Studio e sviluppo di metodi computazionali per l'analisi delle ...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA
FACOLTÀ DI SCIENZE
MATEMATICHE, FISICHE e NATURALI
Corso di Laurea in Informatica
Tesi di Laurea
Studio e sviluppo
di metodi computazionali
per l’analisi delle conformazioni
di molecole
Relatore:
Prof. Alessandro Dal Palù
Candidato:
Tommaso Nanu
Correlatore:
Prof. Pietro Cozzini
Anno Accademico 2010/2011

A mannedda mea Mariantonia
e a thiu Zoseppe.

Ringraziamenti
Sono passati ben cinque anni da quando ho fatto i bagagli e ho lasciato la
mia famiglia, i miei amici e la mia terra di origine. Sono parecchi anni.
Se in questo momento sto scrivendo queste poche righe, lo devo tutto ai miei
genitori, Lucia e Tonino. Nei limiti del possibile, mi è stato concesso tutto,
non mi è mai stato fatto mancare niente.
E grazie anche di aver concepito la mia sorellona, Susanna. Con lei ho passato
quasi tutti i momenti della mia vita, brutti e belli. Grazie Susà!
Un sentito ringraziamento va al Professor Alessandro Dal Palù che nonostante
mille impegni è riuscito a dedicare numerose ore alla buona riuscita del lavoro
di tirocinio e di tesi. Ringrazio anche il Professore Pietro Cozzini per la
disponibilità concessa.
Un ringraziamento va a tutti gli amici di Olbia e di Parma che, in tutti questi
anni, mi hanno sopportato. Un grazie particolare va a Michi: senza di lui, a
quest’ora, potrei rotolare solo da una strada in discesa!
i

Indice
Introduzione
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1 Background 1
1.1 Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Caratteristiche strutturali . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 Sito attivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2 Legame chimico e forze intermolecolari . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 Forze intermolecolari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3 Strutture dati fondamentali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.1 Grafo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4 Programmazione a vincoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4.1 Alberi di ricerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Drug Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6 Algoritmi di Docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6.1 Algoritmi con corpi rigidi . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6.2 Algoritmi con ligando flessibile . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6.3 Docking attraverso simulazione . . . . . . . . . . . . . 15
1.6.4 Panorama del mercato attuale . . . . . . . . . . . . . . 16
2 Scopo della Tesi 19
2.1 Ligand-rotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.1 Analisi dei requisiti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3 Formalizzazione 23
3.1 Modello del problema a vincoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1.1 Variabili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1.2 Dominio delle variabili . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1.3 Vincoli implementati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Visita dello spazio di ricerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2.1 Albero di ricerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Generazione delle conformazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
iii

iv
INDICE
3.4 Rotazione di un legame . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.5 Esplorazione del sito attivo della proteina . . . . . . . . . . . . 34
3.5.1 Construzione delle basi ortonormali . . . . . . . . . . . 35
3.5.2 Generazione ligandi base . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.5.3 Campionamento di S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4 Dettagli implementativi 37
4.1 Inizializzazione di ligand-rotation . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.1.1 Acquisizione informazioni di configurazione . . . . . . . 38
4.1.2 Struttura file mol2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2 Strutture dati del risolutore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2.1 Matrice di Vicinanza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.2 Discretizzazione di un sottoinsieme limitato di R 3 . . . 42
4.2.3 Celle contenenti atomi ‘vicini’ . . . . . . . . . . . . . . 45
4.3 Algoritmo di ligand-rotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.3.1 Parte I: inizializzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.3.2 Parte II: generazione conformazioni . . . . . . . . . . . 48
4.4 Consistenza del vincolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.4.1 Verifica dei vincoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.5 Accenni di Complessità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5 Risultati 53
5.1 Applicazioni possibili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.2 Efficienza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.2.1 Variazione parametri qualitativi . . . . . . . . . . . . . 57
5.3 Confronti su visite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.3.1 DFS sul grafo della molecola . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.3.2 Modifica della DFS: first fail . . . . . . . . . . . . . . . 62
6 Conclusioni e Sviluppi futuri 65
6.1 Molecole contenenti cicloesano . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
6.1.1 Cicloesano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.1.2 Nuovi gradi di libertà . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.2 Espansione modello a vincoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.2.1 Controllo lunghezza legame . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.2.2 Implementazione propagazione dei vincoli . . . . . . . 68
Bibliografia 71

Introduzione
La costruzione di un farmaco capace di interagire correttamente con la causa
di una malattia è un compito molto complesso. Durante le fasi iniziali, dopo
aver individuato il processo biologico su cui intervenire per modificare il decorso
della malattia, ricercatori e medici selezionano alcuni composti guida,
ossia potenziali candidati per il principio attivo del farmaco.
Un composto guida, precursore di un futuro farmaco, viene studiato e
testato meticolosamente. Una prima fase prevede che venga sperimentato su
colture di cellule, in modo da attestarne l’efficacia e il grado di sicurezza
per l’organismo. Dopo aver superato i test della fase precedente, ha inizio lo
studio su animali e uomo.
La ricerca del composto guida non è semplice; si possono seguire molte
strade. Per esempio, si possono analizzare le attività farmacologiche possedute
da estratti di piante, si può partire dalla valutazione degli effetti collaterali
di altri farmaci già in commercio oppure si può seguire un metodo sperimentale,
usato in chimica farmaceutica, consistente nello studio della relazione
struttura-attività della molecola in esame.
Un approccio utilizzato negli ultimi vent’anni consiste nella progettazione
di nuovi farmaci a partire dalle simulazioni delle interazioni tra farmaco
e recettore. Ciò è possibile grazie alle nuove tecnologie informatiche e al
progredire delle conoscenze di farmacologia molecolare.
Attualmente esistono numerosi pacchetti software in grado di progettare
molecole in modo efficiente. Tuttavia, esiste una lacuna insita nel loro algoritmo
di costruzione dovuta non ad un errore di programmazione o all’utilizzo
di modelli scorretti (cioè le soluzioni ottenute sono, pur sempre, attendibili),
bensì all’elevato numero di falsi positivi generati dai suddetti algoritmi,
che potrebbero, quindi, causare la perdita di potenziali composti guida. In
breve, un falso positivo è una molecola con struttura tridimensionale geometricamente
corretta accettata da un pacchetto di docking e rifiutata da un
altro. Ciò è causato dai diversi approcci su cui si basano i programmi, in
particolare dal differente algoritmo utilizzato per il calcolo dell’energia delle
molecole che verificherà se il composto guida, all’interno del target proteico,
v

