CagA IgG EIA WELL REF K6HPG - Radim S.p.A.

CagA IgG EIA WELL
REF K6HPG
96
Italiano p. 3
English p. 12
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REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS
Reag. Quant.
MTP
1 x 96 Pronti per l'uso,
Ready for use
WASH
1 x 50 mL Conc.
DIL
CAL
CONJ
TMB
STOP
1 x 20 mL Conc.
6 x 1.5 mL Pronti per l'uso,
Ready for use
1 x 14 mL Pronto per l'uso,
Ready for use
2 x 15 mL Pronto per l'uso,
Ready for use
1 x 14 mL Pronto per l'uso,
Ready for use
"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito
Internet all'indirizzo www.radim.com".
“The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our
website www.radim.com".
“Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην
ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com".
“In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website
unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden”.
"Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à
l'adresse www.radim.com”.
“Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en
nuestro sitio Internet www.radim.com”.
"As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas
no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com."
K6HPG –CagA IgG EIA WELL
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DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE
QUANTITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-CagA NEL SIERO O PLASMA
UMANO.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
1. APPLICAZIONI CLINICHE
L'Helicobacter pylori è un piccolo batterio gram-negativo, a forma di "S" che
infetta la mucosa gastrica del 20-80% della popolazione umana. La prevalenza
dell'infezione da H. pylori aumenta con l'età e dipende da diversi fattori, come la
localizzazione geografica e il livello socioeconomico. Questo batterio provoca
gastrite cronica e acuta, ulcera peptica, gastrite atrofica e si sospetta che abbia
un ruolo nell'insorgenza dell'adenocarcinoma gastrico. L'infezione da H. pylori, se
non viene eradicata con uno specifico trattamento antibiotico, persiste per tutta la
vita. In pazienti con ulcera gastrica o duodenale, l'eradicazione dell'H. pylori
produce una netta riduzione della frequenza di recidive. Tuttavia, sebbene
pressoché tutte le persone infette sviluppino una gastrite, rimane ancora da
chiarire il motivo per cui la maggior parte dei pazienti infettati da H. pylori rimane
asintomatica, e solo in una minoranza di essi l'infezione porti ad una ulcera
gastrica o duodenale. Ciò può essere dovuto sia a fattori propri dell'ospite (fumo,
gruppo sanguigno 0, sesso maschile) sia all'eterogeneità dei ceppi di H. pylori. E'
stato recentemente scoperto che circa il 50-60 % dei ceppi di H. pylori produce
una citotossina vacuolizzante di 87 kDa (VacA) insieme ad una proteina
fortemente antigenica di circa 120-128 kDa (CagA), mentre ceppi che non
producono la citotossina hanno il gene che la codifica ma mancano del gene che
codifica il CagA. Diversi studi hanno dimostrato che ceppi producenti la
citotossina vengono isolati con frequenza maggiore da soggetti con ulcera peptica
che da soggetti con dispepsia non ulcerativa. In studi sierologici, le IgG anti-CagA
sono state rilevate in pazienti infetti da H. pylori con ulcera peptica molto più
frequentemente che in persone infette con semplice gastrite. Pertanto, la
presenza di IgG anti-CagA nel siero del paziente indica una precedente infezione
da H. pylori di ceppo CagA positivo, e la determinazione di questi anticorpi può
utilmente indirizzare le decisioni terapeutiche.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come
marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli anticorpi
anti-CagA della classe IgG eventualmente presenti nel campione in esame si
legano all'antigene adeso alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene
eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione si fa reagire un
secondo anticorpo (anti-IgG umane coniugate alla perossidasi) con il complesso
formatosi tra antigene ed anticorpo anti-CagA. Dopo ulteriore lavaggio viene
aggiunta una soluzione di Cromogeno incolore (tetrametilbenzidina, TMB) in
Tampone Substrato, che reagendo con la perossidasi presente produce un
composto colorato. La reazione di sviluppo del colore è bloccata con l'aggiunta di
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H2SO4 e l'intensità del colore, misurata mediante spettrofotometro a 450 e a 405
nm, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi IgG anti-CagA
presenti nei calibratori e nei campioni in esame.
3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA'
− I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti.
− Il kit deve essere conservato a 2-8°C.
− La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta.
− Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8°C.
