Parte 2 - CusMiBio - Università degli Studi di Milano

Sano o malato
Schede informative di tre malattie monogeniche
Scheda 1: ANEMIA FALCIFORME (SCD) #OMIM 141900.0243
L’anemia falciforme, chiamata anche DREPANOCITOSI e SICKLE- CELL DISEASE (dal nome greco e inglese
usato rispettivamente per indicare la parola italiana “falce”, è una malattia ereditaria autosomica recessiva
caratterizzata dalla classica forma a falce che hanno i globuli rossi degli individui affetti.
CAUSE. Questa malattia è causata da una mutazione nel
gene che codifica la catena beta della emoglobina
(Hb). L’Hb è una grossa proteina contenuta nei globuli
rossi che ha la funzione di catturare l’ossigeno nei
polmoni e trasportarlo ai vari tessuti dai quali raccoglie
l’anidride carbonica prodotta dal metabolismo cellulare
per trasportarla ai polmoni. Negli adulti l’emoglobina è
costituita da quattro catene polipeptidiche, due di tipo
alfa e due di tipo beta (Fig.4.1). Nelle catene beta degli
individui falcemici, l’acido glutammico nella posizione
6 è sostituito dall’amminoacido valina determinando
così la formazione di una emoglobina patologica,
Fig. 4.1. Struttura dell’emoglobina.
chiamata emoglobina S (Hb S). Quando questo tipo di
emoglobina cede l’ossigeno che trasporta, come
avviene, per esempio, a livello dei capillari periferici nei
tessuti, subisce un cambiamento di forma che la rende
insolubile. Le molecole di HbS tendono ad aggregarsi in
strutture allungate che conferiscono rigidità al globulo
rosso e la classica forma a falce (Fig. 4.2). Impediti
così a scorrere normalmente nei capillari, vasi
Fig. 4.2. Globuli rossi normali (a) e globuli rossi a falce (b) piccolissimi in cui i globuli passano solo grazie alla
loro elasticità, questi globuli alterati provocano
pericolose occlusioni. L’anemia è dovuta alla fragilità dei globuli rossi falcemici che lisano con facilità e vengono
rimossi dal circolo a livello della milza.
MANIFESTAZIONI PATOLOGICHE. La malattia si manifesta nei primi due anni di vita con un ampio spettro di
sintomi a carico di organi e sistemi diversi (un evidente esempio di pleiotropismo, vedi Fig. 2.4) legati all’aumentata
distruzione dei globuli rossi (emolisi) che contengono emoglobina S (la vita media di un globulo rosso falcemico è di
soli 20 giorni anziché di 120, come invece avviene per i globuli rossi normali); alle crisi da occlusione dei vasi
sanguigni e all’accumulo di cellule falciformi nella milza, l’organo deputato alla distruzione dei globuli rossi. La lisi
dei globuli rossi causa anemia cronica con conseguente ittero, scarso sviluppo fisico, ritardo mentale, insufficienza
cardiaca. L’insufficiente apporto di sangue a vari distretti causa danni a diversi tessuti e organi, infarti cerebrali
(ictus), necrosi ossee, sindrome polmonare acuta che può risultare letale, crisi dolorose improvvise di durata variabile,
tumefazioni dolorose al dorso delle mani e dei piedi (dactilite). L’accumulo di globuli rossi falcemici nella milza la
costringe a un iperlavoro e ne provoca ingrossamento e fibrosi con riduzione della funzionalità e conseguente
aumento della suscettibilità alle infezioni. Negli omozigoti la malattia è grave e di solito conduce a morte in età
infantile. Negli eterozigoti invece è benigna, rendendosi evidente solo in occasione di particolari sforzi che richiedono
notevole consumo e trasporto efficiente di ossigeno.
TERAPIA. Attualmente non esiste una terapia in grado di risolvere tutte le patologie legate all’anemia falciforme. Si
possono, però, utilizzare vari farmaci che possono attenuare i sintomi e rendere più sopportabile la vita per i malati.
Per esempio si usano antidolorifici per sedare le crisi dolorifiche, antibiotici e vaccini per curare e prevenire le
infezioni, trasfusioni di sangue che diluiscono i globuli rossi anomali e riducono le complicanze legate al sovraccarico
di lavoro della milza. Dal 1995 si sta sperimentando un farmaco antitumorale chiamato idrossiurea che aumenta la
produzione di emoglobina fetale (HbF), ma che ha notevoli effetti collaterali. Si può inoltre ricorrere al trapianto di
midollo osseo.
1

FREQUENZA DELL’ALLELE DELLA ANEMIA FALCIFORME. Questa malattia è rara in Europa ma molto
frequente in Africa, tra i neri d’America e in genere nelle zone malariche del pianeta. Questa diversa distribuzione è
dovuta al fatto che i globuli rossi degli individui portatori (eterozigoti) hanno maggiore resistenza verso il Plasmodium
falciparum, l’agente della malaria, rispetto ai globuli rossi dei soggetti sani. Questo vantaggio genetico degli eterozigoti
ha favorito il mantenimento dell’allele dell’anemia falciforme nelle zone malariche. L’alta frequenza di questa
mutazione presso la popolazione nera Americana è un retaggio genetico delle origini africane. Tra i neri d’America,
l’anemia falciforme ha una frequenza di 1/500 nascite e circa 1 individuo su 12 è eterozigote. Lo stesso vale per i
cittadini americani con origini nelle regioni paludose dell’Italia, Grecia, di Cipro e del Medio Oriente.
Scheda 2: IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE TIPO A (FH) #OMIM 143890
Delle varie forme di ipercolesterolemia familiare (FH), la ipercolesterolemia di tipo A è una malattia ereditaria
autosomica dominante caratterizzata da un elevato livello di colesterolo nel sangue dovuto a un difetto del recettore
che consente l’ingresso del colesterolo nelle cellule. Il colesterolo è un composto steroideo molto importante per le
cellule animali in quanto è un componente essenziale delle membrane.
