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End point PCR<br />
vs<br />
quant<strong>it</strong>ative Real-Time PCR
PCR - Polymerase Chain Reaction<br />
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per<br />
questo, il premio Nobel per la chimica (1993).<br />
Questa tecnica, utilizzando i principi della<br />
duplicazione del DNA,<br />
permette di ottenere in poco tempo<br />
notevoli quant<strong>it</strong>à di materiale specifico
Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles<br />
2 copies<br />
4 copies<br />
8 copies<br />
DNA<br />
fragment<br />
to be<br />
amplified<br />
Resa: 2 n
Polymerase Chain Reaction: principio<br />
Amplificazione selettiva in v<strong>it</strong>ro di una<br />
sequenza di DNA target<br />
COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR:<br />
1) Sequenza di DNA target<br />
2) DNA polimerasi termostabile (Termophilus<br />
aquaticus, Taq polimerasi)<br />
3) Due Primers, oligonucleotidi sintetici (20-2525 bp)<br />
complementari a sequenze fiancheggianti il tratto<br />
di DNA da studiare<br />
4) dNTPs<br />
5) Ioni Mg++
Polymerase Chain Reaction: principio<br />
CICLI TERMICI:<br />
DENATURAZIONE<br />
(94-96<br />
96° °C)<br />
ANNEALING<br />
(50-65<br />
65° °C)<br />
EXTENSION<br />
(72°<br />
°C)
END POINT PCR<br />
Il campione si sottopone al numero di cicli stabil<strong>it</strong>i (30-40),<br />
alla fine della reazione un’aliquota si sottopone ad<br />
elettroforesi su gel di agorosio per verificare:<br />
1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso<br />
molecolare in bp mediante ladder)<br />
2. L’assenza di frammenti aspecifici<br />
3. La quant<strong>it</strong>à di amplificato ottenuto (proporzionale<br />
all’intens<strong>it</strong>à della banda)
PCR PHASES<br />
L’amplificazione di ogni target è defin<strong>it</strong>a da 3 fasi:<br />
1 – esponenziale; 2 – lineare; 3 – plateau.<br />
All reagents are<br />
present<br />
Some of the<br />
reagents start<br />
wearing out<br />
All the<br />
reagents<br />
finished<br />
Cycle
PCR: effetto plateau<br />
Il processo di duplicazione non procede “all’infin<strong>it</strong>o”,<br />
esso è lim<strong>it</strong>ato da:<br />
Quant<strong>it</strong>à dei primers, dNTP, MgCl 2 , Buffer<br />
Attiv<strong>it</strong>à della Taq polimerasi<br />
Reannealing dei filamenti<br />
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei<br />
prodotti
La PCR end-point non è un metodo<br />
quant<strong>it</strong>ativo ma qual<strong>it</strong>ativo.<br />
Alla fine della reazione non sempre la quant<strong>it</strong>à<br />
di DNA del campione d’origine è proporzionale<br />
all’intens<strong>it</strong>à della banda ottenuta.<br />
Utilizzando particolari accorgimenti può<br />
diventare un metodo semi-quant<strong>it</strong>ativo.
Polymerase Chain Reaction:<br />
vantaggi<br />
1) Veloc<strong>it</strong>à e facil<strong>it</strong>à d’uso<br />
In poche ore si possono ottenere milioni di copie<br />
della sequenza di DNA target<br />
2) Sensibil<strong>it</strong>à<br />
Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una<br />
singola cellula come template (contaminazione)<br />
3) Robustezza<br />
Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di<br />
bassa qual<strong>it</strong>à
Polymerase Chain Reaction:<br />
svantaggi<br />
1) Solo sequenze note<br />
Necessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per<br />
sintetizzare i primers.<br />
2) Dimensioni e quant<strong>it</strong>à lim<strong>it</strong>ate<br />
Dimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kb<br />
Quant<strong>it</strong>à lim<strong>it</strong>ata rispetto alle tecniche di clonaggio.<br />
3) Proofreading<br />
Taq polimerasi manca dell’attiv<strong>it</strong>à 3’→5’<br />
esonucleasica, 20 cicli di<br />
reazione su un frammento di 1 kb produrranno ∼40% di frammenti con<br />
una mutazione puntiforme (∼1/10000).<br />
4) Analisi in End Point ed effetto Plateau<br />
Per analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione;<br />
raggiunta la fase di plateau la quant<strong>it</strong>à di amplificato non è più<br />
proporzionale alla concentrazione iniziale di campione.