vi
INDICE
è energeticamente stabile.
Nel presente lavoro di tesi, in collaborazione con il Dipartimento di Chimica
e il Dipartimento di Matematica dell’Università di Parma, verrà presentata
una possibile soluzione al problema evidenziato esibendo un programma esente
dal difetto che andrà a costruire geometricamente dei potenziali principi
attivi.
Nel capitolo 1 verranno introdotte e descritte le conoscenze di base, utili
per capire al meglio le argomentazioni trattate in questa tesi, e i metodi
matematico-informatici utilizzati nella formalizzazione e nella implementazione
del pacchetto software. Nel capitolo 2 si definiranno i requisiti funzionali
del nuovo programma. Il capitoli 3 e 4 introducono formalmente i principi
e le tecniche dettagliate utilizzate affinché si generino delle molecole attendibili.
Nel capitolo 5 si elencheranno tutti i test effettuati che andranno a
misurare prestazioni del programma e qualità dei candidati generati. Infine,
nel capitolo 6 verranno presentati dei possibili ampliamenti e suggerimenti
da adottare nelle versioni successive del software.

Capitolo 1
Background
Questo capitolo si propone l’obiettivo di illustrare le conoscenze di base
trattate in questo lavoro di tesi.
Nella sezione 1.1 verranno introdotte le proteine, sostanze di fondamentale
importanza per gli esseri viventi; il tema principale è rivolto alla loro struttura
e funzionalità.
Nella sezione 1.2 verrà data la nozione di legame chimico. Verrà, inoltre,
presentata la struttura dati grafo e alcune sue proprietà nella sezione 1.3.1;
grazie ad esso è possibile dare una rappresentazione astratta al concetto di
molecola.
Nella sezione 1.4 si descriverà la tecnica di programmazione a vincoli,
dandone una definizione formale; parte di queste tecniche sono state utilizzate
in questa tesi con lo scopo di poter esprimere vincoli da applicare agli atomi
delle molecole che andremo a generare.
La parte finale di questo capitolo (sezione 1.5) affronterà le nuove tecniche
e gli approcci utilizzati per la sintesi di nuovi farmaci, il Drug Design e il Docking.
Faremo, in aggiunta, una carrellata dei principali programmi di Docking
in commercio, marcando le loro caratteristiche e i loro limiti funzionali.
1.1 Proteine
Le proteine sono polimeri naturali composti da unità di amminoacido legate
fra loro da legami peptidici. Sono sostanze di primaria importanza per la
struttura, il funzionamento e la riproduzione della materia vivente.
Gli amminoacidi si concatenano nei peptidi e nelle proteine mediante la
formazione di legami peptidici fra il gruppo carbossilico di un amminoacido e
il gruppo amminico in α di un altro amminoacido, rispettivamente, il carbonio
1

2 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Figura 1.1: Legame peptidico
legato ai due ossigeni in ‘Amino acid (1)’ e l’azoto legato a due idrogeni in
‘Amino acid (2)’, figura 1.1.
Tranne che nella glicina, dove R = H, il carbonio in α è un centro stereogeno
1 . La figura 1.2 riporta i venti α-amminoacidi comunemente reperibili
nelle proteine. Tutti hanno un nome comune, inoltre per ognuno c’è un codice
di tre lettere ed un codice di una lettera usata nella scrittura di formule di
peptidi o di proteine.
1.1.1 Caratteristiche strutturali
Si possono individuare quattro livelli di struttura di una proteina:
• Struttura primaria
• Struttura secondaria
• Struttura terziaria
• Struttura quaternaria
1 Un atomo di carbonio legato a quattro gruppi diversi si definisce asimmetrico o chirale
e costituisce un centro stereogeno

1.1. PROTEINE 3
Figura 1.2: Amminoacidi

4 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Struttura primaria
La struttura primaria è formata dalla sequenza specifica degli amminoacidi.
Lo scheletro peptidico di tale struttura è il risultato della regolare successione
di tre atomi −N − C − C− appartenenti, rispettivamente, al gruppo
amminico, all’atomo di carbonio α e al gruppo carbossilico di ogni residuo.
I livelli superiori della struttura di una proteina, dati dalle modalità di
ripiegamento locale e dal ripiegamento dell’intera molecola, conferiscono alla
proteina la forma finale biologicamente attiva; tuttavia questi ripiegamenti
derivano dalla struttura primaria. Le differenti proprietà associate a una
precisa sequenza amminoacidica determinano il modo in cui la proteina può
ruotare o ripiegarsi assumendo una specifica e stabile struttura tridimensionale
che la distingue da tutte le proteine. I legami coinvolti nella struttura
primaria sono covalenti mentre nei livelli successivi sono presenti legami a
idrogeno, più deboli dei primi.
Struttura secondaria
Come descritta in [3], la struttura secondaria di una proteina è data dalle
modalità di ripiegamento della catena polipeptidica. Esistono principalmente
tre 2 tipi diversi di struttura secondaria: α-elica, β-foglietti e loop.
L’α-elica è una spirale destrorsa nella quale i gruppi R si proiettano all’esterno
dello scheletro peptidico perpendicolarmente all’asse dell’elica. La
struttura a elica di un polipeptide è stabilizzata dalla formazione di legami
a idrogeno tra gli atomi di idrogeno del gruppo amminico di un residuo amminoacidico
e gli atomi di idrogeno del gruppo carbonile di un altro residuo
(figura 1.3). Quando questo modello di legami a idrogeno si ripete regolarmente
lungo un segmento di catena polipeptidica, viene a stabilizzarsi la
struttura ripiegata ad α-elica.
La struttura a foglietto β a pieghe si forma quando due o più catene
polipeptidiche sono quasi completamente distese e giacciono l’una accanto
all’altra. Il foglietto è stabilizzato da legami a idrogeno che si formano tra i
gruppi amminici di una catena e i gruppi carbonili dell’altra. Questa struttura
può essere formata da catene polipeptidiche diverse oppure da differenti
regioni della stessa catena polipeptidica la quale si ripiega su se stessa.
Struttura terziaria
Affinché la molecola assuma la caratteristica struttura compatta è necessario
che la catena polipeptidica cambi direzione in corrispondenza di particolari
2 Esistono altri tipi di strutture, ma comunque meno frequenti.

