GLIADINA IgG EIA WELL REF - Radim S.p.A.

GLIADINA IgG
REF K9GG
EIA WELL
96
Italiano p. 3
English p. 12
M130 – Rev.9 – 05/2008 – Pag. 1/24

REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS
Reag. Quant
MTP
WASH
DIL
CAL
CONJ
TMB
STOP
1 x 96 Pronti per l'uso,
Ready for use
1 x 50 mL Conc
1 x 20 mL Conc
2x (4 x 1 mL) Liof,
Lyoph
1 x 14 mL Pronto per l'uso
Ready for use
2 x 15 mL Pronto per l'uso
Ready for use
1 x 14 mL Pronto per l'uso
Ready for use
"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito
Internet all'indirizzo www.radim.com".
“The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our
website www.radim.com".
“Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην
ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com".
“In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website
unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden”.
"Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à
l'adresse www.radim.com”.
“Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en
nuestro sitio Internet www.radim.com”.
"As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas
no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com."
K9GG – GLIADINA IgG EIA WELL
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DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE
QUANTITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-GLIADINA NEL SIERO O
PLASMA UMANO.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
1. APPLICAZIONI CLINICHE
Il glutine è una componente proteica della farina di grano e di altri cereali. In
soggetti con intolleranza al glutine, in seguito all'ingestione di cereali, si instaura
una enteropatia denominata malattia celiaca, caratterizzata da vari disturbi
digestivi (malassorbimento intestinale, diarrea), da ritardo della crescita e a volte
da dermatite erpetiforme.
A livello anatomico, la malattia celiaca è accompagnata da atrofia dei villi della
mucosa dell'intestino tenue, ipertrofia delle cripte ed ipercellularità della mucosa.
La presenza di queste lesioni, rilevabili mediante biopsia dell'intestino tenue,
consente di effettuare una diagnosi certa di malattia celiaca. Secondo il protocollo
diagnostico proposto nel 1970 dell'European Society for Paediatric
Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN), si richiede, ai fini di una diagnosi
definitiva, l'esecuzione di tre biopsie; prima e dopo l'eliminazione totale del glutine
della dieta (per osservare la normalizzazione della mucosa intestinale) e dopo
una nuova introduzione di glutine nella dieta (per osservare la ricomparsa delle
lesioni caratteristiche). Una diagnosi preliminare di malattia celiaca può essere
effettuata determinando quantitativamente la presenza nel siero del paziente di
anticorpi di classe IgA e IgG diretti contro la Gliadina, una componente del glutine.
Esiste infatti una forte associazione tra malattia celiaca e presenza di elevati titoli
anticorpali di IgA e IgG anti-Gliadina; pertanto il dosaggio di questi anticorpi può
essere utilizzato sia come depistage per indirizzare o meno il paziente
all'esecuzione della biopsia, sia come follow-up per controllare, dopo remissione
della malattia, il rispetto della dieta priva di glutine da parte del paziente.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come
marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli anticorpi
anti-Gliadina della classe IgG eventualmente presenti nel siero in esame, si
legano alla Gliadina adesa alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene
eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi anti-
IgG umane, coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso
precedentemente formatosi tra antigene ed anticorpo anti-Gliadina. Dopo ulteriore
lavaggio, viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la
perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del
colore è bloccata con l'aggiunta di H2SO4 e l'intensità del colore, misurata
mediante spettrofotometro a 450 nm e a 405 nm, è direttamente proporzionale
alla concentrazione di anticorpi IgG anti-Gliadina presenti nei calibratori e nei
campioni in esame.
3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA'
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− I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti.
− Il kit deve essere conservato a 2-8°C.
− La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta.
− Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8°C.
3.1 Reagenti Specifici
• MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, divisibili
singolarmente, sensibilizzati con Gliadina. I pozzetti non utilizzati devono
essere conservati a 2-8°C nella bustina di plastica trasparente fornita,
sigillata accuratamente.
• CAL Calibratori: 2 set ciascuno costituito da 4 flaconi contenenti IgG anti-
Gliadina in matrice sierica, alle seguenti concentrazioni: 0, 50, 100 e 200
UR/mL. Conservante: NaN3 (

− Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile.
− Stufa termostatata a 37±2°C.
− Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi.
− Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle
micropiastre.
− Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in
assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm.
− Carta millimetrata.
− H2O distillata.
4.2 Dosaggio Automatico
− Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA
su micropiastra.
− Si garantisce l’applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC
− Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità
dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le
seguenti norme:
− Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti.
− E’ possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti.
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di
inquinamento.
− Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni
metallici o sostanze ossidanti.
− Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente
puliti.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile
usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
− Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del
test. Eventuale non rispetto di:
• sequenza e quantità nell’aggiunta dei reattivi
• tempi e temperatura di incubazione
può dare luogo a risultati clinici errati.
− Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle
etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare
l’ottenimento di dati clinici non attendibili.
− In caso di procedura manuale è importante l’utilizzo di pipette calibrate e
possedere un’adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una
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uona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E’
necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l’apparecchiatura automatica
per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio
non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei
campioni. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente
funzionante. L’utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non
puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente
possibile misclassificazione degli stessi. E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente
funzionante. L’incubazione a temperature diverse da 37±2°C può dare luogo a
perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o
campioni). E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata.
− Assicurarsi che l’agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente
funzionante. L’agitazione in condizione diverse dall’atteso può dare luogo a
misclassificazione dei campioni . E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni
e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a
temperature diverse dall’atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei
materiali (reattivi e/o campioni). E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della
temperatura registrata.
− Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni.
Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del
dispositivo che risultati analitici errati.
Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare
le seguenti norme di sicurezza:
− Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale
potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
− Non pipettare i reagenti con la bocca.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del
dosaggio.
− Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con
cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di
incidente lavare abbondantemente con acqua.
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− I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono
stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-HIV e anti-HCV e sono risultati
ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile
garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da
immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti
contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere
considerati potenzialmente infettivi.
− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si
verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una
concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato
come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità
opportune.
− La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con
il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente
esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere
abbondante acqua sui reagenti eliminati.
− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive
CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da
lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi
con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati
affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma umano. Campioni
moderatamente lipemici non influenzano i risultati del dosaggio; campioni
fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di
filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni
siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati
per un periodo non superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-
8°C, a - 20°C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare
ripetutamente i campioni.
Prima dell'uso, diluire i campioni 1:300 con il Diluente dei Campioni
precedentemente preparato (es. 10 µL di campione + 2990 µL di diluente).
7. PROCEDIMENTO OPERATIVO *
− Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente.
− Agitare i campioni per inversione prima dell'uso.
7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori e Campioni.
7.2 Dispensare 100 µL di Calibratori ricostituiti e 100 µL di Campioni
precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti.
7.3 Dispensare 100 µL di Diluente Campioni diluito nel pozzetto del Bianco.
7.4 Incubare per 60±5 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il
copripiastra adesivo fornito nel kit.
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7.5 Effettuare 4 lavaggi con un volume di 350 µL per pozzetto, impiegando la
Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i
pozzetti.
7.6 Dispensare 100 µL di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti.
7.7 Incubare per 30±2 minuti a 37±2°C, coprendo la micropiastra con il
copripiastra adesivo fornito nel kit.
7.8 Lavare i pozzetti come al punto 7.5.
7.9 Dispensare 100 µL di Cromogeno in tutti i pozzetti.
7.10 Incubare per 10 minuti a 37±2°C o 15 minuti a temperatura ambiente
(18-25°C), al riparo dalla luce.
7.11 Dispensare 100 µL di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti.
7.12 Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro
preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm
(azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow,
utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere
effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio.
* Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per
micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale.
8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 23
9. CALCOLO DEI RISULTATI *
Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le
concentrazioni dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per
ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative
a ciascun campione, si otterranno le corrispondenti concentrazioni di IgG anti-
Gliadina, espresse in UR/mL.
* Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC,
la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda:
450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura.
9.1 Esempio di Calcolo
I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non
devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali.
Descrizione Assorbanza 450 nm IgG anti-Gliadina
Calibratore 0 UR/mL 0.090
Calibratore 50 UR/mL 0.885
Calibratore 100 UR/mL 1.484
Calibratore 200 UR/mL 2.150
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Campione 0.835 47 UR/mL
Interpolando sulla curva di calibrazione, il campione dosato risulta avere un titolo
di IgG anti-Gliadina di 47 UR/mL.
9.2 Criteri di Accettazione
Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le assorbanze rispettino i
seguenti valori:
Descrizione Valore atteso
OD Cal 200 UR/mL / OD Cal 50 UR/mL > 1.5
OD Cal 50 UR/mL / OD Cal 0 UR/mL > 2.34
Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio.
9.3 Interpretazione dei Risultati
I sieri di soggetti sani (senza nessuna patologia gastroenterica) presentano valori
di IgG anti-Gliadina compresi entro limiti variabili in funzione dell'età. Per
l'interpretazione dei risultati del test, si consigliano i seguenti valori normali:
Età
0 - 5 anni : ≤ 60 UR/mL
> 5 anni : ≤ 30 UR/mL
I campioni con valori di IgG compresi entro ± 10% del valore limite per la fascia di
età relativa sono da considerare di dubbia interpretazione.