Soluzioni<br />
Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale in cui il<br />
prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale<br />
<br />
Questo è reso possibile mediante il rilevamento di una<br />
fluorescenza il cui accumulo segue la stessa cinetica della<br />
reazione di PCR e che, quindi, è proporzionale al prodotto di<br />
PCR<br />
<br />
Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la<br />
fluorescenza emessa da particolari fluorofori ad ogni ciclo.<br />
Quant<strong>it</strong>ative Real-time PCR
Quant<strong>it</strong>ative Real-time PCR<br />
Tecnica che consente la simultanea<br />
amplificazione e quantificazione del DNA<br />
target.<br />
AMPLIFICAZIONE:<br />
prevede essenzialmente gli step<br />
di una classica PCR<br />
QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui<br />
fluorescenza emessa ad ogni ciclo di<br />
reazione è proporzionale alla quant<strong>it</strong>à di<br />
amplificato.
Real-Time PCR: la reazione<br />
COMPONENTI DELLA REAZIONE:<br />
1) DNA target<br />
2) DNA polimerasi<br />
3) Due oligonucleotidi<br />
4) dNTPs<br />
5) Fluorocromo
Perché Real-Time?<br />
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la<br />
fase esponenziale della PCR, quando cioè<br />
l'efficienza di amplificazione è influenzata<br />
minimamente dalle variabili di reazione,<br />
permettendo di ottenere risultati molto più<br />
accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"
Chimiche fluorescenti<br />
per PCR Real-Time<br />
•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di<br />
diverse possibili reazioni chimiche<br />
•Le chimiche principali sono basate sia sul legame di<br />
coloranti fluorescenti che si intercalano al dsDNA, come il<br />
SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green
SYBR Green: principio<br />
SYBR Green I<br />
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si<br />
lega al solco minore di tutte le molecole di dsDNA.
SYBR Green<br />
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela<br />
di reazione contiene DNA denaturato, primers e la<br />
molecola fluorescente
SYBR Green<br />
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche<br />
molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green<br />
Durante l’elongazione si verifica un aumento di<br />
fluorescenza che corrisponde all’aumento del<br />
numero di copie dell’amplicone
SYBR green<br />
<br />
Metodica semplice<br />
Possono essere utilizzati primers in uso in qual<strong>it</strong>ativa<br />
<br />
Non costosa<br />
<br />
Non-specifica<br />
La molecola fluorescente si lega random a tutte le<br />
doppie eliche, includendo i dimeri di primers<br />
È necessario ottimizzare la metodica per ev<strong>it</strong>are la<br />
f o r m a z i o n e d i<br />
p r o d o t t i<br />
a s p e c i f i c i
Curva di dissociazione<br />
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati<br />
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene<br />
mon<strong>it</strong>orata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione<br />
•T T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’amplimero.<br />
•La presenza di una o più curve di dissociazione dipende dal fatto che la<br />
popolazione di amplimeri sia omogenea o eterogenea.<br />
•L’ampiezza del picco è proporzionale alla quant<strong>it</strong>à di amplificato.
TaqMan
TaqMan<br />
La Real-Time<br />
PCR si può realizzare mediante l’impiego:<br />
coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano<br />
i n<br />
m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o<br />
i l<br />
D N A<br />
sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di<br />
i n t e r e s s e ,<br />
m a r c a t e<br />
c o n<br />
m o l e c o l e<br />
f l u o r e s c e n t i<br />
Esistono diversi tipi di sonde:<br />
Dual-labeledlabeled (come le sonde TaqMan)<br />
Molecular beacons<br />
Scorpion<br />
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan<br />
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i<br />
primers della PCR, viene disegnato per essere<br />
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare<br />
3’<br />
5’<br />
5’<br />
Primer<br />
3’<br />
R<br />
Q<br />
5’ 3’<br />
Primer<br />
3’<br />
5’<br />
5’<br />
3’<br />
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno<br />
del frammento amplificato nella reazione di PCR
Forward<br />
Probe<br />
Reverse
Sonda TaqMan<br />
Presenta all’estrem<strong>it</strong>à 5’ un fluoroforo “Reporter”<br />
ed all’estrem<strong>it</strong>à 3’ una molecola “Quencher”<br />
5’<br />
3’
Reporter-Quencher<br />
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette<br />
fluorescenza<br />
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che<br />
spegne la fluorescenza del reporter<br />
