Parte 2 - CusMiBio - UniversitÃ degli Studi di Milano

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Comunemente, per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel si aggiunge all’agarosio l’ Eurosafe, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV. Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta Strumentazione e materiale a disposizione spruzzette beuta e becker cilindro graduato piastra oscillante provette eppendorf provette 5-50 ml portaprovette bagnomaria e termometro micropipettatrici P10, P20, P200, P1000 puntali per micropipette spatola power supply (alimentatore) carta carta stagnola contenitori per ghiaccio camice guanti monouso vaschetta e pettine per elettroforesi forno a microonde guanto da forno enzima di restrizione bilancia analitica centrifuga per provette eppendorf Principali prefissi e unità di misura usate in biologia cellulare e molecolare Prefisso Simbolo Multiplo o Esempio sottomultiplo chilo k 10 3 1 kg è 1.000 grammi centi c 10 -2 1 cm è 0.01 di un metro milli m 10 -3 1 mL è 10 -3 di un litro micro µ 10 -6 1 µm è 10 -6 di un metro nano n 10 -9 1 ng è 10 -9 di un grammo pico p 10 -12 1 pg è 10 -12 di un grammo Quantità Abbreviazione Equivalente litro l millilitro ml 10 -3 l (1 mL = 1 cm 3 = 1 cc) microlitro µl 10 -6 l (1 µL = 1 mm 3 ) Dal pedigree al DNA e ritorno 10
Schema delle PCR e digestione con enzimi di restrizione Vi vengono forniti i prodotti di PCR ottenuti amplificando il DNA dei diversi soggetti analizzati in ogni famiglia, identificabili nei pedigree di §6.6. Lo schema delle PCR eseguite è quello riportato nei singoli scenari. Scenario 1 Pr fw MstII Esone 1 Pr rev 376 bp (Hb S) Aggiungere ad ogni provetta: DNA di III 1 e III 2 DNA di IV1 IV2, IV 3, IV 4 DNA 8 µl Enzima MstII + tampone 10X 2 µl 175 + 201 bp (Hb A) Incubare a 37°C per 40 min. 10 µl Scenario 2 Pr fw DdeI Esone 4 Pr rev Aggiungere ad ogni provetta: DNA di II 6 e II 7 DNA di III 3, III 4, III 5, III 6 220 bp (normale) 130 + 90 bp (mutato) DNA Scenario 3 8 µl Enzima DdeI + tampone 10X 2 µl Incubare a 37°C per 40 min. 10 µl Pr fw HindIII Introne 19 Aggiungere ad ogni provetta: DNA di I 2 DNA di II 2, II 3, II 4, II 5 DNA di III 1, III 2, III 3, III 4 Pr rev 717 bp (-) DNA 8 µl Enzima HindIII + tampone 10X 2 µl 167 + 550 bp (+) (+)(+)(+ Incubare a 37°C per 40 min. 10 µl 11
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Page 5 and 6: A ciascuna storia il suo pedigree.
Page 8 and 9: Tecniche utilizzate in laboratorio
Page 12 and 13: Elettroforesi su gel di agarosio: s
Page 14 and 15: Analisi dei risultati 14
Page 16: Norme generali di sicurezza in labo

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