1.1. PROTEINE 5
Figura 1.3: Dettaglio di una α-elica.
punti, ripiegandosi in varie direzioni. La struttura terziaria rappresenta la
disposizione, l’organizzazione nello spazio che una proteina assume in dipendenza
della sua specifica struttura primaria. La stabilizzazione della struttura,
secondo [3], è data dalle interazioni chimiche tra i gruppi R (le catene
laterali dei residui amminoacidici).
• Tra specifici residui di cisteina possono formarsi legami covalenti disolfuro
che contribuiscono a mantenere il corretto ripiegamento di una
catena polipeptidica.
• Le catene laterali idrofobiche possono aggregarsi all’interno della molecola
proteica venendo escluse dal contatto con le molecole di acqua e
contribuendo al processo di ripiegamento.
• Le forze di van der Waals possono stabilizzare le strette interazioni tra
residui idrofobici.
• Legami ionici tra catene laterali con carica positiva e negativa situate
all’interno di una proteina, lontano dal contatto con le molecole di
acqua, possono formare ponti salini.

6 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Struttura quaternaria
Molte proteine nella loro forma funzionalmente attiva sono formate da due
o più catene polipeptidiche, dette subunità, ognuna delle quali è ripiegata
in modo da assumere la propria peculiare struttura terziaria. La struttura
quaternaria è il risultato del modo in cui le subunità proteiche si associano
e interagiscono nell’intera proteina. Come descritto in [3], l’emoglobina è un
chiaro esempio di proteina con struttura quaternaria (figura 1.4). Interazioni
idrofobiche, forze di van der Waals, legami a idrogeno ionici stabilizzano l’associazione
delle quattro catene polipeptidiche che costituiscono la molecola
dell’emoglobina.
Figura 1.4: Esempio di struttura quaternaria: l’emoglobina. È possibile
identificare quattro sub-unità, due in rosso e due in blu.
La specifica forma delle proteine permette loro di legare non covalentemente
altre molecole e ciò, a sua volta, è seguito da altri eventi biologicamente
importanti come ad esempio:
• una sostanza può penetrare all’interno di una cellula legandosi a una
proteina trasportatrice

1.2. LEGAME CHIMICO E FORZE INTERMOLECOLARI 7
• una reazione chimica può essere accelerata quando una proteina enzimatica
lega uno dei reagenti
• segnali chimici come gli ormoni possono legarsi a proteine presenti sulla
superficie esterna di una cellula
L’acquisizione di informazioni riguardanti la struttura tridimensionale e
il processo con cui una proteina si ripiega (protein folding) è di notevole importanza.
Grazie a ciò è possibile fare delle inferenze funzionali sulla proteina
a partire dal dogma fondamentale della biologia:
Struttura ⇐⇒ Funzione
nel senso che ad ogni diversa organizzazione strutturale della proteina è
associata una specifica funzione biologica.
La conoscenza dell’esatta forma di una molecola proteica e di ciò che vi
si può legare è fondamentale non solo per comprendere la biologia di base,
ma anche in altri campi come la medicina. Un esempio fu la determinazione
della struttura tridimensionale di una proteina essenziale per la replicazione
del virus HIV che permise la progettazione di specifiche molecole capaci di
legarsi a questa e di bloccarne l’azione ([3]).
1.1.2 Sito attivo
Il sito attivo è una porzione di enzima 3 implicata nella formazione di legami
con substrati 4 , che daranno luogo ad una reazione chimica. Il sito attivo di
un enzima si trova solitamente in una tasca di quest’ultima ed è rivestito
da residui amminoacidici che partecipano al riconoscimento del substrato; è
anche il punto su cui agiscono gli inibitori enzimatici. I substrati si legano al
sito attivo per mezzo di legami chimici (si faccia riferimento alla sezione 1.2)
come quello idrogeno, covalente o tramite interazioni idrofobiche, andando a
formare un complesso.
1.2 Legame chimico e forze intermolecolari
Come definito in [4], il legame chimico è una connessione tra atomi. Si forma
tra due atomi se la risultante disposizione dei nuclei e degli elettroni possiede
energia minore di quella totale corrispondente ai due atomi separati. Se la
3 L’enzima è una proteina che catalizza reazioni chimiche
4 Molecole su cui agisce un enzima

8 CAPITOLO 1. BACKGROUND
minore energia si può conseguire trasferendo completamente uno o più elettroni
da un atomo all’altro, si formano ioni e il composto sarà tenuto insieme
dall’attrazione elettrostatica tra tali ioni, che viene definita legame ionico.
Nel caso in cui l’energia minore si possa conseguire condividendo elettroni,
gli atomi si congiungeranno tramite un legame covalente e si formeranno molecole
distinte. Un terzo tipo di legame è il legame metallico, che vede un
grande numero di cationi 5 vincolati da una mare di elettroni.
Un legame tra due atomi può essere di tre tipi: semplice, doppio o triplo.
I legami che andremo a considerare nelle rotazioni saranno tutti legami covalenti
del primo tipo, ovvero semplici. I restanti due, a causa della loro natura
chimica, non possono ruotare su loro stessi senza rincorrere allo sconveniente
di spezzare il legame.
1.2.1 Forze intermolecolari
Le forze intermolecolari sono interazioni deboli di natura elettrostatica tra
molecole neutre e ioni. Le energie coinvolte in questi tipi di interazione sono
di gran lunga inferiori rispetto al legame chimico intramolecolare. A differenza
dei legami intratomici, le forze intermolecolari tengono unite due o più
molecole in modo non covalente. In riferimento al lavoro svolto in questa tesi,
queste forze rappresentano l’interazione che più ci interessa. Grazie ad esse,
un ligando ha la possibilità di entrare a contatto con il sito attivo di una
proteina, con la conseguente formazione di un complesso.
1.3 Strutture dati fondamentali
1.3.1 Grafo
Si definisce grafo una coppia ordinata G = (V, E) tale che:
• V è l’insieme dei nodi
• E è l’insieme {(a, b) : a ∈ V ∧ b ∈ V }, chiamato insieme degli archi.
Si possono distinguere due tipi di grafo: grafo orientato o diretto e grafo
non orientato. Nel primo caso, ogni arco specifica la direzione della connessione,
ovvero si può distinguere il nodo di partenza e il nodo di arrivo; nel
secondo, non c’è distinzione tra i due nodi componenti l’arco.
Definizione 1.1. L’insieme degli archi E O di un grafo orientato O = (V O , E O )
è l’insieme delle coppie ordinate (a, b) con a, b ∈ V O
5 Un catione è un atomo carico positivamente.

