ALLERGEN Total IgE REF - Radim S.p.A.

ALLERGEN
Total IgE
REF A1002
Italiano p. 3
English p. 11
Deutsch s. 19
Σ 96
M541 – Rev. 1 – 06/2010

COMPONENTI DEL KIT - KIT COMPONENTS - KIT KOMPONENTEN
Reag. Quant.
MT PLATE
CONJ│BIOT
CAL│A…F
BUF│INC
DIL│SPE
CONJ│HRP
SUBS│TMB
SOLN│STOP
1 x 96
1 x 13 ml
6 x 0.5 ml
1 x 18 ml
1 x 10 ml
1 x 13 ml
1 x 13 ml
1 x 13 ml
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
Pronto per l’uso.
Ready for use.
Gebrauchsfertig.
BUF│WASH│10X 1 x 100 ml Conc., Konz.: 10x
"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo
www.radim.com".
"The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website
www.radim.com".
"Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική
διεύθυνση www.radim.com".
"In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der
Adresse www.radim.com konsultiertwerden".
"Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse
www.radim.com".
"Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro
sitio Internet www.radim.com".
"As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site
Internet, ao endereço www.radim.com."
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 2/32

DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLE IgE
TOTALI NEL SIERO E PLASMA UMANO
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
1.0 USO PREVISTO
Il kit ALLERGEN Total IgE è un test immunoenzimatico per la determinazione quantitativa delle
immunoglobuline totali di tipo E (IgE) in siero o plasma umano. È esclusivamente per uso diagnostico in
vitro ed i risultati ottenuti devono essere usati in associazione ad altri dati clinici.
2.0 SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Le immunoglobuline di classe E (IgE) contengono 2 tipi di catene polipeptidiche, hanno un peso
molecolare di circa 200.000 (1) e si legano alla superficie dei mastociti e dei granulociti basofili. Il legame
degli allergeni alle IgE legate alle cellule provoca il rilascio di istamina e di altre sostanze vasoattive da
cui scaturisce una cascata di eventi nota come reazione allergica. È stato dimostrato che la maggior
parte dei pazienti con patologie allergiche atopiche, come l’asma atopica, la dermatite atopica e la
febbre da fieno, mostrano un aumento dei livelli di IgE nel sangue (4,5,6). Individui non allergici hanno
concentrazioni ampiamente variabili; durante l’infanzia esse normalmente aumentano, raggiungendo
nella seconda decade della vita i livelli tipici degli adulti (7, 8). La misurazione delle concentrazioni delle
IgE totali è importante nella prima indagine delle allergie infantili e come strumento diagnostico per
prevedere future manifestazioni atopiche (9, 10, 11). Un aumento significativo può essere riscontrato
non solo nei pazienti allergici, ma anche in casi di mieloma da IgE, aspergillosi polmonare e durante lo
stadio attivo di infezioni da parassiti (12, 13). Si riscontrano livelli aumentati di IgE in caso di
ipergammaglobulinemia, malattie autoimmuni, coliti ulcerose, epatite, cancro e malaria (14).
3.0 PRINCIPIO DEL TEST
L’ALLERGEN Total IgE si basa sulla tecnica immunoenzimatica di tipo “sandwich”. Il campione da
testare viene aggiunto nei pozzetti delle microstrips, nei quali sono stati immobilizzati degli anticorpi
monoclonali anti-IgE umane. Durante la prima incubazione le anti-IgE della fase solida catturano le IgE
del campione. L’aggiunta e la successiva incubazione con il coniugato Anti-IgE-biotina portano alla
formazione del sandwich: fase solida anti-IgE : IgE : Anti-IgE-Biotina. Le ulteriori incubazioni con il
coniugato Streptavidina-Perossidasi e con il Substrato Cromogeno, rispettivamente, portano allo
sviluppo del colore blu. La reazione enzimatica viene successivamente bloccata con la Soluzione
Bloccante che fa virare la soluzione al giallo. Il valore di assorbanza va letto con un fotometro a 450 nm:
la concentrazione delle IgE del campione è direttamente correlata all’intensità del colore.
4.0 COMPONENTI DEL KIT
MT PLATE
CONJ│BIOT
CAL│A…F
BUF│INC
DIL│SPE
Reagenti
Micropiastra sensibilizzata con anti-IgE: una busta contenente una micropiastra
di 12 strip da 8 pozzetti ciascuna, sensibilizzati con anticorpi monoclonali anti-IgE.
Conservare le strip inutilizzate a 2…8°C nell’apposita busta di plastica con
l’essiccante.
Coniugato anti-IgE-Biotina: un flacone (13 ml) di Coniugato anti-IgE-Biotina in
tampone Tris, pH 8.1, conservanti e stabilizzanti. Pronto per l’uso.
Calibratori per IgE Totali: 6 flaconi di 0.5 ml ognuno. I flaconi contengono IgE
umane in siero di cavallo, con Proclin 300 allo 0.01% come conservante. Le
concentrazioni di IgE sono: 0 - 10 - 50 - 250 - 500 - 1000 KIU/L. (WHO 2 nd IRP
75/502). Pronti per l’uso.
Tampone di Incubazione: un flacone (18 ml) contenente TRIS buffer, pH 8.4, con
Tween 20 allo 0.1% e Proclin 300 allo 0.005% come conservanti. Pronto per l’uso.
Diluente campioni: un flacone (10 ml) di diluente campioni contenente siero di
cavallo, con Proclin 300 allo 0.01% come conservante. Pronto per l’uso.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 3/32

CONJ│HRP
SUBS│TMB
SOLN│STOP
BUF│WASH│10X
Coniugato HRP-Streptavidina: un flacone (13 ml) di coniugato Streptavidina-
Perossidasi in un tampone colorato di rosso, a pH 5.5, addizionato di 0.001%
Proclin 300 come conservante. Pronto per l’uso.
Substrato HS: un flacone (13 ml) di una miscela stabilizzata di TMB (3,3' 5,5'
Tetrametilbenzidina) e H2O2 (Perossido di Idrogeno). Pronto per l’uso.
Soluzione Bloccante: un flacone (13 ml) di acido solforico 0.3 M. Pronto per
l’uso.
Soluzione di Lavaggio conc. 10X: un flacone (100 ml) di soluzione di lavaggio,
concentrata 10X addizionata di Amphoteric. B 2.5 μg/ml. Preparare la soluzione di
lavoro miscelando il contenuto del flacone con 900 ml di acqua distillata.
5.0 CONSERVAZIONE E STABILITÁ DOPO PRIMA APERTURA
Durante il trasporto e lo stoccaggio conservare tutti i componenti del kit a 2…8°C, in accordo con le
etichette del kit e i documenti di trasporto.
La data di scadenza è stampata sull’etichetta esterna.
Tutti i reagenti del kit sono stabili, dopo la prima apertura del kit, fino alla data di scadenza riportata
sull’etichetta, se propriamente conservati a 2…8°C, o per 2 settimane a temperatura ambiente
(18…25°C).
6.0 MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
Avvertenza: l’utilizzatore deve controllare la conformità con i requisiti del dosaggio di tutti i materiali e
dei dispositivi che sono utilizzati in combinazione con il kit. Inoltre, si raccomanda di controllare
periodicamente l’efficienza dei dispositivi, in accordo con le GLP e le Standard Operating Procedures
(SOP).
• pipette di precisione da 25 e 100 µl
• lavatore automatico per micropiastre
• acqua distillata di alta qualità
• lettore per micropiastre che permetta letture a 450 nm, 405 nm e 620 nm (come filtro di
riferimento).
7.0 AVVERTENZE E PRECAUZIONI
7.1 NORME DI SICUREZZA
• Tutti i reagenti forniti in questo kit sono esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
• Si raccomanda l’utilizzo di questo kit solo da parte di personale con esperienza di laboratorio, in
accordo con queste IFU e con le GLP.
• Gli operatori devono indossare guanti e indumenti protettivi quando utilizzano sieri di pazienti e
prodotti a base di siero.
• Tutti i componenti di origine umana forniti nel kit sono stati ottenuti da donatori testati
individualmente con metodi affidabili e sono risultati negativi per gli Anticorpi del Virus Umano
dell’Immunodeficienza (HIV-Ab), per gli Antigeni di superficie dell’ Epatite B (HBsAg) e per gli
Anticorpi dell’Epatite C (HCV-Ab). Tuttavia, nessun metodo può offrire completa garanzia
sull’assenza del Virus dell’Epatite B (HBV), dell’Immunodeficienza Umana (HIV) e dell’Epatite C
(HCV) o di altri agenti infettivi. Tali reagenti, quindi, dovrebbero essere considerati
potenzialmente infetti. Si raccomanda di usare le stesse precauzioni che vengono adottate per la
manipolazione dei campioni ignoti, in accordo con le procedure definite da appropriate linee
guida o regolamentazioni nazionali, laddove esistono.
• I calibratori contengono siero equino. Tale siero è stato ottenuto da animali sani ma, dal
momento che nessun metodo può fornire la completa garanzia sull’assenza di agenti infettivi, si
raccomanda di maneggiare con cautela i prodotti a base di siero.
• I reagenti del kit contengono agenti antimicrobici e il Substrato HS contiene tetrametilbenzidina.
Evitare il contatto con pelle e occhi. Sciacquare abbondantemente con acqua in caso di contatto.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 4/32