10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
10.1 Specificità Diagnostica
La specificità diagnostica del metodo è stata valutata su un campione
rappresentativo di soggetti non immuni da infezione di Gliadina, risultando pari a
98.8%.
10.2 Sensibilità Diagnostica
La sensibilità diagnostica del metodo è stata valutata su un campione
rappresentativo di soggetti con infezione pregressa da Gliadina, risultando pari a
92.3%.
10.3 Precisione
La precisione é stata valutata misurando la ripetibilità e la riproducibilità
(variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG
anti-Gliadina.
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Ripetibilità (Intra-saggio)
Siero Media ± D.S. C.V. Replicati
(UR/mL) % n.
a 16.7 ± 0.92 5.5 14
b 72.9 ± 4.54 6.2 14
c 163.1 ± 8.99 5.5 14
Riproducibilità (Inter-saggio)
Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi
(UR/mL) % n.
a 18.2 ± 1.83 10 12
b 70 ± 5.13 7.3 12
c 168.3 ± 12.6 7.5 12
11. LIMITI DEL DOSAGGIO
La diagnosi definitiva di malattia celiaca può essere fatta solamente sulla base dei
risultati della biopsia dell'intestino tenue; occorre pertanto tenere presente che il
dosaggio delle IgA e IgG anti-Gliadina ha unicamente valore orientativo
nell'indirizzare i pazienti alla esecuzione della biopsia.
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Valori elevati di anticorpi anti-Gliadina possono essere presenti anche in altre
patologie gastroenteriche, quali il morbo di Crohn, la colite ulcerosa e l'esofagite.
Sono stati inoltre segnalati alcuni casi di malattia celiaca accompagnati da bassi
valori di IgA anti-Gliadina, causati da un deficit selettivo nella produzione di IgA.
12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20
ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETECTION OF GLIADIN IgG
ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA.
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
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1. CLINICAL APPLICATIONS
Gluten is a protein component found in wheatmeal and other cereals. In glutensensitive
subjects, cereal ingestion brings about an enteropathy known as celiac
disease, which is characterized by several gastroenterological disorders (intestinal
malabsorption, diarrhea) as well as growth retardation and dermatitis
herpetiformis. Anatomically speaking, celiac disease is accompanied by villous
atrophy of the small bowel mucosa, hypertrophic crypts and also excessive
amounts of mucosal cells. Mucosal biopsy of the small intestine is an essential
step for the diagnosis of celiac disease. According to the diagnostic protocol
suggested in 1970 by the European Society for Paediatric Gastroenterology and
Nutrition (ESPGAN), 3 biopsies are to be performed: before and after total gluten
withdrawal from diet (in order to observe normalized morphology of the mucosa)
and after further gluten challenge (to verify if the typical lesions reappear). A
preliminary diagnosis of celiac disease may be obtained by quantitative testing of
both IgA and IgG classes of anti-Gliadin antibodies (gliadin being a fraction of
gluten). There is in fact a definite link between celiac disease and high anti-Gliadin
IgG and/or IgA blood levels. Testing for these antibodies therefore represents
both a method to efficiently select biopsy candidates and also a way to make sure
the patient really follows a gluten-free diet, after recovery.
2. PRINCIPLE OF THE ASSAY
This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where
horseradish peroxidase is used as enzyme Conjugate. During the first incubation,
the sample anti-Gliadin IgG antibodies, if any, are bound to the Gliadin coated
wells. A wash cycle eliminates unbound material. In the incubation that follows, a
second antibody (anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase) will
bind to the Gliadin-antigen-antibody complex. After a further wash cycle a
colorless Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a substrate-buffer is
added to the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the
peroxidase enzyme. Color development will be stopped by adding H2SO4. The
color intensity, measured in a spectrophotometer at 450 nm, will thus be directly
proportional to the anti-Gliadin IgG antibody concentration in calibrators and
samples.
3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY
− The reagents are sufficient for 96 wells.
− Store the kit at 2-8°C.
− The expiry date of each reagent is shown on the vial label.
− Once opened, the kit is stable at 2-8°C for 2 months.
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3.1 Specific Reagents
• MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with
Gliadin. Keep unused wells at 2-8°C in the provided plastic bag and
accurately sealed.
• CAL Calibrators: 2 sets: 4 vials containing anti-Gliadin IgG in serum matrix,
at the following concentrations: 0, 50, 100 and 200 RU/mL. Preservative:
NaN3 (

4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
4.1 Manual Test
− Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips.