1.4. PROGRAMMAZIONE A VINCOLI 9
Definizione 1.2. L’insieme degli archi E N di un grafo non orientato N =
(V N , E N ) è l’insieme delle coppie non ordinate {a, b} con a, b ∈ V N
Si definisce grafo semplice un grafo che non contiene archi orientati.
Definizione 1.3. Si definisce percorso un insieme di vertici {v 0 , v 1 , . . . , v n }
e una sequenza di archi {(v o , v 1 ), (v 1 , v 2 ), . . . , (v n−1 , v n )} che li collegano; v 0
e v n rappresentano gli estremi del cammino.
Un percorso che abbia gli archi distinti, viene definito cammino; se v o = v n
il cammino si chiama circuito o ciclo.
Definizione 1.4. Sia G = (V, E) un generico grafo e siano u, v ∈ V due
generici vertici di G. Se esiste un cammino con estremi u e v allora i due
vertici sono connessi. Inoltre, la relazione di connessione è di equivalenza.
A partire dalla relazione di equivalenza precedente, si possono definire k
classi di equivalenza chiamati sottografi e definiti come
G i = (V i , E i ) per i = 0, . . . , k
dove V i ⊆ V e E i ⊆ E. Più semplicemente, un generico G i è un sottografo
massimale che contiene tutti gli elementi connessi tra loro. L’insieme di questi
sottografi prende il nome di componenti connesse di G e la sua cardinalità si
indica con γ(G); ne segue che se γ(G) = 1, allora il grafo è connesso.
1.4 Programmazione a vincoli
La programmazione a vincoli è un paradigma di programmazione dove le
relazioni tra variabili possono essere dichiarate in forma di vincoli. I vincoli
differiscono dalle primitive normalmente definite dagli altri linguaggi di
programmazione per il fatto che non specificano azioni singole da eseguire
passo-passo, ma, piuttosto, si limitano a specificare le proprietà di cui deve
essere dotata la soluzione da trovare.
La nozione centrale di questa tecnica è, appunto, il vincolo (per esempio
X > 5, X + Y < 20); esso, definito su una sequenza di variabili, è
semplicemente una relazione sul loro dominio. Più formalmente,
Definizione 1.5. [Dominio] Sia y 1 , . . . , y k una sequenza di variabili. Diremo
che D 1 × · · · × D k è il dominio loro associato se l’insieme di tutti i valori
possibili assunti da ogni y i è proprio l’insieme D i , per i = 1, . . . , k. In formule:
y i ∈ D i ,
∀i = 1, . . . , k

10 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Definizione 1.6. [Vincolo] Consideriamo una sequenza finita di variabili
Y := y 1 , . . . , y k , con k > 0, e D 1 , . . . , D k il dominio associato loro. Un vincolo
C su Y è un sottoinsieme di D 1 × · · · × D k .
A sua volta, si definisce Problema di soddisfacimento dei vincoli o Constraint
Satisfaction Problem, da cui l’acronimo (CSP), un insieme di vincoli
applicati a un insieme di variabili.
Definizione 1.7. Per Problema di soddisfacimento dei vincoli si intende
una sequenza finita di variabili X := x 1 , . . . , x k , con dominio rispettivamente
D 1 , . . . , D k , insieme ad un insieme finito C di vincoli, ognuno su un
sottoinsieme di X.
Denotiamo un CSP con la dicitura 〈C; D E 〉, con:
D E := {x i : x i ∈ D i }
∀i = 1, . . . , n
dove, C è l’insieme dei vincoli definiti sul CSP e D E l’insieme dei valori
del dominio.
Una volta formulato il problema P con l’introduzione delle variabili (e
del loro rispettivo dominio) e i vincoli definiti su di esse si procede con la
risoluzione di P attraverso un Solver, composto principalmente da due parti:
propagazione dei vincoli e ricerca delle soluzioni. La risoluzione di P ci
permette di stabilire se:
• il problema è consistente, cioè se ammette soluzione;
• la soluzione o le soluzioni;
Definiamo formalmente il concetto di soluzione di un CSP.
Definizione 1.8. Sia 〈C; D E 〉 un CSP con D E := x 1 ∈ D 1 , . . . , x n ∈ D n .
Diciamo che (d 1 , . . . , d n ) ∈ D 1 × · · · × D n soddisfa un vincolo C ∈ C sulle
variabili x i1 , . . . , x im se (d i1 , . . . , d im ) ∈ C. Inoltre (d 1 , . . . , d n ) ∈ D 1 ×· · ·×D n
è una soluzione per P se soddisfa ogni vincolo C ∈ C.
Esempio 1.1. Sia 〈x < y; x ∈ [0, 10] , y ∈ [5, 10]〉; allora tutte le soluzione del
problema appena esposto sono l’insieme delle coppie (a, b) con a ∈ [0, 10] e b ∈
[5, 10] tali che a < b.