• La Soluzione bloccante contiene acido solforico 0.3 M. Evitare il contatto con pelle e occhi. In
caso di contatto sciacquare subito e abbondantemente con acqua.
• Non pipettare con la bocca.
• Non fumare, non mangiare o applicare cosmetici nelle aree dove campioni e reagenti vengono
maneggiati.
• Evitare la contaminazione da microrganismi durante la dispensazione utilizzando puntali
monouso.
• Qualsiasi liquido venuto in contatto con materiali potenzialmente infettivi deve essere eliminato in
un contenitore con un disinfettante. Lo smaltimento deve avvenire in accordo con la legislazione
in vigore.
7.2 PRECAUZIONI TECNICHE
1. Utilizzo corretto dei reagenti e dispensazione.
• Il kit deve essere impiegato esclusivamente per l’uso previsto.
• Non utilizzare i reagenti oltre la data di scadenza.
• Non utilizzare le strip o gli altri reagenti se la confezione è danneggiata o i liquidi sono fuoriusciti.
• Nell’assemblaggio della micropiastra per il dosaggio possono essere usate strip provenienti da
differenti micropiastre, ma queste devono appartenere allo stesso lotto e devono essere state
sottoposte alle stesse condizioni di conservazione.
• La soluzione unica di TMB/H2O2 è incolore o leggermente blu. Con il passare del tempo il
substrato può diventare giallo-arancione ma ciò non altera le proprietà della soluzione.
In caso di contaminazione accidentale la soluzione inizia a sviluppare una colorazione blu e deve
necessariamente essere scartata.
La soluzione unica TMB/H2O2 non è fotolabile. La luce solare diretta può però ossidare
comunque la soluzione rendendola blu. Tale colore scompare dopo 4 ore di conservazione al
buio; dopo tale periodo la soluzione può essere utilizzata.
• Usare esclusivamente puntali monouso.
• Prestare attenzione che non ci sia contaminazione fra i pozzetti. Mantenere tutte le pipette e il
materiale usato per il coniugato completamente separato dal Substrato HS.
• Prima di dispensare il Coniugato o il Substrato HS prelevare un’aliquota per il numero necessario
di pozzetti, al fine di evitare il ripetuto inserimento delle pipette nei flaconi dei reagenti. Non
riversare i reagenti non utilizzati all’interno dei loro flaconi.
2. Conformità alla procedura e alle specifiche
• I valori ottenuti devono essere sempre confrontati con quelli riportati nel certificato di Controllo di
Qualità. Non usare il kit per la determinazione di valori al di fuori dell’intervallo indicato nelle
istruzioni per l’uso.
• Il protocollo di dosaggio deve essere seguito dettagliatamente. Osservare i tempi e la
temperatura di incubazione, nonché la procedura di lavaggio: questi sono passaggi critici.
• Includere il controllo positivo e quello negativo in ogni test per controllare la stabilità dei reagenti
e le caratteristiche del dosaggio. Leggere anche la sezione 10.5 - Controllo di Qualità.
8.0 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
• Per il dosaggio possono essere utilizzati sia siero che plasma. EDTA, eparina e sodio citrato
possono essere utilizzati come anti-coagulanti. Tuttavia, l’impiego di eparina dovrebbe essere
evitato nel caso in cui i medesimi campioni debbano essere testati, non solo per IgE totali, ma
anche per IgE specifiche, in quanto questo anticoagulante potrebbe determinare una sottostima
dei valori di IgE specifiche.
• I campioni di sangue intero devono essere separati in globuli rossi e plasma o siero il più presto
possibile dopo il prelievo per evitare l’emolisi. Si raccomanda, inoltre, di rimuovere i coaguli.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 5/32

• I campioni dei pazienti devono essere ottenuti tramite prelievo utilizzando le apposite provette o
una siringa sterile. Osservare le usuali precauzioni per il prelievo. Se si utilizza una siringa,
trasferire immediatamente il sangue nell’apposita provetta (tappo rosso piatto o separatore di
siero).
• Campioni di siero e plasma possono essere conservati per tutta la notte a 2...8°C; per periodi di
conservazione più lunghi congelare i campioni a -20°C.
• Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
9.0 PROCEDURA DEL TEST
Sia il metodo manuale che quello automatico, con strumenti Adaltis e Radim, necessitano dei seguenti
passaggi:
9.1 PREPARAZIONE DEI REAGENTI
• Lasciare che i reagenti e la micropiastra raggiungano la temperatura ambiente prima dell’uso.
• Riporre le strip non utilizzate nella confezione trasparente, con l’essiccante, richiudere
opportunamente e conservare a 2…8°C.
• Preparare la soluzione di lavaggio.
9.2 PROCEDURA DI ESECUZIONE DEL TEST
1. Preparare lo schema del dosaggio riservando i primi pozzetti per la curva di calibrazione.
2. Pipettare 150 µl di tampone di incubazione in tutti i pozzetti.
3. Pipettare 25 µl di calibratori e campioni nei pozzetti designati.
4. Agitare dolcemente la micropiastra per 10 secondi evitando di far fuoriuscire il contenuto dai
pozzetti.
5. Incubare a 37°C per 60 min. senza coprire la micropiastra.
6. Lavare 3 volte come descritto nella sezione 9.3 Note Procedurali.
7. Dispensare 100 µl di coniugato anti-IgE-Biotina nei pozzetti.
8. Incubare a 37°C per 30 min. senza coprire la micropiastra.
9. Lavare 3 volte come descritto nella sezione 9.3 Note Procedurali.
10. Dispensare 100 µl di coniugato HRP-Streptavidina nei pozzetti.
11. Incubare a 37°C per 30 min. senza coprire la micropiastra.
12. Lavare 3 volte come descritto nella sezione 9.3 Note Procedurali.
13. Dispensare 100 µl di Substrato HS nei pozzetti.
14. Incubare 15 min. a temperature ambiente.
15. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante nella stessa sequenza e frequenza adottate per
dispensare il Substrato e leggere a 450 e 405 nm con il filtro di riferimento selezionato a 620 nm.
Leggere i valori entro 60 min.
9.3 NOTE PROCEDURALI
• PROCEDURA DI LAVAGGIO. Si raccomanda l’utilizzo di un lavatore automatico per
micropiastre. Dopo il lavaggio sbattere delicatamente la micropiastra capovolta sulla carta
assorbente, per rimuovere qualsiasi residuo di liquido, nel caso in cui il lavatore non aspiri
completamente la soluzione di lavaggio. Una volta che il lavaggio è stato correttamente
programmato sugli strumenti Adaltis e Radim, questo passaggio non è necessario. Effettuare
almeno 3 lavaggi.
• TEMPERATURA DI INCUBAZIONE. La temperatura di incubazione per tutte le reazioni
immunologiche deve essere mantenuta costante a 37°C ± 1°C.
• DISPENSAZIONE DELLA SOLUZIONE DI SUBSTRATO HS
Per ottenere risultati precisi ed accurati è necessario dispensare il Substrato HS immediatamente
dopo il lavaggio.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 6/32

Si raccomanda di fare attenzione alla frequenza con cui si addizionano il Substrato HS e la
soluzione bloccante, fino a quando non sia stata acquisita una buona familiarità con il metodo
(per es. se il Substrato HS è dispensato nei pozzetti ogni 3 secondi uno dall’altro, anche la
Soluzione Bloccante deve essere dispensata nello stesso ordine e con la stessa frequenza).
L’utilizzo di pipette ripetitive è particolarmente indicato.
Evitare la contaminazione delle soluzioni. Non è necessaria l’incubazione al buio. Evitare
comunque la diretta esposizione alla luce solare.
10.0 CALCOLO DEI RISULTATI
10.1 CONVERSIONE DELLE OD
La densità ottica del calibratore a 500 KIU/L può essere superiore a 2.0 e quella del calibratore a 1000
KIU/L può risultare intorno a 3.0. Se il lettore è in grado di leggere OD superiori a 3.0, allora è sufficiente
la lettura a 450 nm (lunghezza d’onda del picco) e a 620 nm (filtro di riferimento per la sottrazione delle
interferenze della plastica). Se si utilizzano lettori non in grado di leggere valori superiori a 3.0, allora
l’utilizzatore può scegliere fra 2 opzioni:
1. omettere dal dosaggio il calibratore a 1000 KIU/L
2. includere il calibratore a 1000KIU/L ed effettuare una lettura anche a 405 nm (lunghezza alla
quale si trova la spalla del picco), sottraendo sempre eventuali interferenze della plastica lette a
620 nm. Identificare i pozzetti che, letti a 450 nm, presentano OD superiori a 2.0 sia tra i
campioni che tra i calibratori. Selezionare le corrispondenti OD lette a 405 nm e moltiplicare per
un fattore 3 (dove OD 450/OD 405= 3.0)
Nota bene: il fattore 3.0 è solamente suggerito OD450 nm = OD405 nm x 3.0
Per una maggiore accuratezza gli utilizzatori devono calcolare il fattore di conversione sul proprio lettore.
Gli strumenti Adaltis e Radim sono già programmati per la lettura alle 3 lunghezze d’onda, con il fattore
appropriato.
10.2 ELABORAZIONE DEI DATI – METODO MANUALE
Calcolare, come precedentemente descritto, la media delle densità ottiche a 450 nm di calibratori e
campioni. Tracciare una curva di calibrazione facendo corrispondere la media delle OD con la rispettiva
concentrazione di IgE (usare una scala lineare o logaritmica). Determinare la concentrazione delle IgE
totali del campione interpolando le OD dei campioni (a 450 nm) sulla curva di calibrazione.
10.3 ELABORAZIONE DEI DATI – METODO AUTOMATICO
Nel caso di utilizzo della metodica in automazione, per l’elaborazione dei dati fare riferimento alla
procedura applicativa relativa a ciascuno strumento.
10.4 VALIDITÁ DEL DOSAGGIO
Affinché il dosaggio sia valido devono essere soddisfatti i seguenti requisiti:
- le OD dei calibratori A ed F devono cadere entro intervalli accettabili, riportati nei Certificati di
Analisi per ogni partita di lotti.
- Per ogni singolo calibratore il rapporto fra la concentrazione calcolata e la concentrazione
nominale deve cadere entro i limiti di accettabilità riportati nel Certificato di Analisi relativo a
ciascun lotto di Set di calibrazione.
- I risultati ottenuti per i sieri di controllo qualità devono rientrare entro i range di accettabilità: si
prega di leggere anche la sezione 10.5 CONTROLLO DI QUALITÀ.
10.5 CONTROLLO DI QUALITA’
I risultati del controllo di qualità per il lotto del kit sono riportati nel Certificato di Analisi incluso nella
confezione. Per il controllo di qualità interno si raccomanda di usare sieri di controllo a concentrazione
nota che permettano di verificare il corretto funzionamento del prodotto.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 7/32