3.1 Reagenti Specifici
• MTP Micropiastra sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, divisibili
singolarmente, sensibilizzati con antigene CagA (ottenuto da DNA
ricombinante). I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8°C
nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente.
• CAL Calibratori: 6 flaconi (1.5 mL) di IgG anti-CagA in matrice sierica alle
seguenti concentrazioni: 0, 15, 30, 60, 120 e 240 RU/mL. Pronti per l'uso e
colorati in rosso. Conservante: NaN3 (

4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
4.1 Dosaggio Manuale
− Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile.
− Stufa termostatata a 37±2°C.
− Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi.
− Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle
micropiastre.
− Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in
assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm.
− Carta millimetrata.
− H2O distillata.
4.2 Dosaggio Automatico
− Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA
su micropiastra.
− Si garantisce l’applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC
− Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità
dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le
seguenti norme:
− Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti.
− E’ possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti.
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di
inquinamento.
− Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni
metallici o sostanze ossidanti.
− Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente
puliti.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile
usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
− Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del
test. Eventuale non rispetto di:
• sequenza e quantità nell’aggiunta dei reattivi
• tempi e temperatura di incubazione
può dare luogo a risultati clinici errati.
− Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle
etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare
l’ottenimento di dati clinici non attendibili.
− In caso di procedura manuale è importante l’utilizzo di pipette calibrate e
possedere un’adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una
buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E’
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necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l’apparecchiatura automatica
per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio
non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei
campioni. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente
funzionante. L’utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non
puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente
possibile misclassificazione degli stessi. E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente
funzionante. L’incubazione a temperature diverse da 37±2°C può dare luogo a
perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o
campioni). E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata.
− Assicurarsi che l’agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente
funzionante. L’agitazione in condizione diverse dall’atteso può dare luogo a
misclassificazione dei campioni . E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni
e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a
temperature diverse dall’atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei
materiali (reattivi e/o campioni). E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della
temperatura registrata.
− Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni.
Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del
dispositivo che risultati analitici errati.
Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare
le seguenti norme di sicurezza:
− Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale
potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
− Non pipettare i reagenti con la bocca.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del
dosaggio.
− Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con
cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di
incidente lavare abbondantemente con acqua.
− I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono
stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-HIV e anti-HCV e sono risultati
ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile
garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da
immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti
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contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere
considerati potenzialmente infettivi.
− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si
verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una
concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato
come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità
opportune.
− La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con
il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente
esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere
abbondante acqua sui reagenti eliminati.
− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive
CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da
lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi
con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati
affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma umano. Campioni
moderatamente lipemici non influenzano i risultati del dosaggio; campioni
fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di
filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni
siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati
per un periodo non superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-
8°C, a-20°C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare
ripetutamente i campioni.
Prima dell'uso, diluire i campioni 1:300 con il Diluente dei Campioni
precedentemente preparato (es. 10 µL di campione + 2990 µL di diluente).
7. PROCEDIMENTO OPERATIVO *
− Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente.
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− Agitare i campioni per inversione prima dell'uso.
7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori e Campioni.
7.2 Dispensare 100 µL di Calibratori e Campioni precedentemente diluiti, nei
rispettivi pozzetti.
N.B.: i Calibratori non devono essere diluiti.
7.3 Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni nel pozzetto del Bianco.
7.4 Incubare per 60±5 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il
copripiastra adesivo fornito nel kit.
7.5 Effettuare 4 lavaggi con un volume di 350 µL per pozzetto, impiegando la
Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i
pozzetti.
7.6 Dispensare 100 µL di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti.
7.7 Incubare per 30±2 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il
copripiastra adesivo fornito nel kit.
7.8 Lavare i pozzetti come al punto 7.5.
7.9 Dispensare 100 µL di Cromogeno in tutti i pozzetti.
7.10 Incubare per 15 minuti a 37±2°C al riparo dalla luce.
7.11 Dispensare 100 µL di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti.
7.12 Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro
preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm
(azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow,
utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere
effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio.
* Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per
micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale.
8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 23
9. CALCOLO DEI RISULTATI *
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Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le
concentrazioni dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per
ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative
a ciascun campione, si otterranno le corrispondenti concentrazioni di IgG anti-
CagA, espresse in RU/mL.