1.4. PROGRAMMAZIONE A VINCOLI 11
Ricerca delle soluzioni
La ricerca delle soluzioni di un CSP è effettuata attraverso l’esplorazione
di un albero, detto albero di ricerca, dove ad ogni livello compaiono tutte le
possibili scelte di una precisa variabile. Un percorso radice-foglia rappresenta
una possibile soluzione e, se questa è consistente con l’insieme dei vincoli
introdotti nel problema, allora è effettivamente una soluzione.
Propagazione dei vincoli
L’esplorazione di tutto l’albero (il quale cresce esponenzialmente rispetto al
numero delle variabili) potenzialmente, potrebbe diventare un processo molto
lento. Di conseguenza, si introducono le tecniche della propagazione, il cui
scopo è di riscrivere un vincolo C in uno equivalente, con l’applicazione di
determinate regole atte a soddisfare alcune proprietà di consistenza locale.
L’obiettivo è quello di ridurre l’albero di ricerca con l’eliminazione dei suoi
sottoalberi che sicuramente non portano a soluzioni consistenti.
Nello specifico, si hanno tre tipi di regole:
• regole di Riduzione del Dominio, come conseguenza dell’applicazione
dei vincoli alle variabili
• regole di Trasformazione, cioè semplificazione dei vincoli
• regole di Introduzione, grazie alle quali si aggiungono nuovi vincoli
impliciti
1.4.1 Alberi di ricerca
Affinché si trovino tutte le soluzioni consistenti del problema, si ricorre agli
alberi di ricerca e agli algoritmi per esplorarlo, algoritmi di ricerca. È doveroso
precisare che l’algoritmo di ricerca non costruisce un albero di ricerca per poi
esplorarlo successivamente; in realtà, l’albero viene costruito ‘al volo’ durante
l’algoritmo di esplorazione.
Definizione 1.9. Dati due CSP P 1 e P 2 e una sequenza X di variabili comuni
ai due problemi, diremo che P 1 e P 2 sono equivalenti se:
• per ogni soluzione d per P 1 , esiste una soluzione per P 2 e, quest’ultima,
coincide proprio con d sulla sequenza di variabili X.
• per ogni soluzione e per P 2 , esiste una soluzione per P 1 e, quest’ultima,
coincide proprio con e sulla sequenza di variabili X.

12 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Definizione 1.10. Siano P un CSP e x 1 , . . . , x n una sequenza di variabili.
A è un albero di ricerca finito per P se rispetta le seguenti clausole:
• tutti i suoi nodi sono degli altri CSP
• la radice è proprio P
• i nodi di un livello pari hanno esattamente un discendente diretto
• se P 1 , . . . , P m con m ≥ 1, sono discendenti diretti di P 0 , allora l’unione
di P 1 , . . . , P m è equivalente a P 0 (in relazione a X).
Figura 1.5: Esempio di un Albero di Ricerca.
Operativamente, l’idea alla base di una visita di un albero di ricerca è
la seguente: si parte dalla radice e si prosegue visitando un figlio per tutte
le sue scelte possibili. La visita è ricorsiva e nel momento in cui ci si trova
ad avere un vincolo inconsistente si risale verso l’alto (backtracking) in cerca
di un nodo con delle scelte ancora possibili; la ricerca di tutte le decisioni
termina nel nodo radice.
1.5 Drug Design
Dal momento in cui strutture tridimensionali di proteine derivate da cristallografia
a raggi X o spettroscopia NMR, divennero disponibili, si vide la

1.5. DRUG DESIGN 13
nascita di pacchetti software in grado di utilizzare queste informazioni per
dar vita al progetto chiamato Drug Design. Il problema che questi software
devono affrontare è quello del Docking, ovvero di predire un complesso energeticamente
favorevole composto da una proteina e una molecola (ipotetico
farmaco), chiamato in questo contesto, ligando.
Il Drug Design ha l’obiettivo di trovare una struttura guida, una piccola
molecola che si lega ad una precisa proteina target e che può essere studiata
a fondo per diventare un farmaco.
Dal punto di vista biologico, legare una piccola molecola ad una specifica
proteina significa poter inibire la sua funzione, in modo tale da poter rendere
la sua azione verso l’organismo inoffensiva o, accelerare la sua funzione,
simulando l’intervento del naturale ligando.
Il metodo che sta alla base del Drug Design è il concetto di chiave-toppa
(ligando-proteina): quel che si vuole ottenere è una serie di chiavi valide per
quella specifica toppa.
Figura 1.6: Figura rappresentante il docking tra una piccola molecola (in
marrone) e una proteina target per dar vita ad un complesso
Molti aspetti fanno del Docking un problema difficile da risolvere. Primo
tra tutti quello che riguarda il problema dello Scoring, ovvero calcolare e
assegnare un punteggio al modo in cui ligando e proteina si legano tra loro
per andare a formare il complesso. Al giorno d’oggi, non esiste una funzione
di scoring “d’uso generale” che permetta di predire in modo accurato ciò. In
secondo luogo, è necessario considerare l’elevato numero di gradi di libertà:
il più importante è quello relativo al possibile orientamento spaziale della
proteina e del ligando e la conformazione di quest’ultimo.
Inoltre, può variare la conformazione della proteina, si possono aggiungere
molecole d’acqua tra le molecole e può cambiare lo stato di protonazione 6 .
Ciò implica che le funzioni di scoring contengano tipicamente molti minimi
locali di energia difficili da ottimizzare.
6 La protonazione è una reazione che consiste nell’addizione di un protone, cioè un
idrogeno carico positivamente (H + ), ad un atomo, ad una molecola o ad uno ione. La
specie protonata subisce variazioni chimico-fisiche (idrofilia, proprietà ottiche, etc..).

