concentration.
REAGENT PROVIDED WITH THE KIT
- Store the reagent at 2°-8 °C. During storage the antiserum can develop precipitates or
turbidity which are not caused by microbial contamination and do not affect their activity. In
such cases the antiserum should be filtered prior to use. Disposable filters with a pore size of
0.45 5m are suitable for this purpose.
- The expiry date is given on the label and it refers to the closed component stored at 2°-8°C.
• A/S Antiserum: 1 vial (2 mL) of polyclonal antiserum, produced by immunisation of goat to
highly purified Apolipoprotein A-1 or B. Preservative: NaN3 (< 0.1 %). Ready for use. After
each use store the reagent, sealed hermetically, at 2°-8°C for 4 weeks. Do not freeze. The
antibody titres (T) indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in agarose
gel by 1 mL of the corresponding antiserum. The titres are determined by radial
immunodiffusion and are printed on the vial labels.
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MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
The Antiserum must be used with the following reagents:
• Apoliprotein Calibrator, (Ref. NCPP1APO)
• Apoliprotein Control, (Ref. NCPP2APO)
• Diluent, (Ref. NDPP1)
• Reaction Buffer, (Ref.NDPP2)
• Supplementary Buffer, (Ref. NSPP1) (only for kit Ref. NPP13)
• Delta Nephelometer (Ref. 010138)
• Disposable materials and samples as described in the instruction manual for the Delta
Nephelometer.
WARNINGS AND PRECAUTIONS
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed:
- Do not use reagents beyond their expiry date
- Avoid any contamination among samples and reagents. For this purpose disposable tips
should be used for each sample and reagent.
In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions
must be observed:
- Use disposable gloves while handling any potentially infectious material and while
performing the assay.
- Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
- Avoid splashing and aerosol formation; in such cases wash carefully with a 3% sodium
hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious
and disposed of accordingly.
- The reagents for which a Safety Data Sheet is not supplied do not contain hazardous
chemical substances or, if they do, are below the concentration limits established by the
Italian decree D.Lgs.285/98 in compliance with EEC directive 91/155.
- According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with EEC directives
(91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC) all waste products originating from either manual
and/or automated processing are classified as hazardous special waste materials (European
classification code180103). As such they must be eliminated by delegating to special
enterprises qualified in waste collection and disposal.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Fresh serum human samples are suitable for use. Serum samples should have coagulated
completely and, after centrifugation, should contain no particles or traces of fibrin. Prior to use
be sure that samples are perfectly clear. Specimens showing particulate matter or turbidity
should be centrifuged (10 minutes at approx. 15,000 x g) prior to use. Serum samples can be
stored at 2°-8 °C for 8 days, for longer periods (1 year) it is advisable to freeze samples at -20
°C. Repeated Freeze/thawing of samples should be avoided.
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ASSAY PROCEDURE
- All steps are automatically performed by the instrument.
- Allow the reagents and samples to warm up to room temperature (15° to 25°C).
- Consult the Delta Nephelometer manual for details regarding the operation of the instrument
in preparation of the following:
- Reference curve: is automatically prepared by instrument with serial dilutions of the
Calibrator (Ref. NCPP1APO) using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). These dilutions are
used for calibration. The calibration is valid as long as control serum performances are
reproduced within their expected limits. Every time a different lot of antiserum is used a new
calibration curve must be prepared.
- Specimens: prior to use, serum samples are automatically diluted 1:20 for Apolipoprotein A-
1 or B assay using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). If the readings obtained are outside
the assay range the assay can be repeated using a higher or lower dilution of sample.
- Internal Quality Control: for each series of serum samples as well as the initial opening of
an antiserum vial, an accuracy and precision control should be assessed using the
Apolipoprotein Control (Ref. NCPP2APO). The controls are assayed and results evaluated
as for patient samples. For the expected values refer to the table provided with the control
kit.
CALCULATION OF RESULTS
The evaluation of samples is automatic and the results are elaborated by means of a logit-log
function.
NORMAL VALUES
The Apolipoprotein A-1 and B values reported below are indicative. We suggest that each
laboratory establish its own normal range:
Protein serum
Apolipoprotein A-I women: 1.25 - 2.15 g/L men: 1.10 - 2.05 g/L
Apolipoprotein B women: 0.55 - 1.25 g/L men: 0.55 - 1.40 g/L
Apo B / Apo A-I women: 0.30 - 0.90 g/L men: 0.35 - 1.00 g/L
ASSAY PERFORMANCE
SPECIFICITY
Antisera used are specific for determination of corresponding human Apolipoprotein A-1 and B.
SENSITIVITY
The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends
therefore upon the concentrations of the proteins in the calibrator.
Typical measuring ranges are given in the Delta Nephelometer instruction manual.
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PRECISION
Precision was evaluated upon intra- and inter-assay variability.
Intra-assay Inter-assay
Protein repl. n° Mean value [g/L] CV % repl. n° Mean value [g/L] CV %
Apo A-I 15 1.60 4.33 15 1.60 2.62
Apo B 15 1.06 3.97 15 1.11 4.10
METHOD COMPARISON
Serum samples were assayed with Radim antisera to human Apolipoprotein A-1(y) and B (y).
These results were confronted with a reference nephelometric system(x). Correlation results
yielded the following data:
Protein Linear Regression Coeff. of correlation n° samples
Apo A-I y = 0.96 x + 0.04 g/L 0.997 125
Apo B y = 0.98 x + 0.26 g/L 0.997 132
LIMITS OF THE ASSAY
Turbidity or particles can interfere with the assay. Any particles formed due to serum samples
not completely coagulated, proteinic denaturation in samples must be removed by
centrifugation.
Due to technical manufacturing reasons and/or aged samples the results obtained for control
samples and inter-laboratory survey samples may differ depending on the assay method used.
It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target
values.
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M303 - Rev. 6 Maggio 2005
− RADIM SpA - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia – Tel.: 0039/06/91249.1 -
Fax: 0039/06/91249.443; National Order Entry: 0039/06/91249.702; Export Dept.:
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