R<br />
Q<br />
5’ 3’<br />
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R<br />
perchè i fotoni di R vengono assorb<strong>it</strong>i da Q
Reporter-Quencher<br />
Dye<br />
Quencher<br />
5,6 FAM BHQ-1/TAMRA<br />
HEX/JOE<br />
Texas Red/ROXBHQ-2<br />
Cy5/Quasar670<br />
BHQ-2<br />
BHQ-2 ( or-3)<br />
6-carbossifluoresceina<br />
6-carboss<strong>it</strong>etrametilrodamina
Real-Time PCR:<br />
attiv<strong>it</strong>à 5’>3’ esonucleasica<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
R<br />
Q<br />
5’<br />
R<br />
Q<br />
5’<br />
3’ 5’<br />
R<br />
Q<br />
5’<br />
3’ 5’
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente<br />
proporzionale al numero di ampliconi generati<br />
Forward primer<br />
Probe<br />
Reverse primer
RT-PCR quant<strong>it</strong>ativa<br />
•La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione<br />
viene rilevata e analizzata tram<strong>it</strong>e computer.<br />
Plot lineare<br />
Incremento di<br />
fluorescenza<br />
Cicli di PCR
Plot di amplificazione<br />
Normalised reporter fluorescence (R n )<br />
L i n e a s o g l i a s c e l t a<br />
d a l l ’ o p e r a t o r e<br />
In maniera da intersecare<br />
le curve di tutti i campioni<br />
nella fase esponenziale<br />
Indica il valore al di<br />
sopra del quale<br />
inizia l’accumulo di<br />
u n a m p l i f i c a t o<br />
PCR cycle number<br />
E’ il ciclo della reazione di<br />
amplificazione in cui il segnale<br />
di fluorescenza del campione è<br />
maggiore rispetto a quello<br />
d e l l a T h r e s h o l d
Curve di amplificazione<br />
Plot lineare<br />
Fluorescenza<br />
Cicli di amplificazione<br />
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il<br />
cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla<br />
quant<strong>it</strong>à di template iniziale
Quantificazione<br />
ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto<br />
Necess<strong>it</strong>a di standard di cui si conosce la concentrazione<br />
assoluta (utilizzo di una standard curve)<br />
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche<br />
quant<strong>it</strong>à di campioni<br />
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T<br />
Necess<strong>it</strong>a di controlli endogeni (non si utilizza una<br />
standard curve)<br />
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro<br />
∆C T con quello del controllo endogeno
Ct<br />
35<br />
Quant<strong>it</strong>ativa assoluta<br />
10 1<br />
10 2<br />
25<br />
unknown sample<br />
10 3<br />
10 4<br />
10 5<br />
10 6<br />
15<br />
3500 copies<br />
10 7<br />
1<br />
2 3 4 5 6 7<br />
log 10 template quant<strong>it</strong>y<br />
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un<br />
gene espresso cost<strong>it</strong>utivamente (β-actina,<br />
GAPDH, ATPs, β 2 etc)
Quant<strong>it</strong>ativa relativa<br />
Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il<br />
cambiamento di espressione di un gene target in un campione<br />
rispetto ad un altro campione scelto come calibratore.<br />
Plot di amplificazione<br />
Control<br />
Sample<br />
Numero di cicli<br />
∆C T
Quant<strong>it</strong>ativa relativa<br />
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:<br />
• TARGET – La sequenza di DNA da analizzare.<br />
• CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi<br />
comparativa (Trattato/non Trattato, campione al T0 in uno studio time course)<br />
• CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso cost<strong>it</strong>utivamente in tutti i<br />
campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quant<strong>it</strong>à di<br />
DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.
Quant<strong>it</strong>ativa relativa: analisi dei dati<br />
Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)<br />
espresso cost<strong>it</strong>utivamente (∆C T )<br />
Comparare ciascun ∆C T così ottenuto con il ∆C T di un<br />
calibratore (cb) (∆∆<br />
∆∆C T )<br />
2 - (∆CT,r- ∆CT, CT,cb) = 2<br />
- ∆∆CT<br />
Il valore così ottenuto permette di determinare la<br />
c o n c e n t r a z i o n e<br />
r e l a t i v a<br />
d e l t a r g e t
Step per il calcolo del 2 - ∆∆<br />
∆∆CT<br />
1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)<br />
Ct gene interesse – Ct HK = ∆Ct<br />
2. Normalizzazione con il calibratore<br />
∆Ct Campione – ∆Ct Calibratore = ∆∆Ct<br />
3. Applicare la formula 2 - ∆∆<br />
∆∆CT
ESEMPIO<br />
Campione Ct HK Ct gene terget<br />
(IL-10)<br />
Brain (calibratore) 14 32<br />
Liver 16 28<br />
Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?<br />
1. ∆Ct Brain = 18<br />
∆Ct Liver = 12<br />
2. ∆Ct campione – ∆Ct calibratore = 12-18 = -6<br />
3. 2 - ∆∆CT = 2 6 = 64<br />
L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!