14 CAPITOLO 1. BACKGROUND
Malgrado non esista una soluzione generale al problema del docking, sono
stati sviluppati molti algoritmi specializzati in vari aspetti del problema e
applicati in modo soddisfacente.
1.6 Algoritmi di Docking
Il Docking è una tecnica computazionale atta a generare varie conformazioni
di piccole molecole all’interno del sito attivo di una proteina. Successivamente
viene applicata una funzione di scoring ai risultati, in modo tale da poter
ottenere una lista dei vari ligandi in base ad un certo punteggio: maggior
punteggio uguale maggiore stabilità.
Come descritto in [1], esistono diversi approcci per risolvere il problema
del Docking.
1.6.1 Algoritmi con corpi rigidi
Questi sono stati i primi algoritmi ad essere stati sviluppati. Sia la proteina
che il ligando vengono tenuti fissi nella loro conformazione spaziale e la
complessità del problema si riduce alla ricerca dell’orientamento, con energia
minore, tra le due molecole. Sicuramente, il punto a favore di questa classe
di algoritmi è la velocità di elaborazione: pochi gradi di libertà e vincoli assicurano
delle prestazioni notevoli. Tuttavia, maggiore è la velocità di ricerca,
minore è la qualità dei ligandi trovati; infatti, a causa dei pochi movimenti
simulati, non si esplorano tutte le possibili combinazioni di un ligando.
1.6.2 Algoritmi con ligando flessibile
La limitazione maggiore della precedente classe di algoritmi consiste nell’ignorare
completamente la flessibilità del ligando. Infatti, spesso piccole molecole
hanno uno spazio conformazionale molto ampio con livelli energetici molto
bassi, e quindi stabili.
Algoritmi a costruzione incrementale
Uno degli algoritmi usati frequentemente, facente parte di questa classe, è la
costruzione incrementale, che si basa sul concetto di frammentazione. Il ligando
viene suddiviso in numerosi frammenti, i quali costituiscono una porzione
di ligando rigida, ovvero gli atomi che lo compongono non si muovono. In
breve, l’algoritmo funziona nel modo seguente: viene piazzato il primo frammento
del ligando (chiamato frammento àncora) nel sito attivo della protei-

1.6. ALGORITMI DI DOCKING 15
na; quindi si procede al piazzamento in successione dei restanti frammenti,
collegandoli l’un l’altro in sequenza e validandoli con il calcolo dell’energia.
In altre parole, si possono riconoscere tre fasi:
• selezione del frammento base;
• piazzamento del frammento base;
• costruzione incrementale del ligando con i frammenti successivi.
Il grado di libertà di questo algoritmo è dato dalla rotazione dei legami singoli.
Algoritmi genetici
L’algoritmo genetico è un metodo euristico di ricerca e ottimizzazione che
imita il processo di evoluzione. L’idea generale è quella di partire da un certo
numero di possibili soluzioni (individui) chiamate popolazione e, a ciascuna
iterazione, operare una selezione di individui, impiegandoli per generare nuovi
elementi della popolazione stessa, così da costituire una nuova popolazione
per l’iterazione (o generazione) seguente. Tale successione di generazioni
evolve verso una soluzione ottimale (locale o globale) del problema assegnato.
L’evoluzione viene ottenuta attraverso una parziale ricombinazione delle
soluzioni, e l’introduzione di mutazioni casuali nella popolazione di partenza;
sporadicamente nascono individui con caratteristiche non comprese tra
quelle presenti nei dati della specie originaria. Finita la fase di evoluzione la
popolazione risultante viene analizzata e vengono tenute solo le soluzioni che
meglio risolvono il problema: gli individui con le qualità più adatte all’ambiente
in cui si trovano hanno quindi maggiori possibilità di sopravvivere e
riprodursi. Queste soluzioni subiranno una nuova fase di evoluzione e così
via. Questa classe di algoritmi viene utilizzata in vari campi; per esempio,
in biologia molecolare è utilizzato per predire l’adattamento di un genoma
all’ambiente, riconducendosi quindi all’evoluzione della specie introdotta da
Charles Darwin.
1.6.3 Docking attraverso simulazione
Al contrario dei metodi appena menzionati, esistono algoritmi che affrontano
il problema attraverso tecniche di simulazione. Questi algoritmi partono
da una conformazione iniziale per poi passare ad altre ad energia minore,
attraverso piccoli movimenti effettuati alla struttura e scartando quelle più
instabili. Alcuni algoritmi facenti parte di questa categoria sono Simulazioni
di Dinamica Molecolare, algoritmi di Monte-Carlo, Metodi ibridi ottenuti
combinando due o più algoritmi.

16 CAPITOLO 1. BACKGROUND
1.6.4 Panorama del mercato attuale
La scelta di un pacchetto di Docking è una operazione tutt’altro che semplice;
prima di procedere all’acquisto, le case farmaceutiche eseguono particolari
test su uno spettro molto ampio di complessi. Nel 2006 è stato condotto
uno studio dalla GlaxosmithKline [7] volto a fare una indagine sullo stato
attuale delle tecniche computazionali per il drug design ed in particolare
sul docking e sulle funzioni di scoring. Da pochi anni a questa parte, sono
stati pubblicati un numero sempre crescente di valutazioni su pacchetti di
docking e funzioni di scoring, includendo recensioni sulle nuove tecniche,
facendo confronti tra più programmi di docking e studiando le correlazioni
tra i punteggi formulati dal docking e i punteggi calcolati dall’affinità del
composto (quanto due molecole si legano bene). Questo, invece, differisce
dalle solite valutazioni per due motivi: primo, si misurano le performace di
molti pacchetti di docking su numerosi target, secondo, il set dei composti per
ogni target è costituito da un gran numero di composti relativamente correlati
tra loro, per cui le affinità sperimentali sono state misurate utilizzando un
protocollo standard, sviluppato solitamente dallo stesso gruppo di ricerca.
Sono stati presi in esame 10 differenti pacchetti; in particolare, alcuni di
questi offrono più funzioni di scoring o algoritmi di docking per un totale di
19 protocolli.
Il focus della valutazione si basa su tre usi tipici di questi pacchetti:
1. predizione delle conformazioni di piccole molecole all’interno della proteina
target;
2. virtual screening di banche dati volto all’identificazione di composti per
vari target di proteine;
3. predizione dell’affinità dei composti
Risultati dello studio valutativo
Per quanto riguarda la predizione delle conformazioni di piccole molecole, si
ottengono dei buoni valori per tutti i tipi di target proteici; in particolare, per
tutti i target (tranne uno), almeno un programma riesce a posizionare più del
40% dei ligandi entro i 2Å rispetto la struttura cristallina 7 . Infatti, per molti
target proteici, il 90% dei relativi ligandi potrebbe avere una orientazione
corretta; da ciò si deduce che gli algoritmi di docking riescono ad esplorare lo
7 Questo è un buon risultato: significa che la distanza media tra la molecola originata e
la struttura cristallina è minore di 2Å

1.6. ALGORITMI DI DOCKING 17
spazio conformazionale sufficientemente bene da ottenere delle buone conformazioni.
Il problema è di natura diversa: non esiste nessun programma che
abbia valore generale, cioè che ottenga buoni risultati per un qualsiasi target
proteico.
Per quanto riguarda il Virtual Screening, questo ha successo quando
si utilizzano dei dati che simulano una tipica classe di composti farmacueutici.
Inoltre, in assenza di informazioni a priori sulla proteina target,
le performance dei programmi sono in contrasto rispetto ai tipi di target
valutati.

