hGH IEMA WELL REF. - Radim S.p.A.

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REF. KP9IW
hGH
IEMA WELL
96
Italiano p. 3
English p. 11

REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENT
Reag, Reac Quant. Stato fisico, Physical state
MTP 96 Pronti per l'uso, Ready for use
CAL 0
CAL 1– 5
1 x 2 mL
5 x 1 mL
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Liof, Lyoph.
CONJ 2 x 14 mL Pronto per l'uso, Ready for use
CTR 1 x 1 mL Liof, Lyoph.
WASH 1 x 50 mL Conc.
TMB 1 x 15 mL Liquido, Liquid
SUBS 1 x 15 mL Liquido, Liquid
STOP 1 x 14 mL Pronto per l'uso, Ready for use

DOSAGGIO IMMUNOENZIMOMETRICO PER LA DETERMINAZIONE
QUANTITATIVA DELL'ORMONE SOMATOTROPO (hGH) NEL SIERO O
PLASMA UMANO
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
APPLICAZIONI CLINICHE
L'ormone somatotropo (hGH) è l'ormone ipofisario prodotto in maggior quantità.
Viene secreto dalle cellule alfa dell'ipofisi anteriore, ha un peso molecolare di
circa 21500 Daltons ed è costituito da una catena polipeptidica di 191 aminoacidi
con due ponti disolfuro. Ha una breve emivita plasmatica (20 - 30 minuti) e i suoi
livelli circolanti sono influenzati da vari fattori: l'ipoglicemia, l'esercizio fisico ed
alcuni aminoacidi (arginina) producono un incremento dei livelli ematici di hGH,
mentre glucosio e cortisolo li riducono. L'azione del somatotropo non è diretta
verso un organo bersaglio specifico, anche se recettori per l'hGH sono stati
dimostrati sulle membrane di cellule epatiche e di linfociti. Il somatotropo ha
un'attività diretta di antagonista dell'insulina, facilitando il trasporto di aminoacidi e
il rilascio di acidi grassi liberi nelle cellule muscolari. Nel bambino, la stimolazione
della crescita è mediata dall'hGH che stimola il fegato a produrre le
somatomedine (o insulin-like growth factors, IGF), ormoni a basso peso
molecolare (circa 7000 D) con struttura simile a quella della pro-insulina. Le
somatomedine circolano veicolate da proteine vettrici, ed hanno pertanto
concentrazioni plasmatiche relativamente costanti nel tempo. La determinazione
quantitativa dell'hGH è necessaria nella diagnosi di vari stati patologici, quali
acromegalia, gigantismo, iposomatismo e sindromi ipopituitarie. Il dosaggio
dell'ormone in condizioni basali non è molto significativo, mentre informazioni più
precise si possono ottenere con vari tipi di prove dinamiche, quali il test di stimolo
con arginina, insulina, L-dopa o glucagone ed il test di inibizione con glucosio.
PRINCIPIO DEL METODO
Il presente kit è basato sul metodo del dosaggio immunoenzimometrico (IEMA).
Vengono utilizzati due differenti anticorpi monoclonali anti-hGH, uno adsorbito su
pozzetti e l'altro coniugato con perossidasi di rafano (HRPO). Durante
l'incubazione, l'hGH presente nei calibratori e nei campioni si lega
contemporaneamente ad entrambi gli anticorpi, formando un "sandwich". Al
termine dell'incubazione il materiale non legato viene rimosso mediante
aspirazione e lavaggio. L'attività enzimatica rimasta fissata sulla fase solida sarà
quindi direttamente proporzionale alla concentrazione di hGH e viene evidenziata
aggiungendo ai pozzetti una soluzione di Cromogeno (Tetrametilbenzidina, TMB)
in un Tampone Substrato.
L'intensità del colore sviluppato viene misurata mediante spettrofotometro a 450 e
a 405 nm.
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REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA'
− I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti.
− Il kit deve essere conservato a 2-8°C.
− La data di scadenza di ciascun reagente é indicata sulla rispettiva etichetta.
1 - Micropiastra Sensibilizzata: 96 pozzetti separabili singolarmente,
sensibilizzati con anticorpo monoclonale anti-hGH (topo). I pozzetti non utilizzati
devono essere riposti a 2-8°C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata
accuratamente.
2 - Calibratori: 6 flaconi di hGH in matrice sierica alle seguenti concentrazioni: 0,
0.5, 1.5, 5, 15 e 50 ng/mL. Conservante: Neomicina. Liofilo. Ricostituire il flacone
del Calibratore Zero con 2 mL di H2O distillata, e i Calibratori 1-5 con 1 mL di H2O
distillata. I calibratori è stato tarati contro il 1°Standard Internazionale di hGH
WHO 80/505 (1 ng = 2 MUI). Dopo ricostituzione, conservare a 2-8° per 5-7 giorni,
per periodi più lunghi congelare a -20°C.
N.B.: verificare sempre l'esatta concentrazione sul foglio di C.Q.
3 - Coniugato Enzimatico: 2 flaconi (14 mL) di anti-hGH monoclonale (topo)
coniugato con perossidasi di rafano (HRPO), in Tris-HCl, BSA e stabilizzanti.
Conservante: Neomicina. Pronto per l'uso.
5 - Siero Di Controllo: 1 flacone di hGH in matrice sierica. Conservante:
Neomicina e Mertiolato (