Il colesterolo, sia quello prodotto ex novo (principalmente dalle cellule del fegato e dell’intestino) che quello
introdotto con la dieta, circola nel sangue in particelle lipoproteiche; se è presente in eccesso, favorisce la formazione
di placche all'interno delle arterie (fenomeno detto aterosclerosi) che portano alla loro occlusione.
La colesterolemia, cioè la quantità di colesterolo totale nel sangue, si misura in milligrammi per decilitro di sangue
(mg/dl). Il valore normale è di 150/200 mg/dl, circa. Nelle analisi, oltre al valore del colesterolo totale, viene riportato
anche il valore delle lipoproteine. Queste comprendono:
A) le lipoproteine LDL (Low Density Lipoprotein:
lipoproteina a bassa densità, Fig. 4.3) che contengono il
colesterolo che verrà assorbito dalle cellule in seguito al legame
delle LDL al recettore specifico sulla membrana cellulare. Se le
LDL sono in eccesso, rispetto alla capacità di assorbimento dei
vari tessuti, il colesterolo può depositarsi sulla parete interna
delle arterie formando le placche aterosclerotiche;
B) le lipoproteine HDL (High Density Lipoprotein: lipoproteina
ad alta densità) che raccolgono il colesterolo in eccesso da tutti
gli organi e lo trasportano al fegato da dove viene eliminato nella
bile. Questo colesterolo viene chiamato "colesterolo buono",
anche se, in realtà, non esiste un colesterolo "buono" e uno
"cattivo", in quanto è sempre lo stesso colesterolo che viene
trasportato da proteine diverse.
CAUSE. La forma più comune di FH di tipo A è la forma
eterozigote (1 su 500 nati vivi) in cui i valori di colesterolemia
vanno da 220 a 550 mg/dl; nella forma omozigote, molto più
grave, ma anche più rara (1 su 1.000.000 nati vivi ), i valori di
colesterolemia sono compresi tra 550 e 1000 mg/dl.
La FH di tipo A è dovuta alle alterazioni di un gene, situato sul
cromosoma 19, che codifica una proteina recettore localizzata
sulla membrana cellulare che ha la funzione di captare le LDL e
pemetterne l'entrata nelle cellule. Una volta trasportate all'interno
delle cellule, le LDL vengono degradate dagli enzimi lisosomiali e
il colesterolo liberato inibisce l'enzima 3-idrossi-3metil-glutaril-
CoA riduttasi, necessario per la sintesi di nuovo colesterolo. Se
manca il recettore di membrana o è prodotto in quantità
Fig. 4.3 Una particella LDL è costituita da un
monostrato di fosfolipidi e da molecole di
colesterolo libero (all’esterno) e esterificato ad acidi
grassi (all’interno). Una molecola di apoproteina B-
100 è inclusa nel monostrato lipidico e media il
legame della LDL al recettore. Una particella LDL
tipica contiene circa 800 molecole di fosfolipidi e
500 molecole di colesterolo libero nel monostrato
esterno e circa 1500 molecole di colesterolo
esterificato al suo interno.
La forma B di HF (OMIM #144010) è dovuta a
mutazioni del gene della apoproteina B-100 che
codifica una proteina incapace di legare il recettore.
insufficiente (come negli eterozigoti) o ne è prodotta una forma alterata, le LDL si accumulano nel sangue dando
origine alle placche aterosclerotiche e la sintesi di colesterolo intracellulare aumenta. Delle circa 150 mutazioni di
questo gene (in alcuni casi il recettore è difettivo e non lega le LDL in altri ha ridotta affinità per le LDL, oppure
lega le LDL ma non è in grado di internalizzarle), in Italia ne sono state individuate 72 che presentano una particolare
distribuzione regionale.
MANIFESTAZIONI PATOLOGICHE. La formazione di placche aterosclerotiche (ateromi) rende difficile la
circolazione del sangue e può essere causa di problemi cardiocircolatori, con rischio di infarto che, pur variando da
persona a persona, è comunque legato al valore della colesterolemia. Un tipico sintomo di FH è la comparsa (dopo i
30-40 anni negli eterozigoti, entro i primi 4 anni negli omozigoti) di accumuli di grasso chiamati xantomi a livello dei
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tendini (negli eterozigoti) o nella cute dei gomiti e delle ginocchia (negli omozigoti). Tuttavia, nel 40% degli
eterozigoti gli xantomi possono essere assenti del tutto, e anche le altre manifestazioni patologiche, come gli
xantelasmi (accumuli di grasso all'esterno dell'occhio) o l'arco corneale (piccola lunetta che si forma dentro l'occhio
alla periferia della cornea) possono essere assenti o manifestarsi in forma lieve. In questi casi, l'eterozigote può
scoprire di essere affetto da FH solo in seguito a controlli ematici casuali e forse troppo tardi per instaurare una
adeguata terapia. In assenza di trattamenti specifici, gli uomini intorno ai 35 anni e le donne intorno ai 45 anni hanno
alto rischio di andare incontro a gravi problemi cardiocircolatori.
Negli omozigoti il quadro clinico è più grave. I sintomi sono riscontrabili entro i primi 4 anni di vita e i problemi
cardiocircolatori compaiono già nell'infanzia, determinando molto spesso la morte per infarto prima dei 20 anni.
TERAPIA. Le semplici raccomandazioni dietetiche non sono sufficienti a ridurre le manifestazioni patologiche di
questa malattia, perchè l'organismo produce comunque colesterolo di per sé. I pazienti adulti vengono trattati con le
statine, potenti inibitori dell'enzima 3-idrossi-3-metil-glutaril-Co A riduttasi che è necessario, come già detto, per la
sintesi del colesterolo. Insieme alle statine vengono somministrate anche delle resine che sequestrano il colesterolo
sotto forma di acidi biliari e ne permettono l'espulsione con le feci, e l'ezetimide che inibisce selettivamente
l'assorbimento di colesterolo a livello intestinale. E' importante, in ogni caso, evitare tutti i fattori di rischio di
malattie cardiovascolari, come fumo, alcool, stress e tenere sotto controllo la pressione arteriosa.
