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Il sequenziamento del DNA
Si può ottenere la massima informazione sulla struttura di una
molecola di DNA determinandone la sequenza nucleotidica completa
Il sequenziamento del DNA è una componente irrinunciabile di
praticamente qualunque tecnica di manipolazione genica
Determinare la sequenza di una particolare regione di DNA può
rappresentare un fine già di per sé (ad esempio se si voglia
studiare una mutazione ereditaria)
Ancora più importante è il fatto che le informazioni ottenute tramite
il sequenziamento sono la base indispensabile per la messa in atto
di qualsiasi procedura di manipolazione del DNA
La conoscenza delle proprietà chimico-fisiche degli acidi nucleici ha
reso possibile la messa a punto di due tecniche per la determinazione
della sequenza del DNA
L’obiettivo principale della maggior parte dei progetti del genoma èdi
determinare la sequenza del DNA dell’intero genoma o quella di un
numero elevato di trascritti
Progetti di sequenziamento completo del genoma
Microrganismi – organuli >600 virus, >10 archaea, >50 batteri e diversi
viroidi, plasmidi, e 24 genomi di organuli (completi) – S. cerevisiae (completo)
Animali
Piante superiori
Choenorhabditis elegans (in corso)
Drosophyla melanogaster (in corso)
Mus musculus (completo)
Homo sapiens (completo)
Arabidopsis thaliana (completo)
Oryza sativa (completo)
Medicago truncatula (in corso)
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Le prime procedura per il sequenziamento del DNA vennero messe a
punto da Maxam e Gilbert nel 1977
Basato sul trattamento con reagenti chimici capaci di degradare una
molecola di DNA in corrispondenza di specifici nucelotidi
Nel 1981 Sanger e collaboratori:
Metodo Sanger o metodo dideossi
Basato sulla sintesi enzimatica di molecole di DNA che terminano in
corrispondenza di specifici nucelotidi
Per entrambi i metodi la visualizzazione della sequenza avviene per
elettroforesi in gel ad altissima risoluzione (si devono separare
frammenti che differiscono per un singolo nucleotide)
L’idea che sta alla base del metodo Sanger è di
produrre tutte le possibili molecole di DNA a filamento singolo,
complementari a una sequenza stampo, che inizia con una base e che
si estende fino a una di stanza di 1 kb in direzione 3’.
Reazione di polimerizzazione che si arresta specificamente dopo ogni G
oppure dopo ogni A o T o C.
L’arresto specifico si ottiene aggiungendo alla reazione di
polimerizzazione dei dideossinucleotidi trifosfati (ddNTP)
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In pratica si parte da una popolazione numerosa di molecole di DNA
identiche ottenute per amplificazione enzimatica o batterica (E. coli)
Prevede l’uso di un primer complementare ad una sequenza terminale
del frammento prodotto per PCR o ad una sequenza del DNA
plasmidico adiacente al frammento clonato da sequenziare
La reazione è catalizzata dalla DNA polimersai in direzione 5’-3’ a
partire dall’ossidrile contenuto nel primer e richiede i 4 nucleotidi
(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) come precursori
Il sequenziamento necessita anche di uno stampo di DNA e 4 differenti
reazioni di sintesi in ciascuna delle quali c’è un diverso ddNTP
Siccome la DNA polimerasi non è in grado di discriminare tra il ddNTP
e il corrispondente dNTP ognuno dei possibili nucleotidi può essere
inserito nella catena di DNA in allungamento
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La separazione delle molecole in base alle loro
dimensioni, ottenuta tramite elettroforesi, origina una
serie di bande, ciascuna delle quali corrisponde a una
classe di molecole che differisce per un nucleotide in
più rispetto alla banda successiva
Perché non ci sono due o più frammenti di una
determinata lunghezza?