10 - Reagente Bloccante: 1 flacone (14 mL )di H2SO4 1N. Pronto per l'uso.
− Copripiastra adesivo
− Bustina di plastica trasparente con minigrip
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
Dosaggio Manuale
− Micropipette automatiche a punte intercambiabili da 20, 200, 300 e 1000 ML.
− Termostato ad aria, regolabile a 37±2°C.
− Cilindro graduato.
− Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle
micropiastre.
− Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in
assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm.
− Carta millimetrata.
− H2O distillata.
Dosaggio Automatico
− Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA
su micropiastra.
− Si garantisce l’applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC
− Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità
dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le
seguenti norme:
− Non mescolare reagenti di lotti differenti.
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni
metallici o sostanze ossidanti.
− Usare acqua deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile
usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
− Rispettare i tempi di incubazione descritti nel procedimento operativo.
Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare
le seguenti norme di sicurezza:
− Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale
potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
− Non pipettare i reagenti con la bocca.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del
dosaggio.
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− I materiali di origine umana, eventualmente utilizzati per la preparazione dei
reagenti del presente kit, sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-
HIV e anti-HCV e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test
attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti responsabili della
sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tali
reagenti e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati
potenzialmente infettivi.
− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire
accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo
adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente
infetto ed eliminato secondo le modalità sotto riportate.
− I reagenti per cui non si fornisce la scheda di sicurezza non contengono
sostanze chimiche pericolose o se presenti, queste sono al di sotto dei limiti di
concentrazione definiti nel D.Lgs.285/98 e nella direttiva CEE 91/155.
− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive
CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da
lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi
con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati
affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma prelevato su EDTA. I
campioni fortemente lipemici od emolizzati devono essere scartati. I campioni
possono essere conservati a 2 -8°C per 1-2 giorni; per periodi più lunghi
conservarli a -20°C. I campioni di plasma possono presentare filamenti di fibrina
che interferiscono nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano
perfettamente limpidi prima di dosarli. Si consiglia di non congelare e scongelare
ripetutamente i campioni. I campioni che presentano concentrazioni di hGH
superiori a 50 ng/mL debbono essere dosati di nuovo dopo diluizione con il
Calibratore Zero.
PROCEDIMENTO OPERATIVO*
− Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente.
− Agitare i campioni per inversione prima dell'uso.
1 - Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori, Siero di Controllo e Campioni.
2 - Dispensare 20 >L di ciascun Calibratore, del Siero di Controllo e dei
Campioni nei rispettivi pozzetti.
3 - Dispensare 200 >L di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, eccetto quelli
del Bianco.
4 - Incubare per 60±5 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il
copripiastra adesivo fornito nel kit.
5 - Rimuovere il copripiastra adesivo ed aspirare accuratamente la miscela di
incubazione da tutti i pozzetti.
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6 - Effettuare 4 lavaggi con un volume di 300 >L per pozzetto, impiegando la
Soluzione di lavaggio diluita. Aspirare completamente il liquido da tutti i
pozzetti.
7 - Dispensare 200 >L di Soluzione Substrato precedentemente preparata (vedi
paragrafo reagenti), in tutti i pozzetti.
8 - Incubare per 15 minuti a 37±2°C al riparo dalla luce troppo intensa.
9 - Dispensare 100 >L di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti.
10 - Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm e a 405 nm in uno
spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di
riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). La lettura deve
essere effettuata entro 20 minuti dal termine del dosaggio.
* Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per
micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale.
SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p.23
CALCOLO DEI RISULTATI
Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC,
la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda:
450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura.
Al fine di ottenere una migliore sensibilità, il presente metodo utilizza una lettura
spettrofotometrica a due lunghezze d'onda (450 e 405 nm). Per i campioni con
concentrazione di hGH compresa tra 0 e 15 ng/mL dovrà essere utilizzata la
misura a 450 nm; per campioni con livelli di hGH superiori a 15 ng/mL, il calcolo
dovrà essere effettuato sulle misure a 405 nm.
Disegnare la curva di calibrazione su carta millimetrata, riportando sull'asse delle
ascisse le dosi dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per
ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative
a ciascun campione si otterranno le corrispondenti concentrazioni di hGH in
ng/mL; nel caso di campioni diluiti, queste saranno moltiplicate per il fattore di
diluizione.
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ESEMPIO DI CALCOLO
I valori sotto riportati devono essere considerati unicamente un esempio e non
devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali.
Descrizione Assorbanza hGH Assorbanza hGH
450 nm
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405 nm
Calibratore 0 ng/mL 0.007 0.002
Calibratore 0.5 ng/mL 0.066 0.022
Calibratore 1.5 ng/mL 0.160 0.058
Calibratore 5.0 ng/mL 0.500 0.176
Calibratore 15.0 ng/mL 1.465 0.505
Calibratore 50.0 ng/mL >3000 1.160
Campione 1 0.622 6.2 ng/mL 0.218
Campione 2 2.312 0.804 30.9 ng/mL
VALORI NORMALI
I valori riportati nella tabella seguente sono soltanto indicativi. Si raccomanda a
ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento.
Donna: 0 - 16 ng/mL
Uomo: 0 - 8 ng/mL
Criteri di accettazione
Prima di procedere al calcolo dei risultati, verificare che la concentrazione del
siero di controllo rientri nel range di accettazione descritto nel Foglio di Controllo
Qualità.
CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
SPECIFICITÀ
Il presente metodo analitico ha mostrato le seguenti reazioni crociate: 100% con
hGH, 0.07% con hPRL, 0.06% con TSH, 0.008% con LH, inferiore allo 0.002%
con FSH e 0.0014% con hPL.
SENSIBILITÀ
La sensibilità é stata calcolata sulla curva di calibrazione ed espressa come
minima dose significativamente distinguibile dalla risposta del Calibratore Zero
(valore medio + 3 D.S.). Tale dose é risultata pari a 0.15 ng/mL.