− Dry Heater, adjustable at 37±2°C.
− Graduated cylinders for reagent dilution.
− Aspiration pump or automated well washing device.
− Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a 0-
3.0 A interval at 450 nm and 405 nm.
− Millimetric graph paper.
− Distilled H2O.
4.2 Automatic Test
− This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate.
− We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments.
− While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is
under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for
ELISA kits.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must
be observed:
− Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots.
− It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots.
− Do not use reagents beyond their expiry date.
− Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of
possible contamination.
− Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing
substances.
− Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers.
− Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose,
disposable tips should be used for each sample and reagent.
− Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect:
• exact incubation times and quantities adding the reagents
• incubation times and temperature
may cause incorrect clinical results.
− Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative
labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability
of results obtained.
− In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and
have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision
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preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is
in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly
maintained.
− Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect
working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples
classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The
use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a
wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications.
Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The
incubation temperature different from 37±2°C may cause a sensitivity losses
and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the
equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded
temperature.
− Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order.
Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the
equipment used is in perfect working order.
− Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in
perfect working order. The storage at different suggested temperature may
cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that
the equipment used is in perfect working order and periodically check the
recorded temperature.
− Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples.
Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong
clinical results.
In order to avoid personal and environmental contamination, the following
precautions must be observed:
− Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while
performing the assay.
− Do not pipette reagents by mouth.
− Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
− Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact
with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly
with running water.
− All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative
for HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. Since no test at present can guarantee
complete absence of these viruses, all samples and reagents containing
biological material used for the assay must be considered potentially
infectious.
− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a
3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated
as potentially infectious and disposed of accordingly.
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− Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of
explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be
discarded by flushing the drain with large amounts of water.
− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with
EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products
originating from either manual and/or automated processing are classified as
hazardous special waste material (European classification code180103). As
such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for
waste collection and disposal.
6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The assay can be performed in serum or plasma samples. Moderately lipemic
samples do not influence the results; highly lipemic or hemolyzed samples may
affect the results. The presence of fibrin filaments could interfere with the assay;
make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples
properly stored at 2-8°C for 1 week; for longer periods it is advisable to freeze
samples at -20°C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided.
Before use, dilute samples 1:300 with diluted Sample Diluent (see REAGENTS).
Example: 10 µL sample + 2990 µL diluent.
7. ASSAY PROCEDURE*
− Allow reagents and samples to warm up at room temperature.
− Mix samples by inversion before use.
7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators and Samples.
7.2 Pipette 100 µL of reconstituted Calibrators and 100 µL of diluted Samples
into the corresponding wells.
7.3 Pipette 100 µL of diluted Sample Diluent into the Blank well.
7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 60±5 minutes at 37±2°C.
7.5 Wash the wells 4 times with 350 µL of diluted Washing Solution. Aspirate all
liquid from the wells.
7.6 Add 100 µL of Enzyme Conjugate into all wells.
7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 30±2 minutes at 37±2°C.
7.8 Wash the wells as described in point 7.5.
7.9 Pipette 100 µL of Chromogen into all wells.
7.10 Incubate the wells for 10 minutes at 37±2°C or 15 minutes at room
temperature (18-25°C). Avoid direct light exposure.
7.11 Pipette 100 µL of Blocking Reagent into all wells.
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7.12 Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic
spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting
the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance
values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from
the end of the assay.
* While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for
microplates, refer to its relative manual.
8. ASSAY SCHEME: see p. 23
9. CALCULATION OF RESULTS *
Draw a calibration curve on millimetric graph-paper, by plotting the calibrator
concentrations (x-axis) against their relative absorbances (y-axis). Corresponding
anti-Gliadin IgG concentrations in RU/mL are obtained by interpolating the
absorbances of each sample on the calibration curve.
* While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the
spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different
wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range.
9.1 Calculation Example
The following values must be considered as an example and should not be used
in place of experimental data.
Description Absorbance 450 nm Anti-Gliadin IgG
Calibrator 0 RU/mL 0.090
Calibrator 50 RU/mL 0.885
Calibrator 100 RU/mL 1.484
Calibrator 200 RU/mL 2.150
Sample 0.835 47 RU/mL
By interpolation, the tested sample will have an anti-Gliadin IgG titer of 47 RU/mL.
9.2 Validation Criteria
Before proceeding in calculating the results, make sure the absorbances are
included within the following expected values:
Description Expected values
OD Cal 200 RU/mL / OD Cal 50 RU/mL > 1.5
OD Cal 50 RU/mL / OD Cal 0 RU/mL > 2.34
If the values obtained are not as expected, it will be necessary to repeat the
assay.