18 CAPITOLO 1. BACKGROUND

Capitolo 2
Scopo della Tesi
Uno degli aspetti comuni a tutti i pacchetti di Docking esistenti è che un unico
algoritmo racchiude due aspetti completamente differenti: posizionamento del
ligando e calcolo dell’energia del sistema.
Una conseguenza che deriva dall’aspetto appena menzionato è che un
chimico-farmaceutico, in possesso di una propria funzione energetica F, nel
momento in cui decidesse di applicarla, non avrebbe a disposizione un set
di ligandi “neutrali”: la sua funzione infatti verrebbe applicata ad un set di
molecole già precomputate da un’altra funzione energetica F ′ . In particolare,
potrebbero mancare delle conformazioni che sarebbero state accettate da F
ma rifiutate da F ′ .
Un approccio completamente innovativo (e quindi sperimentale) potrebbe
essere quello di separare in due parti un algoritmo di docking. L’idea è quella
di distinguere in modo netto la generazione di tutte le possibili conformazioni
di un ligando all’interno del sito attivo della proteina target, ignorando
completamente l’energia del sistema, dalla valutazione energetica.
2.1 Ligand-rotation
A fronte di tutto quello che si è detto nel capitolo precedente, quel che vogliamo
è un pacchetto di Docking in grado di poter restituire delle conformazioni
valide, cioè che rispettino la geometria della chimica, senza doverci
preoccupare dello stato energetico del complesso.
Lo scopo primo di questa tesi è dunque quello di studiare, analizzare,
modellare e implementare un programma de novo di Docking, ligand-rotation,
scritto in C++, in grado di poter generare delle conformazioni valide dal
punto di vista geometrico.
19

20 CAPITOLO 2. SCOPO DELLA TESI
Le tecniche alla base del funzionamento di ligand-rotation sono proprie
della programmazione a vincoli. Nel capitolo 3 si andrà a definire formalmente
il problema CSP associato e quindi, l’insieme delle variabili e dei vincoli;
si mostrerà anche in che modo ligand-rotation assicura la consistenza dei
vincoli rispetto ai movimenti del ligando. Inoltre, l’esplorazione dello spazio
di ricerca viene eseguito efficacemente grazie ad algoritmi implementati adhoc
per ligand-rotation, come la visita dell’albero di ricerca e l’algoritmo di
backtracking. Abbiamo ricorso ad una progettazione e realizzazione a mano
del motore di ricerca, in quanto, gli oggetti del nostro algoritmo (i punti nelle
tre dimensioni) non sono trattati nativamente dai risolutori esistenti. Osserviamo
che, seppure il tutto si basi su tecniche di programmazione a vincoli,
ligand-rotation non implementa la propagazione dei vincoli. La causa di ciò
è da imputarsi al tempo: avendone a disposizione poco, si è optato per una
implementazione senza propagazione. Per ulteriori dettagli e approfondimenti
si veda il paragrafo 6.2.2 nella quale si descrive una futura espansione di
ligand-rotation.
Il funzionamento si basa su un modello che prevede la proteina rigida e il
ligando flessibile, come la maggior parte dei pacchetti di Docking presenti sul
mercato. Una motivazione valida di quanto appena detto è che la complessità
dell’algoritmo cresce esponenzialmente all’aumentare del numero dei gradi
di libertà (sezione 4.5): trattare anche i possibili movimenti della proteina,
renderebbe ligand-rotation più costoso.
L’algoritmo centrale di tutto ligand-rotation prevede di partire da un
potenziale candidato ligando e da una proteina con cui dovrà interagire; si
andrà, quindi, a simulare i possibili movimenti che il ligando può compiere
all’interno del sito attivo della proteina. L’output sarà composto da una serie
di molecole (in formato mol2); esse potranno essere studiate dal punto di
vista energetico, cioè valutate da una opportuna funzione di Scoring, la quale
andrà a selezionare i ligandi che, inseriti nel contesto proteico, risulteranno
energeticamente favorevoli.
Evidenziamo il fatto che ligand-rotation è molto flessibile: i suoi parametri
sono numerosi, molti dei quali definibili dall’utente. Attraverso un file di
configurazione, l’utente è in grado di modificare il comportamento di ligandrotation
in base alle sue esigenze e al tipo di risultato che vuole ottenere.
Ad esempio, si può specificare il grado di qualità e precisione attraverso vari
parametri che andranno a modificare il campionamento delle strutture dati
utilizzate o il numero dei gradi di libertà del sistema. A seconda delle scelte
effettuate, si andrà ad incidere notevolmente sulla complessità computazionale
e quindi sull’efficienza del software stesso, in termini di tempo impiegato
dal pacchetto nel restituire una serie di ligandi.
Nei prossimi capitoli si valuteranno le prestazioni ottenute da ligand-