PRECISIONE
La precisione é stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio
su 3 sieri a differenti concentrazioni di hGH.
Intra-saggio (Ripetibilità)
Siero Media ± D.S. C.V. Replicati
(ng/mL) % n.
a 3.23 ± 0.18 5.6 10
b 8.99 ± 0.50 5.6 10
c 19.02 ± 0.90 4.7 10
Inter-saggio (Riproducibilità)
Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi
(ng/mL) % n.
d 5.15 ± 0.23 4.5 10
e 7.39 ± 0.25 3.4 10
f 32.39 ± 1.60 4.9 10
ACCURATEZZA
L'accuratezza del metodo é stata valutata mediante il test di recupero ed il test di
parallelismo:
Test di Recupero
Quantità scalari di hGH sono state aggiunte a un siero normale e dosate.
Aggiunto Atteso Misurato Recupero
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) %
S1 ---- 0.5 ----
S1 + 30 30.5 30.2 99.0
S1 + 15 15.5 15.5 100.0
S1 + 7.5 8.0 8.4 105.0
S1 + 3.75 4.25 4.0 94.1
S1 + 1.875 2.37 2.2 92.8
Test di Parallelismo
Un siero ad elevato contenuto di hGH è stato dosato a varie diluizioni con il
Calibratore Zero.
Diluizione Atteso
(ng/mL)
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Misurato
(ng/mL)
S2 indiluito ---- 34.0
1 : 2 17.0 16.7
1 : 4 8.5 8.0
1 : 8 4.25 3.75
1 :16 2.12 2.0