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9.3 Interpretation of Results
Anti-Gliadin IgG levels in healthy subjects (no gastroenterological disorders) vary
with age. The following normal values are suggested for results interpretation:
Age
0 - 5 years : ≤ 60 RU/mL
> 5 years : ≤ 30 RU/mL
Patients with values within ± 10% of their normal age limit are considered
questionable.
10. PERFORMANCES OF THE ASSAY
10.1 Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity of the method was evaluated on a representative group
of individuals with no immunity against Gliadin infection. The result was 98.8%.
10.2 Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity of the method was evaluated on a representative group
of individuals having undergone past Gliadin infection. The result was 92.3%.
10.3 Precision
Precision was evaluated on a Radim instrument determining the repeatability and
the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at
different anti-Gliadin IgG concentrations.
Repeatability (Intra-assay)
Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates
(RU/mL) % no.
a 16.7 ± 0.92 5.5 14
b 72.9 ± 4.54 6.2 14
c 163.1 ± 8.99 5.5 14
Reproducibility (Inter-assay)
Serum Mean ± S.D. C.V. Assays
(RU/mL) % no.
a 18.2 ± 1.83 10 12
b 70 ± 5.13 7.3 12
c 168.3 ± 12.6 7.5 12
11. LIMITS OF THE ASSAY
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A certain diagnosis of celiac disease can only be done based upon mucosal
biopsy of the small intestine; anti-Gliadin IgA and IgG antibody testing will
therefore be indicative and may serve to correctly address a patient to such
biopsy.
High anti-Gliadin antibody titers may be found in other gastroenterological
diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis and esophagitis. Low levels of
anti-Gliadin IgA antibodies have been reported in several cases of celiac disease
due to a sort of selective IgA deficiency.
12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20
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M130 – Rev.9 – 05/2008 – Pag. 19/24

SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE,
ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER
EN 980 - EDMA
REF Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou
numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou
número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός
προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční
nebo objednací číslo
LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže
IVD
96
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de caducidad /
Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma
targhi / datum expirace
Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic
in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro /
Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro
διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro
Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according
to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD
98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-CE
segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD
Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD
98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD
98/79/EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a 2-
8°C / conservar a 2-8°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C / 2-
8°C da saklayınız / skladovat při 2-8°C
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante /
produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico /
Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky
nebezpečné
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter
le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as
instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε
τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k
použití
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96
déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para
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RDATE
RCNS
H2O
96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için
yeterli / dostačující pro 96 testů
Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de
referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία
βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum
Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con /
reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma /
rekonstituovat
Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée
ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada
/ Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο
νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda
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BIBLIOGRAFIA-REFERENCES
1 - Hill P.G., Thompson S.P. and Holmes G.K.T. (1991) IgA anti-Gliadin
antibodies in adult Celiac Disease. Clin. Chem., 37: 647-650.
2 - Juto P., Almlöf U., Hernell O. and Ahlstedt S. (1987) Evaluation of anti-
Gliadin IgA as a screening method for coeliac disease of children. Pediatric
Res., 22: 234.
3 - Grodzinsky E., Hed J., Lieden G., Sjögren F. and Ström M. (1990). Presence
of IgA and IgG anti-gliadin antibodies in healthy adults as measured by micro-
ELISA. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 92: 119 - 123.
4 - Troncone R. and Ferguson A. (1991). Anti-Gliadin antibodies. J. Ped.
Gastroenterol. Nutr., 12: 150.
5 - Holmes T.K.S., Prior P., Lane M.R., Pope D. and Allan R.N. (1989).
Malignancy in coeliac disease - effect of a gluten - free diet. Gut, 30: 333 -
338.
K9GG – GLIADINA IgG EIA WELL
M130 – Rev.9 – 05/2008 – Pag. 22/24

8. SCHEMA DEL DOSAGGIO-ASSAY SCHEME
Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/300.
Pozzetti
Wells
Bianco,
Blank
CAL (0 - 3) Campioni,
Samples
Reag
CAL (0 - 3) ---- 100 µL ----
Campioni, Samples ---- ---- 100 µL
DIL 100 µL ---- ----
− Incubare, Incubate: 37±2°C 60±5 min.
− Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
CONJ 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: 37±2°C 30±2 min.
− Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
TMB 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: 37±2°C 10'; oppure, or T.A./R.T. 15'
STOP 100 µL 100 µL 100 µL
− Leggere, Read: 450-405 nm.
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