Perchè il primer utilizzato è complementare soltanto
alla sequenza che ci interessa
(è progettato in modo da essere specifico)
Direzione elettroforesi
Direzione lettura
A T C G
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Risultato della corsa elettroforetica di un sequenziamento
Evoluzione della tecnica
Primers marcati con fluorocromi differenti
ddATP
ddCTP
ddGTP
A
AC
ACG
ddTTP
ACGT
Le 4 reazioni possono “correre” insieme
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Terminatori marcati
ddATP
ddCTP
ddGTP
A
AC
ACG
ddTTP
ACGT
PCR
Incorporazione dei terminatori marcati
denaturazione
appaiamento
Miscela di reazione
A C G T
A C G T
Prodotti marcati
A
C
G
T
A
estensione
A C G T
G
A C G T
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CCD Camera
Laser
Scanner
Plates with acrylamide gel
Elettroforesi capillare
capillare
Laser
Camera CCD
Buffer
+ _
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CCD (Chip Colour Detection) camera
Lettura dei tracciati
La lettura dei tracciati grezzi (non elaborati) viene anche detta
identificazione delle basi (base-calling) è oggi effettuata tramite
software che leggono automaticamente le basi, allinea le sequenze simili
e fornisce una base intuitiva per la correzione di bozze (editing)
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Mentre leggono i tracciati, i software assegnano punteggi di probabilità
all’accuratezza di identificazione di ciascuna base e
le informazioni ottenute vengono usate nei passaggi successivi della
procedura di allineamento
errori
Gli errori di sequenziamento possono essere provocati da
problemi molto frequenti:
Le prime 50 basi di una lettura sono indistinguibili dal
rumore di fondo
a causa della migrazione anomala di brevi frammenti di
DNA che contengono agglomerati di coloranti
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errori
Inoltre i tracciati diventano progressivamente meno
uniformi con l’avanzare della corsa: aumentano gli effetti
della diffusione molecolare e contemporaneamente
diminuiscono le differenze relative di massa tra frammenti
successivi
Assemblaggio dei contig
Lo stadio di rifinitura nel sequenziamento di un tratto di
DNA più lungo di un singolo clone comprende
l’allineamento, il controllo e la correzione degli errori
Questi passaggi sono in genere eseguiti con software di
controllo delle sequenze (esempio il pacchetto Vector NTI)
Le caratteristiche fondamentali sono:
1 - La capacità di visualizzare i tracciati di sequenze
comparate tra di loro, di navigare tra di essi e segnalare
con precisione le ambiguità
(Conting express)
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2 – una visibilità facile e immediata del filamento
complementare
3 – gli strumenti per correggere manualmente la
sequenza, come ad es. la possibilità di inserire o eliminare
basi senza alterare in modo significativo i file dei tracciati
originali
4 – la capacità di individuare eventuali siti polimorfici
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Il software produce, quindi, un’interfaccia grafica che
permette di richiamare e correggere in maniera interattiva
le singole letture di contig
Il compito finale di un programma di controllo delle
sequenze è di aiutare a risolvere le lacune e le ambiguità
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We sequenced 6 colonies for each RACE experiments
We aligned the sequences by using the software VECTOR NTI
The coding regions were mostly similar
But…
..the 5’ and 3’ UTRs of some colonies were different
This let us believe that for some genes we obtained
more alleles at the same time
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Also intriguing was the fact that the few differences
were at the restriction sites of fragments...
Mse-I
Restriction site
Sequenziamento del genoma
Le sequenze dei cromosomi interi vengono ricostruite a
partire dalle sequenze di centinaia di migliaia di frammenti di
DNA, normalmente di lunghezza compresa fra 500 e 800 pb
Si usano 2 strategie generali per la frammentazione e la
ricostruzione:
Il sequenziamento gerarchico
Il sequenziamento a rosa di pallini (shotgun)
Le due strategie sono reciprocamente complementari
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Differenze:
Nel sequenziamento gerarchico il prmo passaggio è quello di costruire
un sentiero principale (tiling path) che serva ad assicurarsi che la
sequenza sia ottenuta in grandi pezzi ordinati tra di loro
Mentre nel metodo shotgun frammenta semplicemente il genoma in
piccole unità sequenziabili e si affida ad algoritmi del computer per
ricostruire l’ordine dei frammenti
Sequenziamento gerarchico (genoma umano)
Le strategie gerarchiche conosciute anche come dall’alto in basso (topdown),
basate su mappe o clone per clone sono state ideate alla fine
degli anni 80 quando i reagenti erano molto costosi e i computer non
erano ancora abbastanza potenti per elaborare sequenze intere ottenute
con lo shotgun
Metodologia: frammentare il genoma in unità sempre più piccole le cui
posizioni relative sono conosciute prima di iniziare il sequenziamento
Vantaggi: favorisce la ricostruzione di mappe fisiche e genetiche ad alta
risuluzione e permette a gruppi di lavoro di tutto il mondo di formare
consorzi e lavorare insieme senza rischiare di ripetere le stesse ricerce
(un gruppo = un cromosoma)
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Il primo passaggio è quello di ottenere cloni del genoma
umano di dimensioni comprese tra 50 e 200 kb
I vettori in cui è possibile inserire tratti genomici di grandi
dimensioni sono i BAC i PAC (derivati dal fago P1)
Si costruiscono librerie di DNA tramite digestione
parziale o frammentazione del DNA genomico tramite
sonicazione
In genere si desidera un certo grado di ridondanza
Questo perché i cloni in teoria dovrebbero avere estremità
diverse e questo dovrebbe rendere possibile selezionare
una impalcatura di cloni che formino una sequenza
contigua comprendente l’intero cromosoma
un tiling path
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È possibile ricostruire un tiling path mediante una combinazione di 3 metodi:
Ibridazione: è possibile identificare rapidamente in una
libraria tutti i cloni che contengono una particolare
sequenza, ibridando una sonda di piccole dimensioni,
marcata con isotopi radioattivi o molecole fluorescenti, e
contenente la sequenza, a un filtro su cui è fissata una
combinazione di decine di migliaia di cloni
In seguito si può usare l’estremità di questi cloni come
sonda per individuare i cloni adiacenti in quello che viene
denominato “chromosome walking”
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Fingerprinting: il modo meno costoso e più efficace per
ricostruire l’ordine dei contig di grandi cloni inseriti nei
vettori è quello di confrontarli tra loro e allinearli in base
ai profili di digestione con enzimi di restrizione
Se si usa un enzima esacutter, questo opererà un taglio
ogni 4 kb: se sono usati per tagliare un BAC di 100 kb,
producono a 20 a 30 frammenti.