EFFETTO GANCIO
Qualora dei campioni a contenuto di antigene molto elevato vengano dosati non
diluiti in un metodo “sandwich” ad incubazione singola, come quello utilizzato nel
presente kit, si possono ottenere per “Effetto Gancio” dei valori apparenti di
concentrazione inferiori al reale. Il presente kit non dà luogo ad “Effetto Gancio”
fino ad una concentrazione di 1000 ng/mL.
LIMITI DEL DOSAGGIO
I risultati del dosaggio devono essere interpretati con cautela e convalidati da
valutazioni cliniche ed ulteriori prove diagnostiche
LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 19
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IMMUNOENZYMOMETRIC ASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF
GROWTH HORMONE (hGH) IN HUMAN SERUM OR PLASMA.
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
CLINICAL APPLICATIONS
Human Growth Hormone (hGH, somatotropin) is the most abundantly secreted,
circulating pituitary hormone. It is synthesized by the alpha cells of the anterior
pituitary, with molecular weight of about 21.5 kDa. It is composed of a polypeptide
chain of 191 aminoacids with two disulfide bonds. Endogenous circulating hGH
has a short half-life (20-30 minutes) and its serum levels are influenced by several
factors: hypoglycemia, exercise and some aminoacids (arginine) result in
increased hGH levels, while glucose and cortisol tend to inhibit circulating hGH.
Somatotropin activity is not directed towards a specific target organ, although
hGH receptors have been demonstrated both on liver cells and on lymphocyte
membranes.
Human Growth Hormone has a direct anti-insulin action, by facilitating aminoacid
transport as well as free fatty-acid release in muscle tissue. Growth in children is
mediated by hGH, which stimulates the liver to produce somatomedins (or insulinlike
growth factors, IGF). IGFs are low molecular weight hormones (about 7 kDa)
sharing structural homology with pro-insulin. IGFs mostly circulate bound to
carrier-proteins, which prolong their half-life and make their serum concentrations
relatively stable.
Quantitative hGH testing is a necessary diagnostic tool for pathologies such as:
acromegaly, gigantism, hyposomatism and hypopituitary syndromes.
Basal hGH levels are of little relevance, while useful information can be obtained
with several dynamic tests like: provocation with arginine, insulin, L-dopa or
glucagon, and inhibition by oral glucose intake.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
This test is based on an immunoenzymometric assay (IEMA). Two different antihGH
monoclonal antibodies are used, one adsorbed on the wells and the other
conjugated to horseradish peroxidase (HRPO). During the first incubation, the
hGH present in the calibrators and samples is bound to both monoclonals at once,
by forming a "sandwich". Following this incubation, the unbound material is
removed by aspiration and washing. The residual enzyme activity found in the
wells will thus be directly proportional to hGH concentration in the calibrators and
samples and evidenced by incubating the solid phase with a Chromogen solution
(Tetramethylbenzidine, TMB) in a Substrate-Buffer. Colorimetric reading will be
performed by using a spectrophotometer at a 450 and 405 nm wavelength.
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REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY
− The reagents are sufficient for 96 tests.
− Store the kit at 2-8°C.
− The expiry date of each reagent is shown on the vial label.
1 - Coated Microplate: 96 breakable wells, coated with mouse monoclonal antihGH
antibody. Keep unused wells at 2-8°C in the provided plastic bag and
accurately sealed.
2 - Calibrators: 6 vials of hGH in serum matrix, at the following concentrations:0,
0.5, 1.5, 5, 15, and 50 ng/mL. Preservative: Neomycin. Lyophilized. Reconstitute
the Zero Calibrator with 2 mL of distilled H2O, and Calibrators 1-5 with 1 mL of
distilled H2O. The calibrators have been adjusted against the WHO 80/505 1st
International Standard preparation of hGH (1 ng = 2 MIU). After reconstitution,
store at 2-8°C for 5-7 days; for longer periods freeze at -20°C.
NOTE: refer to the C.Q. sheet, for exact concentrations.
3 - Enzyme Conjugate: 2 vials (14 mL) of mouse monoclonal anti-hGH antibody
conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) in Tris-HCl, BSA and stabilizers.
Preservative: Neomycin. Ready for use.
5 - Control Serum: 1 vial of hGH in serum matrix. Preservative: Neomycin and
Thimerosal (

MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
Manual Test
− Automatic 20, 200, 300 and 1000 ML micropipettes with disposable tips.
− Dry Heater, adjustable at 37±2°C.
− Graduated cylinder.
− Aspiration pump or automated well washing device.
− Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a 0-
3.0 A interval at 450 and 405 nm wavelength.
− Millimetric graph paper.
− Distilled H2O.
Automatic Test
− This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate.
− We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments.
− While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is
under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for
ELISA kits.
WARNINGS AND PRECAUTIONS
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must
be observed:
− Do not mix reagents of different lots.
− Do not use reagents beyond their expiry date.
− Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing
substances.
− Use distilled water, stored in perfectly clean containers.
− Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose,
disposable tips should be used for each sample and reagent.
− Follow exact incubation times, as described in the "Assay Procedure".
In order to avoid personal and environmental contamination, the following
precautions must be observed:
− Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while
performing the assay.
− Do not pipette reagents by mouth.
− Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
− All material of human origin (if any) used for preparing the reagents of this kit
tested negative for HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. No test however can
currently grant total absence of such viruses. The above reagents as well as
all human samples must be considered as potentially infectious.
− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a
3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated
as potentially infectious and disposed of accordingly.
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− The reagents for which a Safety Data Sheet is not supplied do not contain
hazardous chemical substances or, if they do, these are below the
concentration limits established by the Italian decree D.Lgs.285/98 in
compliance with EEC directive 91/155.
− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with
EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products
originating from either manual and/or automated processing are classified as
hazardous special waste material (European classification code180103). As
such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for
waste collection and disposal.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The assay can be performed in serum or EDTA-collected plasma samples. Highly
lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Keep samples at 2-8°C for 1-2
days; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20°C. Plasma
samples may present fibrin filaments which could interfere with the assay; make
sure that samples are always perfectly clear before testing. Repeated freezing
and thawing of samples should be avoided.
Samples with concentrations of hGH higher than 50 ng/mL must be diluted with
the Zero Calibrator and re-tested.
ASSAY PROCEDURE*
− Allow reagents and samples to warm up at room temperature.
− Mix samples by inversion before use.
1 - Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Control Serum and Samples.
2 - Pipette 20 >L of each Calibrator, Control Serum and Sample into the
corresponding wells.
3 - Add 200 >L of Enzyme Conjugate into each well, except for the Blank well.
4 - Incubate for 60±5 minutes at 37±2°C, after covering the microplate with the
adhesive plate sealer.
5 - Remove the adhesive plate sealer and carefully aspirate the incubation
mixture from all wells.
6 - Wash the wells 4 times with 300 >L of diluted Washing Solution. Aspirate all
liquid from the wells.
7 - Pipette 200 >L of the previously prepared Substrate Solution (see reagent
paragraph) into all wells.
8 - Incubate for 15 minutes at 37±2°C, avoid direct light exposure.
9 - Pipette 100 >L of Blocking Reagent into all wells.
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10 - Read the absorbance of the wells with a bichromatic spectrophotometer at
450 and 405 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument
at zero with the Blank well). Reading must be completed within 20 minutes
from the end of the assay.
* While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for
microplates, refer to its relative manual.
ASSAY SCHEME: see p.23
CALCULATION OF RESULTS
While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the
spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different
wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range.
In order to obtain a better sensitivity, the present method employs
spectrophotometric reading at two wavelengths (450 and 405 nm). For samples
with hGH concentrations ranging from 0 to 15 ng/mL, read at 450 nm wavelength;
for samples with hGH level higher than 15 ng/mL, read at 405 nm wavelength.
Draw a calibration curve on millimetric graph paper, by plotting the calibrators’
concentration (x-axis) against the absorbance obtained for each calibrator (yaxis).
Corresponding hGH concentrations in ng/mL are obtained by interpolating
the absorbances of each sample on the calibration curve; in case of diluted
samples multiply by the dilution factor.
EXAMPLE OF CALCULATION
The values shown below must be considered as an example and must not be
used in place of experimental data.
Description Absorbance hGH Absorbance hGH
450 nm
- 15 -
405 nm
Calibrator 0 ng/mL 0.007 0.002
Calibrator 0.5 ng/mL 0.066 0.022
Calibrator 1.5 ng/mL 0.160 0.058
Calibrator 5.0 ng/mL 0.500 0.176
Calibrator 15.0 ng/mL 1.465 0.505
Calibrator 50.0 ng/mL >3000 1.160
Sample 1 0.622 6.2 ng/mL 0.218
Sample 2 2.312 0.804 30.9 ng/mL