Negli omozigoti la terapia d'elezione è però rappresentata dalla LDL- aferesi che consiste, ogni due settimane circa,
nella rimozione extracorporea delle LDL dal sangue con una speciale apparecchiatura.
Scheda 3: EMOFILIA A (HEMA) #OMIM 306700
L’emofilia è una malattia per cui il sangue fatica a coagulare con conseguenti gravi rischi in caso di ferite o possibilità
di emorragie interne anche in assenza di traumi. La causa va ricercata nell'assenza di alcune proteine indispensabili
per la coagulazione (Fig. 4.4). Nell'85% dei casi, si tratta del fattore VIII (emofiliaA, HEMA) e, nei restanti casi, del
fattore IX (emofilia B, HEMB), entrambi prodotti dal fegato. I geni del fattore VIII e IX della coagulazione sono
localizzati sul cromosoma X. La malattia si manifesta solo nei maschi, mentre le femmine sono portatrici sane.
Rarissime sono le femmine malate, il che fa pensare che la condizione di omozigosi per l'emofilia sia letale nella
femmina allo stato fetale. Esistono forme di emofilia A di gravità diversa (dipendente dal tipo di mutazione). Il 60%
degli individui con emofilia A ha la forma grave.
1 2
3
Fig. 4.4 La cascata degli eventi della coagulazione e i
principali fattori coinvolti. Il fattore VIII è coinvolto
nella emostasi secondaria e nella crescita del coagulo. Il
fattore IX (non indicato nella figura) è una delle
proteine della cascata di reazioni che portano
all’attivazione della protrombina a trombina.
CAUSE. Malattia molto eterogenea geneticamente (vedere §2.4) in quanto dovuta a molte mutazioni diverse del gene
del fattore VIII. Il catalogo OMIM riporta 270 varianti alleliche principali.
3

MANIFESTAZIONI PATOLOGICHE. I soggetti emofilici gravi sono a rischio di emorragie per cure dentistiche, o
durante operazioni chirurgiche o in seguito a traumi. Soffrono di emorragie interne, che insorgono in assenza di
traumi o ferite e senza alcuna causa apparente. Ripetuti versamenti di sangue nelle articolazioni provocano forme di
invalidità (problemi articolari e riduzione delle capacità motorie).
Emofilia: un pò di storia
La documentazione storica sull'emofilia è molto antica. Già nel III- V sec. a.C. la normativa giudaica proibiva
di sottoporre a circoncisione (una pratica rituale, presente in alcuni popoli, in cui ai bambini viene tagliato
l'anello prepuziale che circonda il glande nel pene) i bambini con parenti morti per emorragia durante tale
pratica. Tuttavia, solo a partire dal XIX secolo si iniziano gli studi e le osservazioni che porteranno ad individuare
il ruolo delle madri nella trasmissione della malattia e la possibilità di prevenire la morte degli affetti con le
trasfusioni. Nel 1942 viene dimostrata l'ereditarietà legata al cromosoma X e negli ultimi 50 anni, con il rapido
progresso delle tecniche del DNA ricombinante, è stato possibile attivare una terapia con il fattore VIII
ricombinante che ha portato la speranza di vita degli emofilici a superare i 50 anni.
Indubbiamente, nella storia il caso più eclatante di emofilia è quello che riguarda la regina Vittoria e i suoi
discendenti, l'ultimo dei quali è morto nel 1945. Esiste però, nella famiglia reale spagnola, una pronipote della
regina Vittoria, Olimpia, che ha avuto un figlio maschio morto da bambino di una malattia del sangue e che
potrebbe essere l'unica portatrice vivente sulla quale effettuare il test genetico in grado di diagnosticare quale tipo
di emofilia, A o B, ha colpito l'intera famiglia reale e forse di individuarne l'esatta mutazione. A questo proposito si
ricorda che questa mutazione deve essere comparsa in uno dei gameti (paterno o materno) da cui è stata generata
la regina Vittoria, in quanto non c'erano stati casi di questa malattia nei suoi ascendenti e che essa potrebbe essere
stata influenzata dall'età paterna, in quanto aveva 52 anni al momento della nascita della figlia.
Attraverso le sue figlie, il cromosoma X mutato della regina Vittoria, oltre che nella famiglia reale spagnola, è
passato in quella reale russa e ha permesso, insieme all'esame dei polimorfismi STR (Short Tandem Repeat), di
ricostruire la parentela dei nove cadaveri della famiglia dello zar Nicola II, seppelliti ad Ekaterinburg durante la
rivoluzione russa e attribuiti dai medici legali russi alle salme dello zar, della zarina, di tre dei loro 5 figli, del
medico personale dello zar e di tre domestici. L'analisi del DNA mitocondriale ha rivelato una stretta affinità tra
la presunta zarina e i suoi tre figli e un parente di origine materna ancora vivente (il principe Filippo di
Edimburgo, suo pronipote). Lo stesso è stato verificato per il presunto zar e due suoi parenti di origine materna
ancora viventi. Queste analisi del DNA hanno permesso anche di scoprire che nella tomba non c'erano tracce nè di
una delle principesse (probabilmente Maria) e tantomeno dello zarevich Alessio, il figlio emofilico dello zar.
Come si ricorderà, questa incertezza riguardo alla fine della principessa fece sorgere il caso di Anna Anderson,
una donna morta nel 1984, che per anni reclamò il titolo di principessa della famiglia reale russa. Ma,
recentemente, l'esame dei polimorfismi RFLP del suo DNA estratto da un campione di cellule tumorali prelevate
durante un'operazione chirurgica da lei subita quattro anni prima della morte, ha permesso di accertare che
nessuna parentela esiste con la famiglia reale russa, risolvendo un caso che aveva appassionato l'opinione
pubblica per più di mezzo secolo.