− I campioni con valori inferiori a 10 RU/mL sono da considerare non reattivi per
gli anticorpi IgG anti-CagA.
− I campioni con valori compresi tra 10 e 15 RU/mL sono da considerare
debolmente reattivi.
− I campioni con valori superiori a 15 RU/mL sono da considerare reattivi per gli
anticorpi IgG anti-CagA.
* Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC,
la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda:
450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura.
9.1 Esempio di Calcolo
I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non
devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali.
Descrizione Assorbanza 450 nm IgG anti-CagA
Calibratore 0 RU/mL 0.030
Calibratore 15 RU/mL 0.225
Calibratore 30 RU/mL 0.430
Calibratore 60 RU/mL 0.815
Calibratore 120 RU/mL 1.540
Calibratore 240 RU/mL 2.210
Campione 0.935 70 RU/mL
Interpolando sulla curva di calibrazione, il campione dosato risulta avere un titolo
di IgG anti-CagA di 70 RU/mL.
9.2 Criteri di Accettazione
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Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le assorbanze dei controlli
rispettino i seguenti valori:
Descrizione Valore atteso
Controllo Negativo < 0.100
OD Cal 240 RU/mL / OD Cal 15 RU/mL > 2,5
OD Cal 15 RU/ mL / OD Cal 0 RU/mL > 3,5
Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio.
9.3 Interpretazione dei Risultati
I campioni reattivi e/o debolmente reattivi sono da considerare positivi per gli
anticorpi IgG anti-CagA, indicando che il paziente è portatore di infezione da H.
pylori di ceppo CagA positivo.
I campioni non reattivi sono da considerare negativi per gli anticorpi IgG anti-
CagA, indicando che il paziente non è portatore di infezione da H. pylori oppure è
portatore di infezione da H. pylori di ceppo CagA negativo.
10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
10.1 Specificità Diagnostica
La specificità diagnostica è stata valutata rispetto al Western Blot, su un pannello
di campioni veri negativi per quanto riguarda gli anticorpi IgG anti-CagA, ed è
risultata essere del 100%.
10.2 Sensibilità Diagnostica
La sensibilità diagnostica è stata valutata rispetto al Western Blot, su un pannello
di campioni veri positivi per quanto riguarda gli anticorpi IgG anti-CagA, ed è
risultata essere del 93.7%.
10.3 Precisione
La precisione é stata valutata misurando la ripetibilità e la riproducibilità
(variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG
anti-CagA.
Ripetibilità (Intra-saggio)
Campioni Media ± D.S. C.V. Replicati
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(RU/mL) % n.
a 37.9 ± 4.0 10.6 10
b 85.6 ± 8.5 10 10
c 172.6 ± 11.2 6.5 10
Riproducibilità (Inter-saggio)
Campioni Media ± D.S. C.V. Dosaggi
(RU/mL) % n.
a 42.9 ± 3.5 8.3 10
b 87.4 ± 7.5 8.6 10
c 171.5 ± 17.2 10 10
11. LIMITI DEL DOSAGGIO
Il dosaggio deve essere considerato soltanto come test sierologico per la ricerca
di anticorpi specifici anti-CagA di classe IgG. La diagnosi di gastrite e di ulcera
peptica deve essere stabilita mediante valutazioni cliniche ed ulteriori prove
diagnostiche. Dopo eradicazione dell'H. pylori gli anticorpi specifici (tra cui anche
le IgG anti-CagA) persistono in circolo per alcuni mesi; pertanto il test può
risultare positivo anche in pazienti in cui l'infezione sia stata completamente
risolta da una terapia appropriata.
12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20
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ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ANTI-
CagA IgG ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA.
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
1. CLINICAL APPLICATIONS
Helicobacter pylori is a small, S-shaped gram-negative bacterium that infects the
gastric mucosa in 20-80% of the human population. The prevalence of H. pylori
infection increases with age and depends on several factors, such as geographic
area and socioeconomic status. This bacterium causes chronic as well as acute
gastritis, peptic ulcer disease, atrophic gastritis and it is suspected to have a role
in gastric adenocarcinoma. H. pylori infection persists throughout lifetime, when
not eradicated by specific antibiotic treatment. In patients with gastric or duodenal
ulcers, H. pylori eradication results in a marked reduction of the recurrence rate.