10.6 ELABORAZIONE PER CAMPIONI OLTRE 1000 KIU/L
Se i campioni presentano OD uguali o più alte di quelle del calibratore a 1000 KIU/L, si raccomanda di
ripetere il dosaggio diluendoli 1:5 o 1:10 con il Diluente Campioni. Calcolare, quindi, la giusta
concentrazione moltiplicando i risultati ottenuti per 5 o per 10, in accordo con il rapporto di diluizione.
Per ottenere una maggiore accuratezza è, inoltre, suggerita una diluizione 1:5 o 1:10 anche per i
campioni compresi tra 500 KIU/L e 1000 KIU/L.
11.0 VALORI ATTESI
La gamma dei valori delle IgE è estremamente ampia per gli individui affetti e non affetti da patologie
allergiche, dipendendo anche dal tipo di popolazione, per es. dall’area geografica, dal sesso e dall’età.
Ne consegue che c’è una forte sovrapposizione di valori di IgE totali fra popolazioni atopiche e non
atopiche ed è molto difficile definire un “limite di normalità” superiore. Si raccomanda che ogni
laboratorio stabilisca i propri intervalli di riferimento per la popolazione di interesse. La letteratura
disponibile fornisce le seguenti informazioni relativamente alle concentrazioni delle IgE totali nel siero
umano:
Media: 27.6 KIU/L
Età (anni) KIU/L
0 – 3

13.0 CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO
13.1 PRECISIONE
Precisione (metodo manuale)
Campione Livello 1 Livello 2 Livello 3
sedute 20 20 20
replic./seduta 4 4 4
totale replic. 80 80 80
CV % intra-saggio 9.5 6.6 4.7
CV % inter-saggio 10.6 5.5 4.9
CV % complessivo 14.2 8.6 6.8
conc. media (KIU/I) 356.5 147.4 90.5
13.2 SENSIBILITA’
Il limite di rilevabilità del test, definito come la concentrazione di IgE equivalente all’assorbanza media di
20 replicati del calibratore 0 + 3 deviazioni standard, è 3.9 KIU/L
13.3 ACCURATEZZA
Test di diluizione
I test di diluizione hanno fornito come CV% di inter-diluizione un intervallo compreso fra 3 e 19%.
Test di recupero
Due campioni sono stati addizionati con concentrazioni note di IgE umane e testati nuovamente. I
risultati sono riportati nella seguente tabella:
Campione Aggiunto
(KIU/L)
1
2
Atteso
(KIU/L)
Trovato
(KIU/L)
Recupero %
(Trovato/Atteso x
100)
0,00 7,41
111,11 117,70 105,79 90%
200,00 205,93 198,70 96%
333,33 338,27 339,86 100%
500,00 503,71 498,70 99%
666.66 669,14 640,12 96%
media 96%
0,00 8,04
111,11 118,26 108,73 92%
200,00 206,43 197,49 96%
333,33 338,69 305,61 90%
500,00 504,02 438,84 87%
666.66 669,35 665,65 99%
media 93%
Correlazione con altri metodi
I dati ottenuti con questo test sui campioni di siero sono stati confrontati con il metodo Pharmacia UNI
CAP® System.
La regressione lineare ha dato i seguenti risultati:
n = 98 y= 0.9489x + 27.56 r 2
= 0.87
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 9/32

14.0 AUTOMAZIONE
Questo test per IgE Totali può essere completamente automatizzato con analizzatori per micropiastra
Adaltis e Radim (provvisti di un software specifico per l’allergia).
Per un uso corretto e per ulteriori informazioni si raccomanda di consultare il manuale delle istruzioni
relativo a ciascun strumento.
15.0 SUGGERIMENTI PER LA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
L’osservanza della procedura e delle specifiche, così come il corretto uso dei reagenti e l’appropriata
dispensazione, possono aiutare ad evitare i seguenti tipi di errori:
ERRORE CAUSE POSSIBILI / SUGGERIMENTI
OD molto diverse (±50%)
da quelle riportate nel QC
- errato volume di dispensazione dei reagenti (suggerimento: controllare la corrispondenza fra il
volume impostato nella pipetta e quello richiesto dal dosaggio; tarare nuovamente le pipette)
- errata temperatura o errato tempo d’incubazione (suggerimento: manutenzione più scrupolosa
dell’incubatore, annotare l’inizio dell’incubazione)
- errore nell’esecuzione dei lavaggi e della lettura spettrofotometrica (suggerimento: controllare il
funzionamento o le impostazioni dei rispettivi strumenti)
- contaminazione del Substrato HS (suggerimento: usare contenitori di plastica monouso puliti)
Risultati poco riproducibili - errato volume di dispensazione dei reagenti (suggerimento: controllare la corrispondenza fra il
volume impostato nella pipetta e quello richiesto dal dosaggio; tarare nuovamente le pipette)
- errata temperatura o errato tempo d’incubazione (suggerimento: manutenzione più scrupolosa
dell’incubatore)
- errore nell’esecuzione dei lavaggi e della lettura spettrofotometrica (suggerimento: controllare il
funzionamento o le impostazioni dei rispettivi strumenti)
- contaminazione del Substrato HS (suggerimento: usare contenitori di plastica monouso puliti)
- inquinamento o degradazione dei reagenti (suggerimento: utilizzare puntali, contenitori per il
travaso dei reagenti monouso adatti e acqua distillata o equivalente)
Nessuna reazione
colorimetrica dopo
l’aggiunta del Substrato
Reazione troppo blanda
(OD troppo basse)
Reazione troppo intensa
(OD troppo alte)
Valori inspiegabilmente
fuori-scala
CV% intra-saggio
troppo elevato
CV% inter-saggio
troppo elevato
16.0 LEGENDA SIMBOLI: VEDI PAG. 27
- mancata dispensazione di un reagente
- forte contaminazione del coniugato (anti-IgE-Biotina o HRP-Streptavidina) o del substrato
- errori nell’esecuzione della procedura di dosaggio (es. dispensazione accidentale dei reagenti
in sequenza errata o provenienti da flaconi sbagliati, ecc.)
- coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo breve, temperatura di incubazione troppo bassa
- coniugato non idoneo (anti-IgE-Biotina o HRP-Streptavidina) (es. non proveniente dal kit
originale)
- accidentale contaminazione/degradazione del coniugato (anti-IgE-Biotina o HRP-Streptavidina)
- tempo di incubazione troppo lungo, temperatura di incubazione troppo alta
- qualità scadente dell’acqua usata per la soluzione di lavaggio (basso grado di deionizzazione)
- lavaggi insufficienti (Coniugato non completamente rimosso)
- contaminazione di pipette, puntali o contenitori
- lavaggi insufficienti (Coniugato non completamente rimosso)
- reagenti e/o strip non portate a temperature ambiente prima dell’uso
- il lavatore per micropiastre non lava correttamente (suggerimento: pulire la testa del lavatore)
- condizioni di incubazione non costanti (tempo o temperatura)
- controlli e campioni non dispensati allo stesso tempo (con gli stessi intervalli) (controllare la
sequenza di dispensazione)
- variabilità intrinseca degli operatori
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 10/32

ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF TOTAL IgE IN HUMAN
SERUM AND PLASMA
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
1.0 INTENDED USE
The ALLERGEN Total IgE is an enzyme immunoassay kit for the quantitative determination of total
Immunoglobulins of type E (IgE) in human serum or plasma. It is strictly for in vitro diagnostic use only
and the obtained results should be used in conjunction with other data available to the physician.
2.0 SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
The Immunoglobulins belonging to E class (IgE) contain 2 types of polypeptide chains, have a molecular
weight of approximatively 200.000 (1) and bind to surface of mast cells and basophilic granulocytes. The
binding of allergens to cell-bound IgE causes these cells to release histamine and other vasoactive
substances, thereby initiating the events recognized as allergic reactions (1,2,3). Most patients with
atopic allergic diseases, such as atopic asthma, atopic dermatitis and hay fever have been shown to
exhibit an increase of total IgE levels in blood (4,5,6). Non-allergic individuals have IgE concentrations
that vary widely, and during childhood they normally show increase, reaching adult levels in the second
decade of life (7,8). Measurement of total IgE concentration may be of value in the early detection of
allergy in infants, and as a means for predicting future atopic manifestations (9,10,11). Significant
elevation may be found not only in allergic patients, but also in cases of IgE myeloma, pulmonary
aspergillosis, and during the active stage of parasitic infestations (12,13). Increased levels of IgE are
found in cases of hypergammaglobulinemia, autoimmune diseases, ulcerative colitis, hepatitis, cancer
and malaria (14).
3.0 PRINCIPLE OF THE TEST
The ALLERGEN total IgE is based on the enzyme immunoassay, sandwich principle. The testing sample
is added to the monoclonal anti-human-IgE antibodies coated onto the wells of the microstrips. During
the first incubation the solid phase anti-IgE captures the sample IgE. The addition and subsequent
incubation with an Anti-IgE-Biotin conjugate lead to the formation of the sandwich: solid phase-Anti-IgE :
IgE : Anti-IgE-Biotin. The further incubations with the Streptavidin-Peroxidase conjugate and then with
the substrate chromogen, respectively, lead to a blue color development. The enzymatic reaction is then
blocked with a stop solution which turns yellow the blocked solution. The resulting colour is read
photometrically at 450 nm. The concentration of sample IgE is directly related to the colour intensity.
4.0 KIT COMPONENTS
MT PLATE
CONJ│BIOT
CAL│A…F
BUF│INC
DIL│SPE
CONJ│HRP
Reagents
Microplate sensitized with anti-IgE: one bag containing 12 strips x 8 wells,
coated with monoclonal (mouse) anti-human IgE. Store the unused strips at
2…8°C in the plastic zip pouch with the desiccant.
Anti-IgE-Biotin Conjugate: one vial (13 ml) of anti-IgE-Biotin conjugate in TRIS
buffer, pH 8.1, preservatives and stabilizers. Ready to use.
Calibrators for Total IgE: 6 Vials, 0.5 ml each. The vials contain human IgE in
horse serum with 0.01% of Proclin 300 as preservative. The IgE concentrations
are: 0 - 10 - 50 - 250 - 500 - 1000 KIU/L. (WHO 2 nd IRP 75/502). Ready to use.
Incubation Buffer: one vial (18 ml) containing TRIS buffer, pH 8.4, with 0.1% of
Tween 20 and 0.005% of Proclin 300 as preservative. Ready to use.
Sample Diluent: one vial (10 ml) of sample diluent consisting of horse serum, with
0.01% of Proclin 300 as preservative. Ready to use.
HRP-Streptavidin Conjugate: one vial (13 ml) of Streptavidin-Peroxidase
conjugate in a red colored buffer, pH 5.5 supplemented with 0.001% Proclin 300.
Ready to use.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 11/32