Nonostante che, sulla base degli esami fatti col DNA, i resti dei cadaveri trovati a Ekaterinburg si potessero
attribuire alla famiglia reale russa al 98,5%, il 17 Luglio 1998, ai funerali che per essi furono celebrati nell'antica
chiesa della fortezza di Pietro e Paolo a S. Pietroburgo, l'arcivescovo della città non presenziò al rito e il patriarca
Alessio II continuò a sostenere che i test del DNA, non essendo infallibili, erano inaffidabili.
TERAPIA. A partire dagli anni sessanta del secolo scorso gli emofilici vengono sottoposti a regolari trasfusioni di un
concentrato della proteina mancante, ciò che consente loro una vita quasi normale. II concentrato della proteina però
deriva dal sangue di donatori e può essere fonte di infezioni (epatite, AIDS). Inoltre il farmaco è molto costoso. Oggi
è disponibile un tipo di fattore VIII ottenuto per ingegneria genetica e quindi esente da rischi infettivi.
Per l’emofilia A, la terapia sostitutiva con il fattore VIII ricombinante è efficace nella maggior parte dei casi, ma
alcuni soggetti producono anticorpi che riducono o neutralizzano completamente l’attività della proteina.
I progressi della terapia genica sembrano promettenti per la cura di questo tipo di patologia.
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A ciascuna storia il suo pedigree. Scenari e simulazione di consulenza genetica
Siete un genetista medico e lavorate in un consultorio genetico. Si presentano da voi tre individui che richiedono
consulenza genetica. Ciascuno vi racconta la storia della sua famiglia. Costruite in base ai dati raccolti dall’anamnesi
familiare, il pedigree delle 3 famiglie e impostate l’analisi del DNA da richiedere al laboratorio per rispondere alle
domande poste dai 3 pazienti.
Scenario 1. Anemia falciforme #OMIM 141900.0243
In consultorio si presenta una giovane donna (età 35 anni) che vive a Milano ma è di origine sarda. Ha avuto 3 figli. I
primi due, un maschio e una femmina, sono sani. Al terzo, maschio, che aveva manifestato un ittero dovuto a una crisi
emolitica, è stata diagnosticata l’anemia falciforme. E’ in attesa di un quarto figlio (è alla fine della sesta settimana di
gravidanza) e vorrebbe informazioni sul rischio di avere un altro figlio malato. Aggiunge che in famiglia c’è un suo
zio scapolo con la stessa patologia. A una indagine più approfondita, la donna aggiunge che suo marito, il padre dei
suoi figli, è anch’esso sardo di origine ed è suo cugino primo.
Viene suggerito alla donna di sottoporsi ad amniocentesi per effettuare l’analisi del DNA e determinare il genotipo del
nascituro.
Costruite in base ai dati raccolti dall’anamnesi familiare, il pedigree della famiglia (vedere §2.2). Per controllare se il
pedigree che avete costruito è corretto, controllate a pagina 22.
Che probabilità ha il nascituro di essere sano Di avere l’anemia falciforme Di essere portatore dell’allele HbS
L’analisi del DNA consente di identificare il genotipo del nascituro e, quindi, di trasformare una probabilità in un dato
certo. (Se non ricordate la modalità di trasmissione ereditaria dell’anemia falciforme consultate il catalogo OMIM,
§2.3).
Come abbiamo già detto, la mutazione HbS è una sostituzione di base A --> T nella sequenza CCT GAG GAG che
fa cambiare il significato del 6° codone del gene della catena beta dell’Hb (Glu --> Val).
La sequenza mutata CCT GTG GAG non contiene più il sito di restrizione dell’enzima MstII
dove N in questo caso è la base G.
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di 376 bp che comprende il sito MstII (posizionato 175 bp
dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto della PCR con l’ER MstII, quale è il numero e la lunghezza (in bp) delle
bande che vi aspettate di trovare nel caso di individui omozigoti normali, eterozigoti o omozigoti affetti (vedere §3.5,
Fig. 3.5 e 3.6)
Pr fw
MstII
Anche se sarebbe sufficiente analizzare solo il
DNA del feto, analizzeremo anche il DNA dei
Esone 1
genitori e quello dei fratelli sani per confermare la
Pr rev
condizione di eterozigosità dei genitori e poter
identificare tra i fratelli un eventuale portatore.
376 bp
(Hb S)
5' CC/TNAGG 3'
3’ GG/ANTCC 5’
175 + 201 bp
(Hb A)
Scenario 2. Ipercolesterolemia familiare #OMIM 143890
Si presenta in consultorio un giovane di 21 anni che appartiene a una famiglia in cui ci sono e ci sono stati parecchi
casi di malattia cardiovascolare. Il giovane, che non presenta sintomi di ipercolesterolemia, vuole fare l’analisi del
DNA per sapere se ha ereditato il gene dell’ipercolesterolemia familiare e, nel caso, per iniziare precocemente una
terapia preventiva e sottoporsi a una dieta opportuna.
Descrive così la sua famiglia: “ La famiglia di mio padre discende dai Boeri. I miei bisnonni paterni stavano a Città
del Capo. I nonni si sono trasferiti in Europa intorno al 1920 e si sono stabiliti in Olanda e successivamente in Italia. I
nonni paterni sono morti di cause a me non note. Mio padre è deceduto l’anno scorso di carcinoma al polmone ma
soffriva di cuore. Un mio zio paterno è morto di infarto abbastanza giovane. Con i suoi figli che vivono in un’altra
città non ci vediamo da tempo. Una zia paterna ha livelli normali di colesterolo. Un altro mio zio paterno di 40 anni
ha il colesterolo alto, così come sua moglie e una delle sue due figlie. Mia madre, olandese, e mia sorella hanno
normali livelli di colesterolo.”