Nevertheless, although nearly all infected individuals develop gastritis, it remains
unclear why most H. pylori-infected patients remain asymptomatic. In fact, it is
only in a minority of these patients that the infection leads to gastric or duodenal
ulcer. This may be due to several host factors (smoking, 0 blood type, male
gender) and also to the heterogeneity among H. pylori strains. It has recently
been discovered that approximately 50 to 60 % of H. pylori strains produce a 87
kDa vacuolating cytotoxin (VacA) together with a highly antigenic protein of about
120-128 kDa (CagA). On the other hand, strains that do not produce the cytotoxin
do have the cytotoxin gene but lack the gene coding for CagA. Several studies
have demonstrated that cytotoxin producing strains are isolated more frequently
from subjects with peptic ulcer disease, rather than from subjects with non-ulcer
dyspepsia. In serological studies, IgG against CagA have been detected in H.
pylori-infected subjects with peptic ulcer disease much more recurrently than in
infected individuals, with mere gastritis. Accordingly, the detection of anti-CagA
IgG in patient serum indicates previous infection by a CagA-positive H. pylori
strain. This may be a helpful tool in therapeutical decisions.
2. PRINCIPLE OF THE ASSAY
This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where
horseradish peroxidase is used as enzyme conjugate. During the first incubation,
the sample anti-CagA IgG antibodies, if any, are bound to the CagA antigen
coated wells. A wash cycle eliminates all unbound material. In the incubation that
follows, a second antibody (anti-human IgG conjugated with peroxidase) will bind
to the CagA-antigen-antibody complex. After a further wash cycle a colorless
Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a substrate-buffer is added to
the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the peroxidase
enzyme. Color development will be stopped by adding H2SO4. The color intensity,
measured in a spectrophotometer at 450 and 405 nm, will thus be directly
proportional to the anti-CagA IgG antibody concentration in calibrators and
samples.
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3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY
− The reagents are sufficient for 96 wells.
− Store the kit at 2-8°C.
− The expiry date of each reagent is shown on the vial label.
− Once opened, the kit is stable at 2-8°C for 2 months.
3.1 Specific Reagents
• MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with
CagA antigen (obtained by recombinant DNA). Keep unused wells at 2-8°C
in the provided plastic bag and accurately sealed.
• CAL Calibrators: 6 vials (1.5 mL) of anti-CagA IgG in serum matrix at the
following concentrations: 0, 15, 30, 60, 120 and 240 RU/mL. Ready for use
and red-colored. Preservative: NaN3 (< 0.1%).
• CONJ Enzyme Conjugate: 1 vial (14 mL) of mouse monoclonal anti-human
IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) in TRIS buffer with
stabilizers. Ready for use and pink-colored. Preservative: Neomycin.
3.2 Common Reagents for kits of the following Lines: To.R.C.H.–S.T.D.,
Child Disease, Gastroenteric Disease and Celiac Disease
• WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 mL) of PBS-Tween
20. Preservative: Thimerosal (

4.1 Manual Test
− Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips.
− Dry Heater, adjustable at 37±2°C.
− Graduated cylinders for reagent dilution.
− Aspiration pump or automated well washing device.
− Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a 0-
3.0 A interval at 450 nm and 405 nm.
− Millimetric graph paper.
− Distilled H2O.
4.2 Automatic Test
− This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate.
− We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments.
− While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is
under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for
ELISA kits.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must
be observed:
− Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots.
− It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots.
− Do not use reagents beyond their expiry date.
− Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of
possible contamination.
− Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing
substances.
− Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers.
− Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose,
disposable tips should be used for each sample and reagent.
− Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect:
• exact incubation times and quantities adding the reagents
• incubation times and temperature
may cause incorrect clinical results.
− Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative
labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability
of results obtained.
− In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and
have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision
preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is
in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly
maintained.
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− Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect
working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples
classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The
use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a
wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications.
Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The
incubation temperature different from 37±2°C may cause a sensitivity losses
and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the
equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded
temperature.
− Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order.
Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the
equipment used is in perfect working order.
− Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in
perfect working order. The storage at different suggested temperature may
cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that
the equipment used is in perfect working order and periodically check the
recorded temperature.
− Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples.
Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong
clinical results.
In order to avoid personal and environmental contamination, the following
precautions must be observed:
− Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while
performing the assay.
− Do not pipette reagents by mouth.
− Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
− Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact
with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly
with running water.
− All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative
for HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. Since no test at present can guarantee
complete absence of these viruses, all samples and reagents containing
biological material used for the assay must be considered potentially
infectious.
− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a
3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated
as potentially infectious and disposed of accordingly.
− Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of
explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be
discarded by flushing the drain with large amounts of water.
− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with
EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products
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originating from either manual and/or automated processing are classified as
hazardous special waste material (European classification code180103). As
such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for
waste collection and disposal.
6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The assay can be performed in serum or plasma samples. Moderately lipemic
samples do not influence the results; highly lipemic or hemolyzed samples may
affect the results. The presence of fibrin filaments could interfere with the assay;
make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples
properly stored at 2-8°C for 1 week; for longer periods it is advisable to freeze
samples at -20°C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided.
Before use, dilute samples 1:300 with previously diluted Sample Diluent (ex.10 µL
sample + 2990 µL Diluent).
7. ASSAY PROCEDURE*
− Allow reagents and samples to warm up to room temperature.
− Mix samples by inversion before use.
7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators and Samples.
7.2 Pipette 100 µL of Calibrators and previously diluted Samples into the
corresponding wells.
Note: Calibrators must not be diluted.
7.3 Pipette 100 µL of Sample Diluent into the Blank well.
7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 60±5 minutes at 37±2°C.
7.5 Wash the wells 4 times with 350 µL of diluted Washing Solution. Aspirate all
liquid from the wells.
7.6 Add 100 µL of Enzyme Conjugate into all wells.
7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 30±2 minutes at 37±2°C.
7.8 Wash the wells as described in point 7.5.
7.9 Pipette 100 µL of Chromogen into all wells.
7.10 Incubate for 15 minutes at 37±2°C. Avoid direct light exposure.
7.11 Dispense 100 µL of Blocking Reagent into each well.
7.12 Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic
spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting
the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance
values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from
the end of the assay.
* While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for
microplates, refer to its relative manual.
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8. ASSAY SCHEME: see p. 23
9. CALCULATION OF RESULTS*
Draw a calibration curve on linear graph paper, by plotting the calibrator
concentrations (x-axis) against the absorbances obtained for each calibrator (yaxis).
Corresponding anti-CagA IgG concentrations in RU/mL are obtained by
interpolating the absorbance of each sample on the calibration curve.
− Samples with IgG values less than 10 RU/mL must be considered as nonreactive
for anti-CagA IgG antibodies.
− Samples with IgG values within 10 to 15 RU/mL must be considered as weakly
reactive.
− Samples with IgG values higher than 15 RU/mL must be considered as
reactive for anti-CagA IgG antibodies.
* While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the
spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different
wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range.
9.1 Calculation Example
The following values must be taken as an example and should not be used in
place of experimental values.
Description Absorbance 450 nm anti-CagA IgG
Calibrator 0 RU/mL 0.030
Calibrator 15 RU/mL 0.225
Calibrator 30 RU/mL 0.430
Calibrator 60 RU/mL 0.815
Calibrator 120 RU/mL 1.540
Calibrator 240 RU/mL 2.210
Sample 0.935 70 RU/mL
By interpolation on the calibration curve, the resulting sample anti-CagA IgG titer
was 70 RU/mL.
9.2 Validation Criteria
Before proceeding in calculating the results, make sure the control absorbances
are included within the following expected values:
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Description Expected values
Negative Control < 0.100
OD Cal 240 RU/mL / OD Cal 15 RU/mL > 2.5
OD Cal 15 RU/ mL / OD Cal 0 RU/mL >3.5
If the values obtained are not as expected, it will be necessary to repeat the
assay.
9.3 Interpretation of Results
Reactive and/or questionable samples are to be considered positive for anti-CagA
IgG antibodies, thus indicating that the patient is infected by a CagA-positive H.
pylori strain.
Non-reactive samples are to be considered negative for anti-CagA IgG antibodies,
which indicates that the patient is either not infected by H. pylori, or else is
infected by a CagA-negative H. pylori strain.