SUBS│TMB
SOLN│STOP
BUF│WASH│10X
Substrate HS: one vial (13 ml) of a stabilized mixture of TMB (3,3' 5,5'
Tetramethylbenzidine) and H2O2 (Hydrogen Peroxide). Ready to use.
Stop Solution: one vial (13 ml) of 0.3 M sulphuric acid. Ready to use.
Wash Buffer 10X: one vial (100 ml) of a washing solution, concentrated 10X, with
Amphoteric.B 2.5 µg/ml. Prepare the working solution by mixing the content of the
vial with 900 ml of distilled water.
5.0 STORAGE AND STABILITY AFTER INITIAL OPENING
During the shipment and in final storage, store all the components of the kit at 2...8°C, according to kit
labels and shipping documents.
The expiry date is printed on the external label.
All the reagents of the kit are stable, after the first opening, up to the expiration date reported on the label
when properly stored at 2…8°C and for 2 weeks at room temperature (18…25°C).
6.0 MATERIAL AND EQUIPMENT REQUIRED BUT NON PROVIDED
Warning: the user should check the compliance with assay requirements of all the materials and
equipments which are used in conjunction with the kit. Additionally, the efficiency of equipments should
be periodically controlled, according to GLP and to Standard Operating Procedures (SOP).
• 25 and 100 µl micropipettes
• automatic plate washer
• high quality distilled water
• microtiter plate reader equipped for the measurement of the absorbance at 450 and 405 nm
(reference filter at 620 nm), adsorbent pad or paper.
7.0 WARNING AND PRECAUTIONS
7.1 SAFETY PRECAUTIONS
• All the reagents in this kit are for in vitro diagnostic use only.
• It is recommended that only experienced laboratory personnel should use this test, and handle it
in accordance with these IFUs and the GLPs.
• Operators must wear gloves and protective clothing when using patient sera or serum-based
products.
• The human blood products supplied as components of this kit have been obtained from donors
who were tested individually and found to be negative for the presence of Human
Immunodeficiency Virus Antibodies (HIV-Ab) as well as for Hepatitis B surface Antigen (HBsAg)
and Hepatitis C antibodies (HCV-Ab) using reliable methods. Since no test method can offer
complete assurance that Hepatitis B Virus (HBV), Human Immunodeficiency Virus (HIV) and
Hepatitis C Virus (HCV) or other infectious agents are absent, all human blood products should
be considered potentially infectious. Handling should be in accordance with the procedures
defined by an appropriate national biohazard safety guide-line or regulation, where it exists, (i.e.
USA Center for Disease Control/National Institutes of Health Manual “Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories”, 1984).
• Calibrators contain equine serum; this serum has been obtained from safe animals but, because
no test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, it is
recommended that serum-containing products be handled with precautions.
• Reagents of this kit contain antimicrobial agents and the TMB Substrate solution contains
tetramethylbenzidine. Avoid contact with the skin and eyes. Rinse immediately with plenty of
water if any contact occurs.
• The Stop Solution contains 0.3M sulphuric acid. Avoid contact with skin and eyes. Rinse
immediately with plenty of water if contact occurs.
• Do not pipette by mouth.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 12/32

• Do not smoke, eat or apply cosmetics in areas in which specimens or kit reagents are handled.
• Avoid microbial contamination of reagents during pipetting by using disposable pipette tips.
• Any liquid that has been brought into contact with potentially infectious material has to be
discarded in a container with a disinfectant. Disposal must be performed in accordance with local
legislation.
7.2 TECHNICAL PRECAUTIONS
1. Correct use of reagents and proper pipetting
• The kit has to be strictly employed for the intended use.
• Do not use reagents beyond their expiration dates. Strips and solution should not be used if the
foil bag is damaged or liquids have leaked.
• The TMB/H2O2 single solution is colourless or very slightly blue. On ageing the substrate
becomes slightly yellow-orange but this does NOT affect its performances. If accidental
contamination occurs, the solution starts to develop a blue colour and must therefore be
discarded.
The TMB/H2O2 single solution is not sensitive to light. Direct sunlight can however oxidize the
solution to a blue colour. Such a colour disappears after 4 hours storage in the dark after which
the solution can again be used.
• Use only disposable tips.
• Ensure that no cross-contamination occurs between wells. Keep all pipettes and any other
equipment used for conjugate completely separate from the Substrate HS reagent.
• When pipetting Conjugate or Substrate HS, aliquot for the required numbers of wells should be
taken to avoid multiple entry of pipette tips into the reagent bottles. Never pour unused reagents
back into the original bottles.
2. Adherence to assay procedure and specifications
• The obtained values have to be always compared to the ones reported in QC sheet. Do not use
the kit to determine values outside the range indicated in the IFU.
• The test protocol must be followed strictly. Observe the indicated incubation times and
temperature and the washing procedure, these are critical steps.
• Include the positive and negative controls in every test run to monitor for reagent stability and
correct assay performance. Please refer also to section 10.5 Quality Control.
8.0 SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
• Either serum or plasma can be used with this diagnostic kit. EDTA, heparin and Sodium Citrate
are suitable as anti-coagulants. However, samples to be tested not only for Total IgE but also for
Specific IgE should not contain heparin since this anticoagulant may lead to underestimation of
Specific IgE values.
• Whole blood specimens should be separated from red blood cells and plasma or serum as soon
as possible in order to avoid haemolysis. Also clots must be removed.
• Patient samples should be obtained by non-traumatic venipuncture using a vacuum tube or
sterile syringe. The usual precautions in the collection of venipuncture samples should be
observed. If a syringe is used, the blood should be transferred immediately to a vacuum tube
(plain redtop or serum separator).
• Serum and plasma samples can be stored overnight at 2...8°C. For long-term storage, they
should be frozen below -20°C.
• Avoid repetitive freezing and thawing.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 13/32

9.0 ASSAY PROCEDURE
The following steps are required by both the manual and the automated assay procedure on Adaltis and
Radim instruments.
9.1 REAGENTS PREPARATION
• Allow all reagents and the microplate to reach room temperature before use.
• Place the exceeding strips and the desiccant into the transparent zip pouch, seal it properly and
store at 2…8°C.
• Prepare the working wash solution.
9.2 PIPETTING AND INCUBATION STEPS
1. Prepare the assay map reserving the first wells for the calibration curve.
2. Pipette 150 µl of incubation buffer in all the wells.
3. Pipette 25 µl of calibrators and samples into the appointed wells.
4. Shake gently the microplate for 10 sec. being careful not to let the content come out from the
wells.
5. Incubate at 37°C for 60 min., without covering the plate.
6. Wash 3 times (see Section 9.3 Procedural Notes).
7. Dispense 100 µl of anti-IgE-Biotin into all the wells.
8. Incubate at 37°C for 30 min. without covering the plate.
9. Wash 3 times (see Section 9.3 Procedural Notes).
10. Dispense 100 µl of HRP-Streptavidin Conjugate into all the wells.
11. Incubate at 37°C for 30 min. without covering the plate.
12. Wash 3 times (see Section 9.3 Procedural Notes).
13. Dispense 100 µl of Substrate HS into all the wells.
14. Incubate 15 min. at room temperature.
15. Add 100 µl of Stop Solution in the same sequence and timing adopted to dispense the substrate
and read at 450 nm with reference filter set at 620 nm. Read the plate within 60 min.
9.3 PROCEDURAL NOTES
• WASHING PROCEDURE. The use of an automatic plate wash equipment is recommended. After
the washing, tap the inverted plate on absorbent paper to remove any residual from the wells, if
the washer does not aspirate completely the wash solution. On Adaltis and Radim instruments,
once the washing has been correctly programmed, this step is not necessary. Three washings
are required.
• INCUBATION TEMPERATURE. The incubation temperature for all the immunological reaction
must be kept constant at 37°C ± 1°C .
• DISPENSATION OF THE SUBSTRATE HS SOLUTION
In order to obtain precise and accurate results it is necessary to dispense the Substrate HS
immediately after the washing.
It is recommended to time the addition of the Substrate HS and Stop Solution until a good
familiarity with the method is acquired (i.e. if the Substrate HS solution is dispensed into the wells
every 3 seconds one from the other, also the Stop Solution should be dispensed in the same
order and with the same frequency).
The use of repetitive pipettes is particularly convenient.
The contamination of solutions should be avoided. Incubation in the dark is not necessary.
However, avoid a direct exposure to sunlight.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 14/32