Costruite il pedigree di questa famiglia (vedere §2.2) e controllate la risposta a pagina 22.
L’ipercolesterolemia familiare è una patologia che presenta eterogeneità genetica sia allelica che di locus (vedi §2.4 e
§4.1, legenda della figura 4.3). La FH è 5 volte più frequente nelle popolazioni di discendenza Boera rispetto a quelle
di Stati Uniti e Europa. Alcune mutazioni sono prevalenti in determinati gruppi etnici.
5

Negli individui di origine Boera è frequente una mutazione del gene del recettore LDL consistente in una sostituzione
di una coppia di basi (G C) nell’esone 4 del gene che crea un sito per l’enzima di restrizione DdeI: 5’ C/TNAG 3’
3’ GANT/C 5’
La mutazione causa anche una sostituzione amminoacidica Asp Glu che modifica la maturazione della proteina
recettore e ne riduce la capacità di legare LDL una volta giunta sulla superficie cellulare.
Il probando riferisce che lo zio deceduto si era sottoposto all’analisi del DNA e le analisi in suo possesso confermano
che era portatore della mutazione sopradescritta.
Pr fw
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di
DdeI
235 bp che comprende il sito DdeI (posizionato
Esone 4
130 bp dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto
Pr rev
della PCR con l’ER DdeI, quale è il numero e la
lunghezza (in bp) delle bande che vi aspettate di
trovare negli individui che hanno ereditato l’allele
235 bp (normale)
mutato (omozigoti o eterozigoti) e in quelli che
non lo hanno (omozigoti normali)
130 + 105 bp (mutato)
Analizzeremo il DNA dei membri della famiglia
disponibili, per individuare chi è portatore della stessa mutazione identificata nello zio deceduto.
Scenario 3. Emofilia A (HEMA) #OMIM 306700
Sei anni fa ha richiesto consulenza genetica una giovane coppia proveniente da un piccolo centro dell’appennino
marchigiano. All’anamnesi sono stati raccolti i seguenti dati: la donna aveva un fratello emofilico, morto a 8 anni in
seguito ad una emorragia intestinale. I suoi genitori non hanno l’emofilia. Il marito è sano. Il loro primo figlio è un
maschio affetto da emofilia A. La domanda della coppia riguardava il rischio di avere altri figli emofilici. La risposta
era stata che ogni figlio maschio aveva 50% di probabilità di essere emofilico e che era quindi consigliabile, in caso di
una successiva gravidanza in cui fosse accertato il sesso maschile del feto, eseguire l’analisi del DNA fetale per fare
diagnosi prenatale di malattia.
Essendo l’emofilia A, come abbiamo già detto (vedi §2.4) una patologia estremamente eterogenea (il catalogo OMIM
riporta 270 varianti alleliche principali), per identificare quale è la mutazione responsabile della malattia in ogni
singolo caso è necessario effettuare delle analisi del DNA estremamente complesse e laboriose che richiedono
laboratori attrezzati. Una via più semplice e tecnicamente meno impegnativa è quella di fare una diagnosi indiretta di
malattia utilizzando un marcatore RFLP associato all’allele malattia (vedi pag. 15). Sono stati identificati alcuni
RFLP associati al gene che codifica il fattore VIII. Come abbiamo già detto (vedi pag. 15), per avere dei risultati
significativi è necessario analizzare il DNA di molti individui all’interno della famiglia per identificare quale RFLP
utilizzare e quale allele del RFLP scelto è associato all’allele malattia all’interno di quella famiglia.
La coppia è ora in attesa di un figlio che ecograficamente è risultato maschio. La donna vuole sottoporsi ad
amniocentesi. Si rimette in contatto con il centro di Milano che consiglia di rivolgersi a un laboratorio del capoluogo
della regione di residenza che non è attrezzato per l’identificazione diretta della mutazione ma è invece
tecnologicamente in grado di eseguire una analisi del DNA per identificare RFLP associati alla malattia.
Sono disponibili i DNA della donna che richiede l’analisi e che è in attesa del quarto figlio, di sua madre, di due suoi
fratelli e di una sua sorella; sono disponibili anche i DNA dei tre bambini della signora: il maschio emofilico e due
figlie femmine nate nel frattempo.
Costruite il pedigree di questa famiglia (rivedere il §2.2). Se non ricordate la modalità di trasmissione ereditaria
dell’emofilia A consultate il catalogo OMIM (§2.3). Verificate il vostro pedigree con quello che trovate a pag.22.
Nella famiglia è risultato significativo il RFLP legato a un sito Hind III all’interno dell’introne 19 del gene. Questa
mutazione è una piccola delezione (del AGAG) che crea un sito Hind III 5'A/A G C T T 3'
3'T T C G A/A 5'
Pr fw
HindIII
Introne 19
Pr rev
717 bp (-)
167 + 550 bp (+)
(+)(+)(+
Nella famiglia l’allele malattia è associato all’allele (-)
del RFLP (= assenza della delezione e quindi del sito).
Quindi l’allele (-) sarà identificato dalla presenza di 1
banda e l’allele (+) sarà identificato dalla presenza di
2 bande.
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di
717 bp che comprende il sito HindIII (posizionato 167
bp dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto della
PCR con l’ER HindIII, quale è il numero e la lunghezza (in bp) delle bande che vi aspettate di trovare nel DNA dei
soggetti malati della famiglia, dei soggetti portatori, dei soggetti sani
6

Tecniche utilizzate in laboratorio
PCR ( Polymerase Chain Reaction)
Si tratta di una tecnica innovativa che consiste nell’amplificazione specifica di segmenti di DNA mediante reazioni
a catena della DNA polimerasi.
Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA genomico a doppio filamento e due corte sequenze
oligonucleotidiche (primer), di cui una
complementare ad un tratto di filamento a
una estremità del DNA da amplificare
(forward primer) e l’altra complementare
ad un altro tratto posto all’altra estremità
(reverse primer), in presenza di una DNA
polimerasi termostabile e di una miscela di
desossinucleotidi trifosfati in appropriate
condizioni di reazione, è possibile copiare
numerosissime volte il tratto compreso tra i
due primer, semplicemente facendo variare
ciclicamente la temperatura di reazione.
Infatti, raggiunta la temperatura di
denaturazione (circa 95°), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per la
sintesi delle catene complementari. Se la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro
concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si rinaturi e in
presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a
partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli.
Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo denaturazione
– annealing – extension numerose volte (in genere da 20 a 30), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un
dato tratto di DNA, corrispondente a DNA in quantità tale da essere visualizzabile in un gel di agarosio mediante
colorazione specifica.
N° cicli Num N° molecole della sequenza di
DNA DNA bersaglio
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
10 1.024
20 1.048.576
Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta
vantaggi molto evidenti:
♦ è molto rapido (da 60 a 90 minuti),
♦ la manualità è semplicissima,
♦ è automatizzato,
♦ i risultati sono visualizzabili con facilità.
La PCR ha rivoluzionato la genetica molecolare. Le
applicazioni della PCR sono praticamente infinite. I
principali ambiti di utilizzo sono la diagnosi prenatale di
malattie genetiche e le indagini di medicina legale.
30 1.073.741.824
Il limite più grosso è rappresentato dalla necessità di conoscere le sequenze fiancheggianti il tratto di DNA che si
vuole amplificare, per poter costruire i primer specifici.
Termociclatori
Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero
processo in modo automatico all’interno di strumenti detti termociclatori (thermal
cyclers) in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di
PCR.
Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un
termociclatore è il seguente:
1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94°C
2. appaiamento (annealing) dei primer: 30 sec a 50°-60°C 30-35 cicli
3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec-5 minuti a 72°C
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Taq polimerasi
Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una
DNA polimerasi termostabile estratta da batteri termofili (che vivono
ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni
della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus.
L’isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori
dall’ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di
reazione!
Scelta dei primer
Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse).
La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere l’amplificazione
di un tratto di DNA in modo specifico.
I primer devono essere “disegnati” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenti una sola volta), in modo che
possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone
Digestione con enzimi di restrizione (ER)
Come abbiamo detto, gli ER sono endonucleasi che tagliano il legame fosfodiesterico nel DNA a doppia elica a
livello di sequenze specifiche (siti di restrizione). La digestione con ER va condotta a 37°C in una soluzione
tampone (fornita insieme all’enzima dal produttore) che garantisce le condizioni ottimali (di salinità e pH) per la
digestione. Il tempo di incubazione varia a seconda se si digerisce DNA genomico o frammenti di DNA corti (ad
esempio, un prodotto di PCR, come nel nostro caso). Nel primo caso la digestione richiede almeno 8 ore (o tutta
la notte). Nel secondo caso sono sufficienti da 1-4 ore.
Gli ER sono reagenti costosi e delicati. Temono le contaminazioni (usare precauzioni nel prelevare l’enzima dalla
soluzione stock) e l’inattivazione (si devono conservare a -20°C e, al momento dell’uso, mantenere sempre in un
bagno di ghiaccio).
Elettroforesi su gel di agarosio
E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di
carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel può essere immaginato come una rete
tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l’azione di un campo elettrico. Il campo
elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore.
Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le
molecole di DNA sono cariche negativamente per la
presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo
(catodo) verso il polo positivo (anodo). Per un certo
intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è
funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la
molecola di DNA, tanto minore è la velocità di migrazione.
E, viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto
più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa
lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa
velocità di migrazione.
Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA
in esame separate mediante elettroforesi, vengono “caricati”
sul gel anche i cosiddetti marcatori di peso molecolare,
ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso
molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso
molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile
calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza. Dato che il peso
molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di
coppie di nucleotidi (basi) che lo costituiscono, di solito esso viene
espresso in paia di basi (bp).
La separazione elettroforetica dura circa 45 minuti. Al termine, i vari
frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, con particolari sistemi di colorazione. Il DNA
delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA.
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Comunemente, per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel si aggiunge all’agarosio l’
Eurosafe, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV.
Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta
Strumentazione e materiale a disposizione
spruzzette beuta e becker cilindro graduato piastra oscillante
provette eppendorf
provette 5-50 ml
portaprovette
bagnomaria e
termometro
micropipettatrici
P10, P20, P200, P1000
puntali per micropipette
spatola
power supply
(alimentatore)
carta
carta stagnola
contenitori per ghiaccio
camice
guanti
monouso
vaschetta e pettine per
elettroforesi
forno a
microonde
guanto da
forno
enzima di restrizione
bilancia
analitica
centrifuga per provette
eppendorf
Principali prefissi e unità di misura usate in biologia cellulare e molecolare
Prefisso Simbolo Multiplo o Esempio
sottomultiplo
chilo k 10 3 1 kg è 1.000 grammi
centi c 10 -2 1 cm è 0.01 di un metro
milli m 10 -3 1 mL è 10 -3 di un litro
micro µ 10 -6 1 µm è 10 -6 di un metro
nano n 10 -9 1 ng è 10 -9 di un grammo
pico p 10 -12 1 pg è 10 -12 di un grammo
Quantità Abbreviazione Equivalente
litro
l
millilitro ml 10 -3 l
(1 mL = 1 cm 3 = 1 cc)
microlitro µl 10 -6 l
(1 µL = 1 mm 3 )
Dal pedigree al DNA e ritorno
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Schema delle PCR e digestione con enzimi di restrizione
Vi vengono forniti i prodotti di PCR ottenuti amplificando il DNA dei diversi soggetti analizzati in ogni famiglia,
identificabili nei pedigree di §6.6. Lo schema delle PCR eseguite è quello riportato nei singoli scenari.