10. PERFORMANCES OF THE ASSAY
10.1 Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity of the method was evaluated with respect to a Western
Blot assay, over a panel of true negative sera for anti-CagA IgG antibodies. The
result was 100%.
10.2 Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity of the method was evaluated with respect to a Western
Blot assay, over a panel of true positive sera for anti-CagA IgG antibodies. The
result was 93.7%.
10.3 Precision
Precision was evaluated determining the repeatability and the reproducibility of
the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different anti-CagA IgG
concentrations.
Repeatability (Intra-assay)
Sample Mean ± S.D. C.V. Replicates
(RU/mL) % no.
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a 37.9 ± 4.0 10.6 10
b 85.6 ± 8.5 10 10
c 172.6 ± 11.2 6.5 10
Reproducibility (Inter-assay)
Sample Mean ± S.D. C.V. Assays
(RU/mL) % no.
a 42.9 ± 3.5 8.3 10
b 87.4 ± 7.5 8.6 10
c 171.5 ± 17.2 10 10
11. LIMITS OF THE ASSAY
The assay must be considered only as a serological test for the detection of
specific anti-CagA IgG antibodies. Diagnosis of gastritis and peptic ulcer must be
established by specific clinical evaluation and further diagnostic testing. After H.
pylori eradication, the specific antibodies (including anti-CagA IgG) persist in
circulation for several months. Thus the test may give positive results even in
patients in which the infection was totally resolved by proper treatment.
12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20
SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE,
ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER
EN 980 - EDMA
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REF Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou
numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou
número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός
προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční
nebo objednací číslo
LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže
IVD
96
RDATE
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de caducidad /
Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma
targhi / datum expirace
Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic
in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro /
Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro
διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro
Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according
to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD
98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-CE
segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD
Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD
98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD
98/79/EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a 2-
8°C / conservar a 2-8°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C / 2-
8°C da saklayınız / skladovat při 2-8°C
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante /
produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico /
Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky
nebezpečné
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter
le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as
instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε
τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k
použití
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96
déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para
96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için
yeterli / dostačující pro 96 testů
Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de
referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία
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RCNS
H2O
βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum
Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con /
reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma /
rekonstituovat
Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée
ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada
/ Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο
νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda
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BIBLIOGRAFIA - REFERENCES
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2 - Graham D.Y., Lew G.M., Klein P.D., Evans D.G., Evans D.J., Saeed Z.A. and
Malaty H.M.: Effect of treatment of Helicobacter pylori infection on the longterm
recurrence of gastric or duodenal ulcer: a randomized, controlled study.
Ann. Intern. Med. 116:705-708, 1992.
3 - Tummuru M.K.R., Cover T.L. and Blaser M.J.: Cloning and expression of a
high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage
to cytotoxin production. Infect. Immun. 61:1799-1809, 1993:
4 - Cover T.L., Glupczynski Y., Lage A.P., Burette A., Tummuru M.K.R., Perez-
Perez G.I. and Blaser M.J.: Serological detection of infection with CagA+
Helicobacter pylori strains. J. Clin. Microbiol. 33:1496-1500, 1995.
5 - Tee W., Lambert J.R. and Dwyer B.: Cytotoxin production by Helicobacter
pylori from patients with upper gastrointestinal tract diseases. J. Clin.
Microbiol. 33:1203-1205, 1995.
6 - Husson M.O., Gottrand F., Vachee A., Dhaenens L., De La Salle E.M., Turck
D., Houcke M. and Leclerc H.: Importance in diagnosis of gastritis of
detection by PCR of the CagA gene in Helicobacter pylori strains isolated
from children. J. Clin. Microbiol. 33:3300-3303, 1995.
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8. SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME
Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/300
Pozzetti
Wells
Bianco
Blank
CAL Campioni
Samples
(dil.)
Reag.
CAL ----- 100 µL -----
Campioni (diluiti)
Diluted Samples
----- ----- 100 µL
DIL 100 µL ----- -----
− Incubare, Incubate: 37±2°C, 60±5 min.
− Aspirare e Lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
CONJ 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: 37±2°C, 30±2 min.
− Aspirare e Lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
TMB 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: 37±2°C, 15'
STOP 100 µL 100 µL 100 µL
− Leggere, Read: 450-405 nm.
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RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
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