10.0 CALCULATIONS OF RESULTS
10.1 OPTICAL DENSITY CONVERSION
The optical density (OD) of the calibrators at 500 KIU/L may result higher than 2.0 and the one at 1000
KIU/L around 3.0. If the reader can read ODs up to 3.0, then the reading at 450 nm (wavelength of the
peak) and at 620 nm (reference filter for the subtraction of interference of the plastic) is sufficient.
Should the reader not be able to read up to 3.0, then the user has two choices:
1. omitting to run the calibrator at 1000 KIU/L
2. running also the calibrator at 1000 KIU/L and then reading, in addition at 450 nm, also at 405 nm
(in the peak shoulder) always against the subtraction filter at 620 nm. Identify the wells with OD
higher than 2.0 at 450 nm both for calibrators and samples, record the corresponding OD at 405
nm and multiply these ODs by the conversion factor 3.0, since:
OD450 nm = OD405 nm X 3.0
Warning: the conversion factor 3.0 is suggested only. For better accuracy, users are advised to calculate
the conversion factor specific for their own reader.
Adaltis and Radim instruments are already programmed for reading the 3 wavelengths with the
appropriate factor.
10.2 DATA REDUCTION – MANUAL METHOD
Calculate, as previously described, the mean OD at 450 nm of calibrators and samples. Plot the mean
ODs of calibrators versus the respective IgE concentration (use a linear or a semilogarithmic scale).
Determine the total IgE concentration of the sample by interpolation of the sample ODs (at 450 nm) on
the calibration curve.
10.3 DATA REDUCTION – AUTOMATIC METHOD
In the case that an automatic method is used, please refer to the application procedure relative to the
instrument to be used.
10.4 VALIDITY OF THE ASSAY
The following requirements must be met in order for the assay to be valid:
- The ODs of calibrators A and F must fall within acceptable intervals that are shown on the
Analysis Certificates for each consignment of lots.
- The ratio between calculated concentration and nominal concentration for every single calibrator
must fall within the acceptability limits shown on the Analysis Certificate of each Calibration Set
lot.
- The results obtained for the quality control serums must fall within the acceptability ranges:
please also read section 10.5 QUALITY CONTROL.
10.5 QUALITY CONTROL
Quality control data is supplied on the lot-specific QC certificate included in the kit.
For internal quality control it is recommended to use of control sera at known concentration that allow to
monitor for eventual session failure.
10.6 DATA REDUCTION FOR SAMPLES HIGHER THAN 1000 KIU/L
Samples with ODs equal or higher than those of the calibrator at 1000 KIU/L should be retested by
diluting them 1:5 or 1:10 with the sample diluent. Then calculate the right concentration by multiplying
the obtained result by 5 or 10, according to the dilution ratio.
In order to get a better accuracy, the user is advised to dilute 1:5 or 1:10 also samples from 500 KIU/L
to 1000 KIU/L.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 15/32

11.0 EXPECTED VALUES
The spread of IgE values is extremely wide both for subjects with and without allergic disease,
depending also on the type of population, i.e. geographical area, sex and age. Therefore there is a
strong overlapping of total IgE levels between atopic and not atopic populations and it is very difficult to
define an upper “limit of normal”. It is recommended that each laboratory establishes its own reference
range for the population of interest. The available literature provides the following information relative to
total IgE concentrations in human serum.
Mean: 27.6 KIU/L
Age (years) KIU/L
0 – 3

13.2 SENSITIVITY
The sensitivity limit of the assay, defined as the concentration of IgE equivalent to the mean absorbance
of 20 replicates of the zero calibrator + 3 standard deviations, is typically 3.9 KIU/L.
13.3 ACCURACY
Dilution test
Dilution tests gave interdilutional CV% in the range 3-19%
Recovery
Two samples were spiked with known concentrations of human IgE and assayed. Results are reported in
the following table:
Sample Added
(KIU/L)
1
2
Expected
(KIU/L)
Found
(KIU/L)
Recovery %
(Found/Exp x
100)
0,00 7,41
111,11 117,70 105,79 90%
200,00 205,93 198,70 96%
333,33 338,27 339,86 100%
500,00 503,71 498,70 99%
666.66 669,14 640,12 96%
average 96%
0,00 8,04
111,11 118,26 108,73 92%
200,00 206,43 197,49 96%
333,33 338,69 305,61 90%
500,00 504,02 438,84 87%
666.66 669,35 665,65 99%
average 93%
Correlation with other methods
The data of the assay on serum samples obtained with this kit were compared with the Pharmacia CAP
UNI CAP®
The linear regression analysis gave the following results:
n = 98 y= 0.9489x + 27.56 r 2
= 0.87
14.0 AUTOMATION
This Total IgE assay can be fully automated on Adaltis and Radim microplate analyzers (provided with
an allergy-dedicated software):
Please refer to user’s manuals for further Instructions for Use about a correct use of the devices.
15.0 SUGGESTIONS FOR TROUBLESHOOTING
Adherence to assay procedure and specifications, as well as a correct use of reagents and proper
pipetting, may help to avoid the following kinds of errors.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 17/32

ERROR POSSIBLE CAUSES / SUGGESTIONS
OD very different (±50%)
from OD reported on QC
Low reproducible results
No colourimetric reaction
after addition of substrate
Too low reaction
(too low ODs)
Too high reaction
(too high ODs)
Unexplainable outliers
Too high within-run CV%
Too high between-run
CV%
16.0 SYMBOLS LEGEND: SEE PAGE 27
- incorrect dispensing volume of reagents (suggestion: check the correspondence between the
volume dispensed by the pipette and the one required by the assay; re-calibrate again
pipettes)
- incorrect temperature or incorrect incubation time (suggestion: more care in the incubator
maintenance; note down the beginning of the incubation)
- error in washing or in spectrophotometer reading (suggestion: check operating or settings of
respective instruments)
- contamination of Substrate HS (suggestion: use only disposable and clean plastic containers)
- incorrect dispensing volume of reagents (suggestion: check the correspondence between the
volume dispensed by the pipette and the one required by the assay; re-calibrate again
pipettes)
- incorrect temperature or incorrect incubation time (suggestion: more care in the incubator
maintenance)
- error in washing or in reading to spectrophotometer (suggestion: check operating or settings of
respective instruments)
- contamination of Substrate HS (suggestiono use only disposable and clean plastic containers)
- pollution or degradation of reagents (suggestion: use appropriate tips, disposable and clean
plastic containers for reagents and high quality distilled or equivalent water)
- no reagent pipetted
- strong contamination of conjugates (anti- IgE- Biotin or HRP-Streptavidin) or Substrate
- errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents in a wrong
sequence or from the wrong vial, etc.)
- incorrect conjugate (e.g. not from original kit)
- incubation time too short, incubation temperature too low
- incorrect conjugate (anti- IgE- Biotin or HRP- Streptavidin) (e.g. not from original kit)
- accidental contamination/degradation of conjugate (anti- IgE- Biotin or HRP-Streptavidin)
- accidentale contaminazione/degradazione del coniugato (anti-IgE-Biotin o HRP-Streptavidina)
- incubation time too long, incubation temperature too high
- water quality for wash buffer insufficient (low grade of deionization)
- insufficient washing (conjugates not properly removed)
- contamination of pipettes, tips or containers
- insufficient washing (conjugates not properly removed)
- reagents and/or strips not pre-warmed to Room Temp. prior to use
- plate washer is not washing correctly (suggestion: clean washer head)
- incubation conditions not constant (time, temperature)
- controls and samples not dispensed at the same time (with the same intervals) (check pipetting
order)
- person-related variation
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 18/32