Scenario 1
Pr fw
MstII
Esone 1
Pr rev
376 bp
(Hb S)
Aggiungere ad ogni provetta:
DNA di III 1 e III 2
DNA di IV1 IV2, IV 3, IV 4
DNA 8 µl
Enzima MstII + tampone 10X 2 µl
175 + 201 bp (Hb A)
Incubare a 37°C per 40 min.
10 µl
Scenario 2
Pr fw
DdeI
Esone 4
Pr rev
Aggiungere ad ogni provetta:
DNA di II 6 e II 7
DNA di III 3, III 4, III 5, III 6
220 bp (normale)
130 + 90 bp (mutato)
DNA Scenario 3
8 µl
Enzima DdeI + tampone 10X 2 µl
Incubare a 37°C per 40 min.
10 µl
Pr fw
HindIII
Introne 19
Aggiungere ad ogni provetta:
DNA di I 2
DNA di II 2, II 3, II 4, II 5
DNA di III 1, III 2, III 3, III 4
Pr rev
717 bp (-)
DNA 8 µl
Enzima HindIII + tampone 10X 2 µl
167 + 550 bp (+)
(+)(+)(+
Incubare a 37°C per 40 min.
10 µl
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Elettroforesi su gel di agarosio: soluzioni e reagenti forniti
• tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10 della soluzione
“madre” TBE 10x, la cui composizione è:
Tris 108 gr (0,89 M), acido borico 55 gr (0,89 M),
EDTA 9.3 gr (0,02 M) pH 8,3,H 2 O a 1 litro. Il pH
8,3 viene raggiunto automaticamente.
• DNA
• marcatore di peso molecolare (DNA del plasmide pUC8 tagliato con l’enzima di restrizione HaeIII)
• agarosio in polvere (0.6 gr)
• H 2 O distillata
• Eurosafe (2 µl)
• loading dye 6x, già pronto in eppendorf e contenente:
• alcool etilico denaturato
blu di bromofenolo 0.25%
xxilene cianolo 0.25%
gglicerolo 30%
Preparazione del gel di agarosio
Nota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni dei
frammenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e
1000bp si utilizza un gel di agarosio al 2%.
Norme di lavoro:
per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico
prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani
pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato
prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che dovrà utilizzare,
in modo particolare con le micropipette
Operazioni da svolgere per la preparazione del gel di agarosio:
preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di “nastro adesivo di carta”
verificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia a bolla
prelevare 30 ml di tampone TBE 1x e metterlo nella beuta contenente l’agarosio
Attenzione a non sprecare agarosio: costa 600 euro al chilo!
pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: _______
leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione del forno a microonde”
sciogliere l’agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza di 500V per 1 minuto. Aprire poi il forno a
microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo attenzione a non scottarsi. Richiudere il
forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza
pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione di
agarosio al peso originale, utilizzando una spruzzetta con H 2 O distillata. Attenzione: far cadere l’acqua
delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenti si formano delle bolle
aspettare 3-5 minuti, coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzetto di stagnola, per
evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60°C, altrimenti rovina il
supporto di plastica della vaschetta dell’elettroforesi. Aggiungere Eurosafe 2 µl e versare la soluzione di agarosio,
evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi dove è già stato inserito il pettine. I pozzetti si formano
quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine
lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando il gel è solidificato diventa opaco
mentre si aspetta la solidificazione del gel, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel (12µl di loading
dye 1x) su altri gel già pronti
togliere il nastro di carta dalla vaschetta e posizionarla nella camera di corsa
versare il tampone TBE 1x nella camera di corsa (servono circa 200 ml), evitando che si formino bolle. Se si
formano bolle, toglierle delicatamente con un puntale
togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel. I pozzetti che si sono formati nel gel
hanno un volume di circa 15 µl
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Corsa elettroforetica
Operazioni da svolgere per la corsa elettroforetica:
aggiungere 2 µl di loading dye 6x a ciascuna provetta contenente il DNA. Risospendere con la micropipetta,
evitando di formare bolle. Il glicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA
da caricare nel pozzetto e quindi a facilitarne l’entrata nel pozzetto
se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo di laboratorio,
si dice “spinnare” da spin, centrifugare)
leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione della centrifuga”
posizionare la vaschetta per l’elettroforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i pozzetti
nel primo pozzetto a sinistra, caricare lentamente il marker di DNA a peso molecolare noto; caricare poi i
campioni (12 µl) nei pozzetti successivi (ogni pozzetto ha un volume di 15 µl), ponendosi con la punta della
micropipetta in un angolo del pozzetto e perpendicolare rispetto al gel, facendo attenzione a non bucare il fondo
del pozzetto e a non far uscrie il campione fuori dal pozzetto
chiudere il coperchio della cella elettroforetica
leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione dell’apparato per elettroforesi”
collegare i morsetti alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, detto anche power supply; il DNA
è carico negativamente e migra verso il polo positivo
fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 40 min
osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non si può
vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp,
mentre lo xilene cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa 4.000 bp. Attenzione: la corsa
elettroforetica deve essere fermata quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-2 cm dalla fine del gel, in modo
da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni di DNA!
Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforetica. Questa operazione viene svolta dal tutor:
osservare il gel al transilluminatore
documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel
il tampone da elettroforesi TBE (Tris/Borato/EDTA) può essere riutilizzato diverse volte. Recuperate il
tampone usato e versatelo in una bottiglia con un imbuto
pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato
dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani
leggere attentemente la “Nota di sicurezza sullo smaltimento dei rifiuti
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Analisi dei risultati
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Consulenza genetica
Scenario 1. Conferma del genotipo eterozigote dei genitori e del genotipo omozigote recessivo di IV 3. IV 1
e IV 2 sono sani, IV 4 (il feto) è portatore di anemia falciforme.