NORMAL VALUES
The values reported below are indicative. We suggest that each laboratory
establishes its own normal range.
− Women: 0 - 16 ng/mL
− Men: 0 - 8 ng/mL
Validation Criteria
Before proceeding to calculation of results, make sure the control serum
concentration is included within the value described on the Quality Control Sheet.
PERFORMANCES OF THE ASSAY
SPECIFICITY
The present method has given the following cross-reactions: 100% with hGH,
0.07% with PRL, 0.06% with TSH, 0.008% with LH, lower than 0.002% with FSH
and 0.0014% with hPL.
SENSITIVITY
The sensitivity was calculated based upon the calibration curve and expressed as
the minimal dose showing a significant difference from the Zero Calibrator (mean
value + 3 S.D.). This dose is 0.15 ng/mL.
PRECISION
Precision was evaluated upon intra- and inter-assay variability, in 3 sera at
different hGH concentrations.
Intra-assay (Repeatability)
Serum Mean ± S.D C.V. Replicates
(ng/mL) % no.
a 3.23 ± 0.18 5.6 10
b 8.99 ± 0.50 5.6 10
c 19.02 ± 0.90 4.7 10
Inter-assay (Reproducibility)
Serum Mean ± S.D. C.V. Assays
(ng/mL) % no.
d 5.15 ± 0.23 4.5 10
e 7.39 ± 0.25 3.4 10
f 32.39 ± 1.60 4.9 10
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ACCURACY
Accuracy of the method has been checked by the recovery and parallelism tests:
Recovery Test.
Known amounts of hGH have been added to a normal serum and tested.
Added Expected Measured Recovery
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) %
S1 ---- 0.5 ----
S1 + 30 30.5 30.2 99.0
S1 + 15 15.5 15.5 100.0
S1 + 7.5 8.0 8.4 105.0
S1 + 3.75 4.25 4.0 94.1
S1 + 1.875 2.37 2.2 92.8
Parallelism Test.
A serum with high hGH concentration was tested at different dilutions with the
Zero Calibrator.
Dilution Expected
(ng/mL)
- 17 -
Measured
(ng/mL)
S2 undiluted ---- 34.0
1 : 2 17.0 16.7
1 : 4 8.5 8.0
1 : 8 4.25 3.75
1 :16 2.12 2.0
HOOK EFFECT
Whenever samples at very high antigen concentrations are tested undiluted in a
single-step "sandwich" method, as in this kit, the "Hook Effect" can give
concentration values apparently lower than the actual values. This kit does not
give a "Hook Effect", up to a concentration of 1000 ng/mL.