ENZYMIMMUNOASSAY ZUM QUANTITATIVEN NACHWEIS VON TOTAL IgE IN HUMANEM SERUM
ODER PLASMA
NUR ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK
1.0 VERWENDUNG
Der Testsatz ALLERGEN Total IgE ist ein Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Total-
Immunglobulin E (IgE) in humanem Serum oder Plasma. Er dient ausschließlich der In-vitro-Diagnostik
und die Ergebnisse sollten nur in Verbindung mit anderen für den Arzt verfügbaren Daten interpretiert
werden.
2.0 PHYSIOLOGIE
Die IgE-Moleküle enthalten 2 Arten von Polypeptidketten, haben ein Molekulargewicht von ca. 200.000
Dalton (1) und binden an die Oberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten. Die nachfolgende
Bindung von Allergenen an das zellgebundene IgE veranlasst diese Zellen, Histamin und andere
vasoaktive Substanzen freizusetzen, und so die allergischen Reaktionen auszulösen (1,2,3). Bei den
meisten Patienten mit atopischen allergischen Erkrankungen wie z.B atopischem Asthma, atopischer
Dermatitis und Heuschnupfen werden erhöhte IgE-Konzentrationen im Blut nachgewiesen (4,5,6).
Nichtallergiker haben stark variierende IgE-Konzentrationen und während der Kindheit zeigt sich
normalerweise ein Anstieg; Erwachsenenwerte werden im 2. Lebensjahrzehnt erreicht (7,8). Die
Messung der Gesamt-IgE-Konzentration kann bei der Früherkennung einer Allergie bei Kindern von
Bedeutung sein und dient als Mittel für die Vorhersage einer zukünftigen atopischen Manifestation
(9,10,11). Eine signifikante Erhöhung kann nicht nur bei Allergikern gefunden werden, sondern auch in
Fällen von IgE-Myelom, Aspergillose der Lunge und während der aktiven Phase von Parasitenbefall
(12,13). Erhöhte IgE-Werte werden in Fällen von Hypergamma-globulinämie, Autoimmunerkrankungen,
Colitis ulcerosa, Hepatitis, Krebs und Malaria gefunden (14).
3.0 TESTPRINZIP
Der ALLERGEN Total IgE-Assay ist ein Immunoassay nach dem Sandwich-Prinzip. Die Patientenprobe
wird in die Wells, die mit einem monoklonalen Anti-IgE-Antikörper beschichtet sind, pipettiert. Während
der ersten Inkubation bindet dieser Antikörper das IgE der Probe. Nach Zugabe und anschließender
Inkubation mit einem Anti-IgE-Biotin-Konjugat bildet sich ein „sandwichartiger” Anti-IgE:IgE:Anti-IgE-
Biotin-Komplex. Die weiteren Inkuba-tionsschritte mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat und dem
Substrat führen zur einer Entwicklung einer Blaufärbung. Die enzymatische Reaktion wird dann mit einer
Stopplösung blockiert und es entsteht eine Gelbfärbung. Die entstandene Farbe wird photometrisch bei
450 nm gemessen. Die Farbintensität ist direkt proportional zur IgE-Konzentration in der Probe.
4.0 KITKOMPONENTEN
MT PLATE
CONJ│BIOT
CAL│A…F
BUF│INC
Reagenzien
IgE-MIKROTITERPLATTE: Die Packung enthält eine Mikrotiterplatte mit 12
Streifen x 8 Wells. Jedes Well ist mit monoklonalem anti-Human IgE (Maus)
beschichtet. Lagern Sie die unbenutzten Streifen zusammen mit dem
Trockenmittel bei 2-8°C in dem verschließbaren Plastikbeutel.
ANTI-IgE-BIOTIN-KONJUGAT: Das Fläschchen enthält 13 ml Anti-IgE-Biotin-
Konjugat in Tris-Puffer, pH 8,1, mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel.
Gebrauchsfertig.
Total IgE KALIBRATOREN: 6 Fläschchen (je 0,5 ml) mit humanem IgE in den
Konzentrationen 0 - 10 - 50 - 250 - 500 - 1000 kIU/l (2. IRP 75/502 WHO), in
Pferdeserum mit 0,01 % Proclin 300 als Konservierungsmittel. Gebrauchsfertig.
INKUBATIONSPUFFER: Inkubationspuffer; das Fläschchen enthält 18 ml TRIS-
Puffer, pH 8,4, mit 0,1 % Tween 20 und 0,005 % Proclin 300 als
Konservierungsmittel. Gebrauchsfertig.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 19/32

DIL│SPE
CONJ│HRP
SUBS│TMB
SOLN│STOP
BUF│WASH│10X
PROBENVERDÜNNUNGSLÖSUNG: Probenverdünnungslösung; das Fläschchen
enthält 10,0 ml Pferdeserum mit 0,01% Proclin 300 als Konservierungsmittel.
Gebrauchsfertig.
HRP-STREPTAVIDIN KONJUGAT: Das Fläschchen enthält 13 ml Streptavidin-
Peroxidase-Konjugat in rot gefärbtem Puffer, pH 5,5, mit 0,001 % Proclin 300 als
Konservierungsmittel. Gebrauchsfertig.
SUBSTRAT HS: Das Fläschchen enthält 13 ml einer stabilisierten Mischung aus
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2).
Gebrauchsfertig.
STOPPLÖSUNG: Das Fläschchen enthält 13 ml 0,3 M Schwefelsäure.
Gebrauchsfertig.
WASCHPUFFERKONZENTRAT 10x: Das Fläschchen enthält 100 ml einer
10fach konzentrierten Waschlösung, mit 2,5 µg Amphotericin B. Zum Ansetzen der
Gebrauchslösung den Inhalt des Fläschchens mit 900 ml destilliertem Wasser
mischen.
5.0 LAGERUNG UND HALTBARKEIT NACH DEM ERSTEN ÖFFNEN
Die Reagenzien können bei 2-8 °C bis zum auf dem Reagenzienetikett angegebenen Verfallsdatum
gelagert werden. Das Verfallsdatum ist auf dem Packungsetikett angegeben.
Alle Reagenzien sind nach dem ersten Öffnen bei 2-8 °C bis zum auf dem Fläschchenetikett
angegebenen Verfallsdatum und bei Raumtemperatur (18-25 °C) 2 Wochen haltbar.
6.0 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN
Warnhinweis: Der Benutzer sollte bei allen Materialien und Zubehör, die in Verbindung mit dem Assay
verwendet werden, die Übereinstimmung mit den Assayerfordernissen genau prüfen.
• Präzisionspipette mit Einmal-Spitzen für 25 und 100 µl
• Automatisches Plattenwaschgerät
• Destilliertes Wasser
• Mikrotiterplatten-Reader. Es wird empfohlen, einen Reader zu verwenden, der in der Lage ist, die
O.D.s gleichzeitig bei 405 nm und 450 nm (bei 620 nm als Referenzfilter) zu messen.
7.0 HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
7.1 SICHERHEITSMAßNAHMEN
• Die Reagenzien dieses Kits sind nur zur In-vitro-Diagnostik bestimmt.
• Die Verwendung dieses Tests ist erfahrenem Laborpersonal vorbehalten und der Umgang hat in
Übereinstimmung mit vorliegenden Gebrauchsinformationen und den Prinzipien der “Guten
Laborpraxis” (GLP) zu erfolgen.
• Beim Umgang mit Patentenproben und Produkten auf Serumbasis muss der Anwender
Handschuhe und Schutzkleidung tragen.
• Einige Reagenzien enthalten Bestandteile humanen Ursprungs. Die für die Herstellung dieser
Reagenzien verwendeten Bestandteile wurden mit Immunoassays individuell bei jedem Spender
auf Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), Anti-HIV- und Anti-HCV-Antikörper überprüft und
negativ gefunden. Da es aber keine Testmethode gibt, die diese Infektionserreger völlig
ausschließen kann, wird empfohlen, diese Reagenzien wie auch die Patientenproben als
potentiell infektiös zu betrachten und den nationalen Richtlinien entsprechend zu handhaben.
• Die Kalibratoren enthalten Pferdeserum. Diese Bestandteile stammen von gesunden Tieren. Da
es aber keine Testmethode gibt, die infektiöse Agentien völlig ausschließen kann, empfehlen wir,
dass Reagenzien mit Serumbestandteilen als potentiell infektiös betrachtet und entsprechend
gehandhabt werden.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 20/32

• Die Reagenzien dieses Kits enthalten antimikrobielle Agentien und die TMB-Substratlösung
enthält Tetramethylbenzidin. Kontakt mit Haut oder Augen vermeiden. Bei Kontakt sofort mit viel
Wasser abspülen.
• Die Stopplösung enthält 0,3 M Schwefelsäure. Kontakt mit Haut oder Augen vermeiden. Bei
Kontakt sofort mit viel Wasser abspülen.
• Nicht mit dem Mund pipettieren.
• Während der Handhabung von Patientenproben und Reagenzien nicht rauchen, essen oder
trinken und keine Kosmetika anwenden.
• Mikrobielle Verunreinigung der Reagenzien durch Verwendung von Einmal-Pipettenspitzen
vermeiden.
• Jede Flüssigkeit, die mit potentiell infektiösem Material in Berührung gekommen ist, muss in
einem Behälter mit Desinfektionsmittel entsorgt werden. Die Abfallentsorgung muss den
regionalen Vorschriften entsprechend erfolgen.
7.2 TECHNISCHE VORSICHTSMAßNAHMEN
1. Korrekte Verwendung der Reagenzien und vorschriftsmäßiges Pipettieren
• Der Kit darf ausschließlich für den angegebenen Verwendungs-zweck eingesetzt werden.
• Verwenden Sie keine Reagenzien nach dem angegebenen Verfallsdatum.
• Streifen und Lösungen dürfen nicht verwendet werden, wenn die Folienverpackung beschädigt ist
oder Flüssigkeit ausgelaufen ist.
• Das Substrate HS ist farblos oder leicht bläulich. Wenn es älter wird, wird es leicht gelblichorange.
Dies hat KEINEN Einfluss auf die Testdurchführung. Falls versehentlich eine
Kontamination auftritt, entwickelt die Lösung eine Blaufärbung und kann nicht mehr verwendet
werden.
Das Substrat HS ist nicht lichtempfindlich. Dennoch führt eine Einstrahlung von direktem
Sonnenlicht zu einer Oxidierung der Lösung und zu einer Blaufärbung. Wenn die Lichteinwirkung
nicht zu lange andauerte, verschwindet die Färbung bei einer Lagerung von 4 Stunden im
Dunkeln. Danach kann die Lösung wieder verwendet werden.
• Verwenden Sie nur Einmal-Pipettenspitzen.
• Stellen Sie sicher, dass es keine Kreuzkontaminationen zwischen den Wells gibt. Verwahren Sie
alle Pipetten und anderes Zubehör, das für das Conjugate verwendet wurde, völlig separat vom
Substrate HS.
• Für das Pipettieren von Konjugat oder Substrat HS sollten Aliquots für die benötigte Anahl von
Wells abgefüllt werden, um das häufige Eintauchen der Pipettenspitzen in die
Reagenzienfläschchen zu vermeiden. Füllen Sie nichtverwendete Reagenzien niemals in die
Orginalfläschchen zurück
2. Einhalten des Testprotokolls und der -spezifikationen
• Die erhaltenen Werte müssen immer mit den im QC-Kontrollblatt angegebenen verglichen
werden. Verwenden Sie den Kit nicht, um Werte zu ermitteln, die außerhalb des in der
Arbeitsanleitung angegebenen Bereiches liegen.
• Das Testprotokoll muss genau eingehalten werden. Beachten Sie die angegebenen
Inkubationszeiten, -temperaturen und die Waschanleitung. Dies sind kritische Schritte.
• Führen Sie in jedem Testansatz eine Positiv- und eine Negativkontrolle mit, um die
Reagenzienstabilität und eine korrekte Testdurchführung zu überwachen. Siehe Abschnitt 10.5 -
Qualitätskontrolle.
8.0 VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER PROBEN
• Sowohl Serum- als auch Plasma-Proben können in diesen Assay eingesetzt werden. Heparin,
EDTA und Natriumzitrat können als Antikoagulantien verwendet werden.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 21/32