Scenario 2. II 6 è Hz per la mutazione portata da II 1; II 7 non ha questa mutazione. III 4 (probando) ha
ereditato dal padre la mutazione presente nello zio paterno II 1. Svilupperà la malattia. Dieta e statine III
3, a differenza del fratello, non ha ereditato la mutazione; III 5 e III 6 non hanno ereditato la mutazione
paterna.
Scenario 3. L’allele malattia è associato all’allele (-) del RFLP (III 1). Tutti gli individui sani hanno l’allele
(+). Maschi +/Y (II 3 e II 5); femmine +/+ (II 4) e +/- (portarici, la nonna I 2 e la madre II 2). Il feto III 4 ha
ereditato l’allele (-) dalla madre e quindi è emofilico. A richiesta della madre, è possibile eseguire un aborto
terapeutico.
Norme di sicurezza di sicurezza in laboratorio
Norme di sicurezza per l’utilizzo degli strumenti di laboratorio
Utilizzazione della centrifuga
• chiudere accuratamente il tappo delle provette, per evitare la fuoriuscita di liquido
e la formazione di aerosol
• assicurarsi che il rotore sia bilanciato: provette di ugual peso devono essere
inserite negli alloggiamenti diametralmente opposti
• chiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarla
• non cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore
• in caso di fuoriuscita di liquido dalle provette, avvertire il personale docente
Utilizzazione dell’apparecchiatura per elettroforesi
• assicurarsi che l’alimentatore sia spento, prima di collegare i morsetti
• assicurarsi che il coperchio della vaschetta sia correttamente posizionato, prima di
collegare i morsetti
• alla fine della corsa, prima di rimuovere il coperchio della cella elettroforetica,
spegnere l’alimentatore e staccare i morsetti
Smaltimento dei rifiuti
• tutto il materiale disposable (puntali, provette, pipette ecc.) va messo in appositi
contenitori per rifiuti
• cercare di ridurre al minimo il materiale da eliminare, visto i costi elevati del loro
smaltimento.
Manipolazione dell’Eurosafe
• usare i guanti disposable
• evitare di spargere il prodotto sul banco di lavoro
• terminata l’utilizzazione del prodotto o delle sue soluzioni, provvedere allo
smaltimento
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Norme generali di sicurezza in laboratorio
Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere tassativamente
rispettate.
Entrando in laboratorio, individuare le vie di fuga, indicate dalla segnaletica verde.
In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanti, con maniche
lunghe e polsini ad elastico. Al termine delle attività, prima di lasciare il laboratorio, togliersi il camice. In
ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree (biblioteca, uffici, bar, ecc.), senza aver prima
tolto il camice.
Non introdurre in laboratorio borse, zaini o altro materiale non necessario.
Indossare guanti monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso derivato non
fissato. I guanti devono essere rimossi con attenzione e sostituiti quando sono visibilmente contaminati. I
guanti si sfilano rovesciandoli e vanno gettati negli appositi contenitori.
Gli studenti che presentano dermatiti o altre lesioni sulle mani, devono indossare guanti protettivi in
tutte le fasi di lavoro.
I guanti vanno tolti, quando si usino strumenti di qualsiasi natura (telefono, tastiera, strumenti
scientifici, maniglie, ecc.). I guanti usati non vanno riutilizzati.
Lavare le mani routinariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materiali contaminati e,
in ogni caso, dopo la fine delle attività, anche quando sono stati indossati i guanti. Lavare sempre le mani
prima di lasciare il laboratorio.
In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare oggetti alla bocca ed applicare cosmetici.
Non pipettare mai con la bocca, ma utilizzare le apposite propipette.
Non appoggiare recipienti contenenti liquidi biologici vicino al bordo del banco di lavoro.
Tutto il materiale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come
potenzialmente infetto e pertanto trattato con le necessarie precauzioni.
Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologico (ad es.
schizzi di sangue) sul piano di lavoro, affinché si provveda alla decontaminazione con un germicida
chimico appropriato (candeggina, ecc.).
Decontaminare e pulire sempre, al termine del loro utilizzo, le apparecchiature scientifiche e, al
termine della attività, i piani di lavoro.
Seguire scrupolosamente le indicazioni di sicurezza riportate nei protocolli di esperimento.
Raccogliere tutti i liquidi biologici (sangue, terreni di coltura venuti a contatto con le cellule, cellule,
ecc.) in speciali contenitori per rifiuti, che verranno successivamente eliminati previo trattamento con
candeggina al 15%.
Mettere il materiale disposable (pipette, fiasche ecc.) venuto a contatto con materiale biologico in un
sacco apposito, che verrà smaltito mediante incenerimento.
Stante i costi elevati dello smaltimento, ridurre il più possibile l’uso del materiale disposable.
Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale di
protezione
A cura di:
• Prof.ssa Giovanna Viale, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi
di Milano;
• Prof.ssa Calciolari Tiziana, Liceo Scientifico Einstein, Milano
• Prof.ssa Capoccia Elena, Liceo Scientifico Donatelli Pascal, Milano
• Prof.ssa Clerici Valeria, Liceo Classico Legnani, Saronno
• Prof.ssa Defendi Erina, Liceo Classico Beccaria, Milano
• Prof.ssa Dotelli Annarosa, Liceo Scientifico, Novello Codogno
• Prof.ssa Grasso Maria, Liceo Scientifico Einstein, Milano
• Prof.ssa Mazzadi Franca Liceo Scientifico, Novello Codogno
• Prof.ssa Modelli Alessandra, Liceo Classico Beccaria, Milano
• Prof.ssa Parisi Elisabetta, Liceo Scientifico Severi, Milano
• Prof. ssa Pisauro Lucia, Liceo Virgilio, Milano
• Prof.ssa Porta Marina, Liceo Scientifico Banfi, Vimercate
• Prof.ssa Vanzulli Lucina, Liceo Classico Legnani, Saronno
Si ringrazia la Eppendorf Italia
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