LIMITS OF THE ASSAY
The results of the assay must be carefully interpreted and confirmed by clinical
evaluations and further diagnostic tests.
SYMBOLS LEGEND: see p. 19
- 18 -

SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE,
LMNOPQR, SYMBOLIT, SYMBOLER
EN 980 - EDMA
REF codice di riferimento o di ordine / reference or order code /
Référence ou numéro de commande / referencia o número de
pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder
Bestellnummer / ]^_`]ab cdefagheb i cjdjkklmnjb / Refarans
veye sipario numarsp / referenqní nebo objednací qíslo
LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / cjdhn_j / parti / šarte
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de
caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / uMldeMvgnj
miwvb / Son kullanma targhi / datum expirace
IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour
diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do
diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-
DIAGNOSTIK / k`j in vitro _`jkg^|h`]i }di|v / in –vitro
diagnostik kullanpm / pro poutití in-vitro
Marchio CEE secondo le direttive IVD 98/79 CEE / CE marking
according to IVD guidelines 98/79 EC / marquage CE conforme
aux directives IVD 98/79 EC / marcado CE según directiva de
IVD 98/79 CE / marcação-CE segundo a directriz-IVD 98/79 /
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG /
~vMjg|v CE Ä|l` ]e`geh`]ib e_vknjb IVD 98/79 EC / 98/79 EC
IVD tüzüÅüne göre CE ioareti / CE oznaqení dle IVD 98/79 EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C /
Conservar a 2-8°C / conservar a 2-8°C / Lagerung bei 2-8°C /
ÉÑmjwv |heÖb 2-8°C / 2-8°C da saklaypnpz / skladovat pÜi 2-8°C
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por /
Fabricante / produkt der / ]jhj|]lÖÄálhj` jca / tarafpndan
üretilmiotir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / …… /
Riesgo Biológico / ………………….
- 19 -