Questi possono essere separati tramite elettroforesi e,
quindi, assegnati a gruppi dimensionali, dopo una
adeguata normalizzazione statistica
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End-sequencing=sequenziare le estremità della raccolta di
cloni BAC. Modo comune per identificare i cloni che si
sovrappongono alle lacune rimanenti dopo il fingerprinting
Una volta raggiunta una soglia critica di ricostruzione della
sequenza, vi è una probabilità elevata che almeno un BAC
si trovi all’interno di una regione già ricostruita: di
conseguenza l’altra estremità del clone si estenderà nella
lacuna o si collegherà ad un contig adiacente
Il sequenziamento a una estremità è inoltre un componente
importante delle tecniche usate per verificare la correttezza
della ricostruzione delle sequenze.
Tornando al sequenziamento gerarchico….
Una volta scelto il tiling path, i singoli cloni BAC sono
suddivisi in piccoli frammenti, che sono clonati a loro volta
per il sequenziamento automatico
La frammentazione viene fatta con ultrasuoni e questo
assicura che ogni frammento abbia estremità diverse dagli
altri
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Sequenziamento shotgun
Nel sequenziamento shotgun si usano algoritmi del computer per
ricostruire la sequenza dei contig derivati da migliaia di cloni sovrapposti.
I contig sono prodotti da una libreria plasmidica costruita a partire da un
unico genoma intero
Come nel sequenziamento gerarchico lo scopo è quello di ottenere una
ridondanza di ciascun frammento del genoma da 5 a 10 volte
L’allineamento serve per ottenere l’assemblaggio delle sequenze contigue
di cloni, ma anche per migliorare l’accuratezza della sequenza, tramite la
produzione di una sequenza consenso
Ad esempio nel genoma umano la Celera ha utilizzato 5
algoritmi con l’obiettivo di riunire insieme il più possibile
le parti dell’unica sequenza sovrapponendo tra loro le
sequenze parziali
Così facendo le uniche lacune che restano sono quelle
dovute a DNA ripetitivo o a sequenze non rappresentate
nella libreria
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Sequenziamento di interi genomi
Frammento cromosomico
sequenziato
DNA
genomico
Frammentazione
Assemblaggio dei
frammenti sequenziati contigui
(Software appositi)
Clonaggio
in vettori
Sequenziamento
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Verifica delle sequenze
La veridicità di qualunque sequenza di un intero genoma deve essere
valutata a tre livelli: la completezza, l’accuratezza della sequenza di basi e
la validità della ricostruzione.
Completezza: in genere i microrganismi (così pure l’uomo, il riso,
arabidopsis e il topo) sono stati sequenziati per intero
Possono contenere comunque lacune difficili da colmare (di circa 1 kb).
Questo può essere dovuto a sequenze ripetute difficili da colmare o al
fatto che il sequenziamento è stato effettuato partendo da individui diversi
per cui potrebbero esserci polimorfismo dovuti a indel o a duplicazioni
Accuratezza: l’accuratezza è stabilita in punteggi di probabilità
Validità della ricostruzione: non è facilmente determinabile: è
possibile averne un’idea approssimativa misurando al
coerenza interna della sequenza, oppure paragonando la
ricostruzione con mappe genetiche o fisiche preesisteti o fatte
all’uopo.
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Chromosome painting con cloni BAC
12.7 Mb
CEN
14.4 Mb
Condizioni di Painting
1. Chromosoma 1 di
Arabidopsis thaliana
2. Un totale di 183 cloni BAC
del chr-1
3. BAC dal braccio superiore
(12.7 MB) marcati con
biotin-dUTP (rosso)
4. BACs dal braccio inferiore
(14.4 MB) marcati con
digoxygenin-dUTP (verde)
FISH painting del cromosoma 4 con 131 BAC
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WS (knob)
?
C24 (knobless)
*
F9H3
F4C21
24