• Achtung: Proben, bei denen nicht nur Total IgE sondern auch spezifisches IgE gemessen werden
soll, sollten kein Heparin als Antikoagulans enthalten, die dies zu einer Unterschätzung der
Konzentration von spezifischem IgE führt.
• Bei Vollblutproben sollte das Serum oder Plasma so schnell wie möglich abgetrennt werden, um
eine Hämolyse zu vermeiden. Klümpchen müssen entfernt werden.
• Die Patientenproben sollten venös (ohne Verletzung) mit einem Vakuumröhrchen oder einer
sterilen Spritze entnommen werden. Dabei sollten die üblichen Vorsichtsmaßnahmen beachtet
werden. Falls eine Spritze verwendet wird, sollte die Probe sofort in ein Vakuumröhrchen
transferiert werden (flach und oben rot oder Serumseparator).
• Serum- und Plasmaproben können über Nacht bei 2-8°C gelagert werden. Zur längeren
Aufbewahrung sollten die Proben bei -20°C eingefroren werden.
• Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.
9.0 TESTDURCHFÜHRUNG
Sowohl die manuelle als auch die automatische Testdurchführung auf Adaltis und Radim Geräten
erfordern die folgenden Schritte.
9.1 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
• Alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte auf Raumtemperatur bringen.
• Ungenutzte Teststreifen mit dem beigefügten Trockenmittel im sorgfältig verschlossenen
Plastikbeutel bei 2 - 8°C lagern.
• Die Waschlösung ansetzen.
9.2 PIPETTIER- UND INKUBATIONSSCHRITTE
1. Planung des Assay-Ansatzes: die ersten Wells für die Kalibratoren reservieren.
2. 150 µl Inkubationspuffer in alle Wells pipettieren.
3. 25 µl Kalibratoren und Proben in die entsprechenden Wells pipettieren.
4. Die Mikrotiterplatte 10 Sekunden vorsichtig schütteln, ohne dass der Inhalt aus den Wells
schwappt.
5. 60 Minuten bei 37°C inkubieren. Die Platte nicht abdecken.
6. Dreimal waschen. (Hinweise unter 9.3 beachten.)
7. 100 µl Anti-IgE-Biotin-Konjugat in alle Wells pipettieren.
8. 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Die Platte dabei nicht abdecken.
9. Dreimal waschen. (Hinweise unter 9.3 beachten.)
10. 100 µl HRP-Streptavidin-Konjugat in alle Wells pipettieren.
11. 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Die Platte dabei nicht abdecken.
12. Dreimal waschen. (Hinweise unter 9.3 beachten.)
13. 100 µl Substrate HS in alle Wells geben.
14. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
15. 100 µl Stopplösung in derselben Reihenfolge und demselben Timing wie bei der Substratzugabe
pipettieren und bei 450 nm mit einem Referenzfilter von 620 nm messen. Die Platte innerhalb
von 60 Minuten messen.
9.3 HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG
• DER WASCHVORGANG
Für die Waschvorgang wird der Gebrauch eines automatischen Platten-Washers empfohlen.
Nach dem Waschen die umgedrehte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um sämtliche
Flüssigkeitsreste aus den Wells zu entfernen, falls der Washer die Waschlösung nicht komplett
absaugt.
Die Adaltis und Radim Gerätes führen diese Waschschritte automatisch durch. Drei
Waschvorgänge sind erforderlich.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 22/32

• DIE INKUBATIONSTEMPERATUR
Die Inkubationstemperatur für alle immunologischen Reaktionen muss bei konstanten 37°C ±
1°C ablaufen.
• PIPETTIEREN DER SUBSTRAT-HS-LÖSUNG
Um möglichst genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es notwendig, das Substrat HS sofort nach
dem Waschen zuzugeben. Die Zugabe der Substrat- und Stopplösung sollte in derselben
Reihenfolge und mit der gleicher Geschwindigkeit erfolgen, d.h., wenn das Substrat HS im
Abstand von 3 Sekunden in die Wells pipettiert wird, sollte die Stopplösung in der gleichen
Reihenfolge und im gleichen Zeitabstand pipettiert werden.
Der Gebrauch einer Mehrfachpipette ist besonders hilfreich.
Eine Kontamination von Lösungen sollte vermieden werden.
Inkubation im Dunkeln ist nicht notwendig, aber eine direkte Lichtexposition sollte vermieden
werden.
10.0 BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
10.1 UMRECHNUNG DER OPTISCHEN DICHTE
Die optische Dichte des Kalibrators bei 500 kIU/l kann höher als 2,0 sein und die des Kalibrators bei
1000 kIU/l liegt bei 3,0. Falls Ihr Reader ODs bis 3,0 lesen kann, ist die Messung bei 450 nm (Peak-
Wellenlänge) und bei 620 nm (Referenzfilter für die Subtraktion von Störungen durch das Plastik)
ausreichend. Falls der Reader nicht bis 3,0 messen kann, gibt es zwei Möglichkeiten:
1. den Kalibrator bei 1000 kIU/l weglassen,
2. den Kalibrator bei 1000 kIU/l mitmessen und dann, zusätzlich zur Messung bei 450 nm, bei 405
nm (Peak-Schulter) immer gegen den Subtraktionsfilter bei 620 nm zu messen. Suchen Sie die
Wells mit ODs höher als 2,0 bei 450 nm sowohl für Kalibratoren als auch Proben heraus,
notieren Sie die dazugehörigen ODs bei 405 nm und multiplizieren Sie diese ODs mit dem
Umrechnungsfaktor 3,0:
OD450 nm = OD405 nm x 3.0
Warnhinweis: Der Umrechnungsfaktor 3.0 ist nur ein Vorschlag. Für eine optimale Richtigkeit sollte der
Benutzer seinen eigenen gerätespezifischen Umrechnungsfaktor berechnen.
Die Adaltis und Radim Geräte sind bereits zum Lesen auf den 3 Wellenlängen mit geeignetem
Umrechungsfaktor programmiert.
10.2 DATENAUSWERTUNG - MANUELLE METHODE
Berechnen Sie die mittleren ODs (bei 450 nm) der Kalibratoren und Proben. Tragen Sie die mittleren
ODs der Kalibratoren gegen die entsprechende IgE-Konzentration auf (lineare oder halb-logarithmische
Skala verwenden). Ermitteln Sie die Total-IgE-Konzentrationen der Proben durch Interpolation der
Proben-ODs (bei 450 nm) anhand der Eichkurve.
10.3 DATENAUSWERTUNG – AUTOMATISCHE METHODE
Falls Sie mit einem Automaten arbeiten, halten Sie sich bitte an die Bedienungsanleitung des Gerätes.
10.4 VALIDITÄT DES ASSAYS
Für die Validität des Assays müssen folgende Kriterien erfüllt sein:
- Die O.D.s der Kalibratoren A und F müssen innerhalb der Annahmebereiche liegen, die in den
Analysenzertifikaten der Lose angegeben sind.
- Für jeden einzelnen Kalibrator muss das Verhältnis zwischen berechneter Konzentration und
Nennkonzentration innerhalb der Annahmegrenzen liegen, die in den Analysezertifikaten der
Lose mit den Kalibrator-Sets angegeben sind.
- Die erhaltenen Ergebnisse für die Qualitätskontrollsensoren müssen innerhalb der
Annahmebereiche liegen: Lesen Sie bitte auch Punkt 10.5 QUALITÄTSKONTROLLE.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 23/32

10.5 QUALITÄTSKONTROLLE
Die Qualitätskontrolldaten sind auf dem lotspezifischen QC-Zertifikat, das in jedem Kit enthalten ist,
angegeben. Für die interne Qualitätskontrolle werden Kontrollseren mit bekannter Konzentration
empfohlen, um eventuelle Fehler bei der Testdurchführung zu erkennen.
10.6 DATENAUSWERTUNG – FÜR PROBEN ³ 1000 KIU/L
Proben mit ODs³ höchstem Standard sollten 1:5 oder 1:10 mit Proben-verdünnungslösung verdünnt
werden. Anschließend muss mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
Um die Präzision zu verbessern, empfehlen wir, Proben mit einer Konzentration zwischen 500 kIU/l und
1000 kIU/l ebenfalls 1:5 oder 1:10 zu verdünnen.
11.0 ZU ERWARTENDE WERTE
Die Streuung von IgE-Werten ist extrem groß, sowohl bei Menschen mit und ohne allergische
Erkrankung und hängt außerdem von der Population ab, z.B. geographische Lage, Geschlecht und
Alter. Daher gibt es eine große Werteüberlappung von Total-IgE-Werten zwischen Atopikern und
Nichtatopikern und es ist sehr schwer, eine obere Normalgrenze festzusetzen. Es wird empfohlen, dass
jedes Laboratorium seine eigenen Normalbereiche ermittelt, dem eigenen Patientenkollektiv
entsprechend.
Mittelwert: 27,6 kIU/l
Alter (Jahre) KIU/L
0 – 3