96
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use /
consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de
uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die
Arbeitsanleitung an / |Öµ eÖmlÖhlnhl h`b e_vknlb }di|vb /
kullanpmda baovurulacak bilgiler / Sledujte návod k poutití
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96
déterminations / suficiente para 96 determinaciones /
Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / lcjd]ln
k`j 96 hl|h / 96 test için yeterli / dostaqující pro 96 testç
RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence /
Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum /
vµldeµvgnj jéµegaµv|vb / Referans Targhi / referenqní
datum
RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec /
reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit /
jgj|Ö|hÄhj` µl / ile karpotprma / rekonstituovat s
MTP Micropiastra sensibilizzata / coated microplate / Microplaques
sensibilisèes / placa de microtitulación / microplaca
sensibilizada / Mikrotiterplatte / èmÄ]j µl jce|cêµlgj eédnj /
Mikroplak / mikrotitraqní destiqka
CAL Calibratore / calibrator / calibrateur / calibrador / padrão /
Kalibrator / edab jgjÉedÄb / Kalibratör / kalibrátor
CONJ Coniugato enzimatico / enzyme conjugate / conjugué
enzimatique / Conugado Enzimático / Conjugado enzimático /
Enzymkonjugat / ëgáÖµjh`]ab `}gvéíhvb / Enzim BileoiÅi /
enzymový konjugát
CTR Siero di controllo / Control serum / sérum de contrôle / suero de
control / soro controle / Kontrollserum / edab lmík}eÖ / Kontrol
Serumu / kontrolní sérum
WASH Soluzione lavaggio concentrata / washing solution concentrated
/ solution de lavage concentrée / solución de lavado
concentrada / solução de lavagem concentrada / Waschlösung
(konzentriert) / ~ÖMcÖ]g^µíge _`ÄmÖµj l]cmÑ|l^b / Konsantre
ypkama solüsyonu / promývací roztok
- 20 -

TMB Cromogeno / chromogen / chromogène / Cromógeno /
Cromógeno / Chromogen / }d^µekage / Kromojen / chromogen
SUBS Tampone Substrato / substrate buffer / Tampon Substrat/
Tampón Sustrato / Tampão substrato / Substrat puffer /
îca|hd^µj / Substrat Tamponu / substrát
STOP Reagente bloccante / Blocking reagent / Solution d'arrêt /
Reactivo bloqueante / solução bloqueadora/ Stopreagenz /
ïgh`_dj|hid`e hldµjh`|µeÑ / Durdurma Solüsyonu /
zastavovací roztok
H2O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau
deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água
destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes
Wasser / jc`eg`|µíge -jcl|hjkµíge glda / deiyonize veya
distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda
CPA Copripiastra adesivo / Adhesive plate sealers / Feuilles
adhesives pour microplaque / Cubreplacas adhesivos / Adesivo
para microplaca / Selbstklebende Folien für mikrotiterplatten /
ïÖhe]ammvhe lc`]ÄmÖµj cmj]ab / Yappokan Plaka kapatpcp /
samolepící fólie pro mikrotitraqní destiqku
- 21 -

BIBLIOGRAFIA-REFERENCES
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sequence of the hormone". J. Amer. Chem. Soc. 88, 2050; 1966.
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Department of health, Education and Welfare Publ. DHEW publ.no (NIH) 74-
612. p. 321 (1974).
- 22 -

SCHEMA DEL DOSAGGIO-ASSAY SCHEME
Pozzetti, Wells, Bianco,
Blank,
(Bo)
- 23 -
CAL
(0-5)
S. Contr,
Contr.S.
Campioni,
Samples
Reag.
CAL (0 - 5) ---- 20 ML ---- ----
S.Contr, Contr.S. ---- ---- 20 ML ----
Campioni, Samples ---- ---- ---- 20 ML
Conj. ---- 200 ML 200 ML 200 ML
− Incubare, Incubate: 37±2°C 60±5 min.
− Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 300 ML
Soluzione Substrato
Substrate Solution
200 ML 200 ML 200 ML 200 ML
− Incubare, Incubate: 37±2°C, 15'.
R. Bloccante,
Blocking R.
100 ML 100 ML 100 ML 100 ML
Leggere, Read: 450 - 405 nm.

- 24 -
M122 - Rev. 04 Oct. 2003
− RADIM SpA - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia – Tel.: 0039/06/91249.1 -
Fax: 0039/06/91249.443; National Order Entry: 0039/06/91249.702; Export Dept.:
0039/06/91249.701; Customer Care: 0039/06/91249.700; www.radim.it
− RADIM Iberica S.A. - C.Lepanto, 339, Bajos, Local 7 - 08025 Barcelona – SPAIN –
Tel.: 0034-93-4367658 - -Fax: 0034-93-4364707; E-mail: radimibe@seric.es