Parte 2 - CusMiBio - Università degli Studi di Milano
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Schema delle PCR e <strong>di</strong>gestione con enzimi <strong>di</strong> restrizione<br />
Vi vengono forniti i prodotti <strong>di</strong> PCR ottenuti amplificando il DNA dei <strong>di</strong>versi soggetti analizzati in ogni famiglia,<br />
identificabili nei pe<strong>di</strong>gree <strong>di</strong> §6.6. Lo schema delle PCR eseguite è quello riportato nei singoli scenari.<br />
Scenario 1<br />
Pr fw<br />
MstII<br />
Esone 1<br />
Pr rev<br />
376 bp<br />
(Hb S)<br />
Aggiungere ad ogni provetta:<br />
DNA <strong>di</strong> III 1 e III 2<br />
DNA <strong>di</strong> IV1 IV2, IV 3, IV 4<br />
DNA 8 µl<br />
Enzima MstII + tampone 10X 2 µl<br />
175 + 201 bp (Hb A)<br />
Incubare a 37°C per 40 min.<br />
10 µl<br />
Scenario 2<br />
Pr fw<br />
DdeI<br />
Esone 4<br />
Pr rev<br />
Aggiungere ad ogni provetta:<br />
DNA <strong>di</strong> II 6 e II 7<br />
DNA <strong>di</strong> III 3, III 4, III 5, III 6<br />
220 bp (normale)<br />
130 + 90 bp (mutato)<br />
DNA Scenario 3<br />
8 µl<br />
Enzima DdeI + tampone 10X 2 µl<br />
Incubare a 37°C per 40 min.<br />
10 µl<br />
Pr fw<br />
HindIII<br />
Introne 19<br />
Aggiungere ad ogni provetta:<br />
DNA <strong>di</strong> I 2<br />
DNA <strong>di</strong> II 2, II 3, II 4, II 5<br />
DNA <strong>di</strong> III 1, III 2, III 3, III 4<br />
Pr rev<br />
717 bp (-)<br />
DNA 8 µl<br />
Enzima HindIII + tampone 10X 2 µl<br />
167 + 550 bp (+)<br />
(+)(+)(+<br />
Incubare a 37°C per 40 min.<br />
10 µl<br />
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