13.0 TESTCHARAKTERISTIKA
13.1 PRÄZISION
Präzision (manuelle Testdurchführung)
Probe Level 1 Level 2 Level 3
Testansätze 20 20 20
Replikate pro Testansatz 4 4 4
Replikate insgesamt 80 80 80
CV intra-assay % 9.5 6.6 4.7
CV inter-assay % 10.6 5.5 4.9
CV insgesamt % 14.2 8.6 6.8
mittl. Konz. (KIU/I) 356.5 147.4 90.5
13.2 SENSITIVITÄT
Die untere Nachweisgrenze dieses Assays, definiert als der Mittelwert der 20fachen Bestimmung des
Nullstandards plus 3 Standard-abweichungen, liegt bei 3,9 kIU/l.
13.3 RICHTIGKEIT
Richtigkeit - Verdünnung
Verdünnungsstudien ergaben CVs zwischen 3-19 %.
Richtigkeit - Wiederfindung
Zwei Proben mit bekannten IgE-Konzentrationen wurden gespiked und gemessen.
Probe zugerfügt
(KIU/L)
1
2
erwartet
(KIU/L)
gefunden
(KIU/L)
wiederfindung %
(gefunden/erwartet
x 100)
0,00 7,41
111,11 117,70 105,79 90%
200,00 205,93 198,70 96%
333,33 338,27 339,86 100%
500,00 503,71 498,70 99%
666.66 669,14 640,12 96%
mittlere Wiederfindung 96%
0,00 8,04
111,11 118,26 108,73 92%
200,00 206,43 197,49 96%
333,33 338,69 305,61 90%
500,00 504,02 438,84 87%
666.66 669,35 665,65 99%
mittlere Wiederfindung 93%
Korrelation mit einer anderen Methode
Es wurde eine Vergleichsstudie zwischen dem ALLERGEN Total IgE-Assay und einer anderen
etablierten Methode durchgeführt. Eine lineare Regressionsanalyse ergab folgende Ergebnisse:
n = 98 y= 0,9489x + 27,56 r 2 = 0,87
14.0 AUTOMATISIERUNG
Der Assay für spezifisches IgE ist voll automatisierbar auf folgenden Analysengeräten für
Mikrotiterplatten von Adaltis und Radim (mit der entsprechenden Allergie-Software).
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 25/32

Weitere Informationen über den korrekten Umgang mit den Geräten entnehmen Sie bitten den
entsprechenden Bedienungs-anleitungen.
15.0 VORSCHLÄGE FÜR EINE FEHLERSUCHE (Troubleshooting)
Das Einhalten der Testdurchführung und –spezifikationen sowie der korrekte Gebrauch der Reagenzien
und genaues Pipettieren helfen Ihnen, die folgenden Fehler zu vermeiden.
FEHLER MÖGLICHE URSACHEN/LÖSUNGSVORSCHLAG
OD weicht stark (± 50 %)
von den Angaben im QC-
Zertifikat ab.
Niedrige Reproduzier-
barkeit der Ergebnisse
keine Farbreaktion
nach Zugabe des
Substrates
zu niedrige Reaktion
(zu niedrige ODs)
Zu intensive Reaktion
(zu hohe ODs)
Unerklärliche Ausreißer
Zu hohe intraassay
% CVs
Zu hohe interassay % CVs
16.0 SYMBOLLEGENDE: SIEHE SEITE 27
- unkorrektes Pipettiervolumen der Reagenzien (Vorschlag: Vergleichen Sie das mit der Pipette
pipettierte Volumen mit dem für den Assay erforderlichen; rekalibrieren Sie Ihre Pipette.)
ungenaue Inkubationstemperatur oder –zeit (Vorschlag: regelmäßige Wartung Ihres Inkubators;
Beginn der Inkubationszeit notieren.)
- Fehler beim Waschen oder der Photometermessung (Vorschlag: Funktion oder Einstellungen
der entsprechenden Geräte überprüfen.)
- Kontamination des Substrat HS (Vorschlag: nur Einmalspitzen und saubere Plastikbehälter
verwenden.)
- unkorrektes Pipettiervolumen der Reagenzien (Vorschlag: Vergleichen Sie das mit der Pipette
pipettierte Volumen mit dem für den Assay erforderlichen; rekalibrieren Sie Ihre Pipette.)
- ungenaue Inkubationstemperatur oder –zeit (Vorschlag: regelmäßige Wartung Ihres Inkubators;
Beginn der Inkubationszeit notieren.)
- Fehler beim Waschen oder der Photometermessung (Vorschlag: Funktion oder Einstellungen
der entsprechenden Geräte überprüfen.)
- Kontamination des Substrat HS (Vorschlag: nur Einmalspitzen und saubere Plastikbehälter
verwenden.)
- Verunreinigung oder Verfall der Reagenzien (Vorschlag: Verwenden Sie geeignete Spitzen,
saubere Einweg-Plastikbehälter für die Reagenzien und destilliertes (oder äquivalentes)
Wasser von guter Qualität.
- kein Konjugat pipettiert
- starke Kontamination der Konjugate (Anti-IgE-Biotin oder HRP-Streptavidin) oder des
Substrates
- Fehler bei der Testdurchführung (z.B. versehentliches Pipettieren der Reagenzien in der
falschen Reihenfolge oder aus den falschen Fläschchen etc.)
- falsches Konjugat (z.B. nicht aus dem Originalkit)
- Inkubationszeit zu kurz, Inkubationstemperatur zu niedrig
- falsche Konjugate (Anti-IgE-Biotin oder HRP-Streptavidin) (z.B. nicht aus dem Originalkit)
- versehentliche Kontamination/Verfalls der Konjugate (Anti-IgE-Biotin oder HRP-Streptavidin)
- Inkubationszeit zu lang, Inkubationstemperatur zu hoch
- Wasserqualität für den Waschpuffer nicht ausreichend (niedrige Stufe der Deionisation)
- nicht ausreichendes Waschen (Konjugate nicht ausreichend entfernt)
- Kontamination der Pipetten, Spitzen oder Behälter
- nicht ausreichendes Waschen (Konjugate nicht ausreichend entfernt)
- Reagenzien und/oder Strips vor Gebrauch nicht auf Raumtemperatur gebracht
- Plattenwaschgerät wäscht nicht korrekt (Vorschlag: Waschkopf reinigen)
- Inkubationsbedingungen nicht konstant (Zeit, Temperatur)
- Kontrollen und Proben nicht zur selben Zeit dispensiert (mit denselben Intervallen)
(Pipettierablauf prüfen)
- personenenbezogene Variation
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 26/32

SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT,
SYMBOLER
REF
EN 980 - EDMA
Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de
commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda /
Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş
numarsı / referenční nebo objednací číslo
LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže
IVD
Σ
96
RDATE
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de caducidad / Data de
vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace
Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para
uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-
VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım / pro
použití in-vitro
Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines
98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según
directiva de IVD 98/79/CE / marcação-CE segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CE-
Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής
οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD
98/79/EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a 2-8°C / conservar a
2-8°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C / 2-8°C da saklayınız / skladovat při 2-
8°C.
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der /
κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico /
Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode
opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen
Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak
bilgiler / Sledujte návod k použití
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente
para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί
για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů
Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de
refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční
datum
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 27/32

RCNS
H2O
Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com /
rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat
Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée /
agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder
Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su /
deionizovaná nebo destilovaná voda
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 28/32

BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAPHY/LITERATUR
1. Geha RS Human IgE. J. Allergy Clin. Immunol. 1994; 74:109-120.
2. Gordon RR et al. Immunoglobulin E and eczema- asthma syndrome in early childhood. Lancet 1982;
72-74
3. Norman PS. The clinical significance of IgE. Hospital Practice 1975 Aug; 10(8): 41-49
4. Johansson SGO, Lancet 1967; 2:951
5. Zefferstron and Johansson SGO, Allergy 198; 36:537
6. Wathrich B. Clin. Allergy 1978; 8:214
7. Barbee RA et al. Distribution of IgE in a community population sample: correlation with age, sex and
allergen skin test reactivity. J. Allergy Clin. Immunology 1981; 68: 106-111
8. Kjellman IM, Anderson SGO, Roth A. Serum IgE levels in healthy children. Clin. Allergy 1976;
65:51-59
9. Halpern G.M. Markers of human allergic disease. J. Clin. Immunoassay 1983 Jun; 6 (2) : 131-139
10. Hamilton RG, Adkinson NF. Quantitation of allergen-specific IgE in serum using the
radioallergosorbent test. J. Clin. Immunoassay 1983 Jun; 6 (12): 147-154
11. Homberger HA, Yunginger JW. Laboratory testing in the diagnosis and management of allergic
diseases. Clin. Lab. Annual 1983; 2:351-388
12. Bukley RH. Immunopharmacology of Allergic Disease, 1975; 253: 474
13. Capmon A, Dessaint JP, Capron M at al. Nature 1975; 253:474
14. Jahonsson SGO, Bennick H, Berg T. Clin. Immunol. 1972; p1
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 29/32

SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME - ASSAYSCHEMA
Pozzetti
Wells
CAL
Campioni,
Samples
Reag.
Proben
BUF│INC 150 µl 150 µl
CAL 25 µl ----
Campioni, Samples, Proben ---- 25 µl
− Incubare / Incubate / Inkubieren: 60 min., 37°C
− Aspirare e Lavare / Aspirate and Wash / Absaugen und Waschen: 3 x 350 µl.
CONJ│BIOT 100 µl 100 µl
− Incubare / Incubate / Inkubieren: 30 min., 37°C
− Aspirare e Lavare / Aspirate and Wash / Absaugen und Waschen: 3 x 350 µl.
CONJ│HRP 100 µl 100 µl
− Incubare / Incubate / Inkubieren: 30 min., 37°C
− Aspirare e Lavare / Aspirate and Wash / Absaugen und Waschen: 3 x 350 µl.
SUBS│TMB 100 µl 100 µl
− Incubare / Incubate / Inkubieren: 15 min., T.A./RT (20-25°C)
STOP 100 µl 100 µl
− Leggere / Read / Messen: 450-405 nm.
A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 30/32

A1002 – ALLERGEN Total IgE
M541 – Rev. 1 – 06/2010 – Pag. 31/32

RADIM S.p.A. -Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
National Order Entry: +39 06 91.249.702
Export Department: +39 06 91.249.701
Customer Care: +39 06 91.249.700
info@radim.com - www.radim.com