2.1. LIGAND-ROTATION 21
rotation in fase di test. A partire dall’insieme dei ligandi ottenuti, la valutazione
verterà sui seguenti aspetti:
• complessità in tempo, in relazione al tipo di configurazione impostata
• qualità strutturale delle molecole ottenute
• generazione di un file di configurazione ottimale
Nel capitolo 5 descriveremo ampiamente i test effettuati su ligand-rotation.
2.1.1 Analisi dei requisiti
Il primo compito dell’analisi dei requisiti è identificare tutti i requisiti del
sistema software. Questi vengono documentati in più iterazioni con il committente,
in modo da chiarire eventuali dubbi e stendere gradualmente una
documentazione. In questa fase si analizzano i punti di vista dell’utente finale,
esterno, senza occuparsi dei dettagli implementativi informatici, i quali
rappresentato il punto di vista dell’utente interno. La difficoltà maggiore di
questa fase è costituita dai problemi di comunicazione: lo scambio di informazioni,
pur su argomentazioni semplici, tra analista e cliente finale, si può
rivelare complesso. Trovare un linguaggio comune tra i due e scambiare le
proprie idee in modo comprensibile ad entrambi è di primaria importanza.
Ligand-rotation è un progetto software sviluppato in collaborazione con
il Dipartimento di Chimica dell’Università di Parma. L’idea è quella di realizzare
un pacchetto di Docking in grado di lavorare in maniera indipendente
dall’energia del sistema ligando-proteina. In occasione di numerosi colloqui,
abbiamo stilato i requisiti funzionali che ligand-rotation avrebbe dovuto rispettare.
Innanzitutto, abbiamo definiti i gradi di libertà che il software deve
implementare. In primis, la molecola si muove grazie a degli step di rotazione
applicati ai legami di tipo semplice. In secondo luogo, ligand-rotation deve
essere in grado di esplorare il sito attivo della proteina.
Affinché il programma possa essere utilizzato da utenti non prettamente
informatici, questi comunicheranno con ligand-rotation attraverso un file di
configurazione. Si potranno specificare sia opzioni riguardati le funzionalità
di base, come input proteina, input ligando, etc.., sia parametri riguardanti
le prestazioni del software.

22 CAPITOLO 2. SCOPO DELLA TESI

Capitolo 3
Formalizzazione
In questo capitolo si esamineranno le tecniche e i principi utilizzati nell’implementazione
di ligand-rotation, con lo scopo di conseguire gli obiettivi prefissati
nei precedenti capitoli. Ligand-rotation inizierà la sua computazione
considerando il ligando base, ricevuto in input. La generazione delle conformazioni
avrà luogo effettuando sui legami tutte le rotazioni possibili, queste
ultime ottenute con una combinazione di rotazioni indipendenti individuate
da una visita opportuna della molecola. Si andrà, quindi, a testare ogni
possibilità di rotazione, verificando con i vincoli se queste realizzano un ligando
valido geometricamente. Infine, sapendo generare tutte le conformazioni,
queste saranno posizionate in uno spazio definito dall’utente in termini di
traslazioni e rotazioni. Questo affinché ligand-rotation possa analizzare la
cavità del sito attivo. L’insieme di tutti questi gradi di libertà andranno a
descrivere le diverse conformazioni ottenibili.
Innanzitutto, nella sezione 3.1 verrà formalizzato il problema P, esplicitando
l’insieme delle variabili e dei vincoli rappresentanti il modello del CSP
relativo al problema P di ligand-rotation. La nozione di vincolo è intrinsecamente
legata all’algoritmo che genera le conformazioni. Nella sezione 3.2
verrà presentato l’algoritmo di visita dello spazio di ricerca delle combinazioni
dove, per ogni atomo, si specificheranno l’insieme delle scelte possibili
rappresentate dal numero di rotazioni che il legame relativo a quell’atomo
può compiere; l’idea è quella di trovare tutte le possibili conformazioni di
un dato ligando. L’insieme delle sue soluzioni andrà a costruire, a sua volta,
l’insieme dei ligandi validi. Considerando le loro variabili, queste ultime dovranno
andare a verificare, per definizione di soluzione di CSP, ogni vincolo
definito per il problema P.
La sola generazione di queste ultime, nel sistema di riferimento del ligando,
è molto restrittivo nel senso che l’insieme delle soluzioni difficilmente
ne conterrà uno posizionato abbastanza correttamente rispetto a quello
23

24 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
minimizzato, scaricato dalla banca dati PDB 1 .
Una possibile soluzione presentata nella 3.5, implementata in ligandrotation,
consiste nel posizionamento in sequenza dei ligandi ottenuti precedentemente
in tanti sistemi di riferimento specifici della proteina, andando
a costruire ligandi con orientamento spaziale differente in modo tale da
esplorare il sito attivo della proteina.
3.1 Modello del problema a vincoli
L’aspetto chiave di questo progetto è proprio quello di CSP, Constraint Satisfaction
Problem. Definiamo quindi formalmente il modello utilizzato per la
rappresentazione del problema P riguardante ligand-rotation.
3.1.1 Variabili
Si possono individuare due tipi di variabili che compongono il problema P:
• variabili di tipo legame, ovvero le k rotazioni che caratterizzano uno
specifico legame
• variabili di tipo punto, ovvero le coordinate corrispondenti agli atomi
del ligando e della proteina
Le variabili di tipo legame sono associate ad ogni legame da ruotare nel
ligando di partenza. Si procede all’identificazione delle suddette variabili per
poi effettuare delle rotazioni successive che modificano la struttura della molecola.
Intuitivamente, la rotazione di un legame influenza le due sottomolecole
separate dal legame ruotato. Da ciò, si deduce che non tutti i legami potranno
effettuare delle rotazioni, in quanto, se il legame in questione appartiene
ad un anello, si va incontro alla rottura di quest’ultimo. Le variabili punto,
invece, identificano tutti i possibili piazzamenti di un particolare atomo a
seguito di rotazioni della sottomolecola a cui appartiene.
3.1.2 Dominio delle variabili
Il dominio di una variabile di tipo legame è un insieme di interi che identifica
il numero di rotazioni che un legame può effettuare. Questo valore può
variare a seconda della natura del legame chimico o delle impostazioni dettate
dall’utente. In generale, si possono riassumere i seguenti casi: sia l un
generico legame,
1 Il Protein Data Bank, o PDB, è un archivio per dati di struttura in 3D di proteine e
acidi nucleici.

3.2. VISITA DELLO SPAZIO DI RICERCA 25
• se l compare all’interno di un ciclo aromatico, collega un atomo di
idrogeno o è stato bloccato dall’utente, si definisce un’unica rotazione,
ovvero l’identità
• in tutti gli altri casi, l effettua un numero di rotazioni pari a k, definito
dall’utente; formalmente, l’insieme R degli angoli di rotazione è:
{ }
2π
R =
k i : i ∈ {0, . . . , k − 1}
3.1.3 Vincoli implementati
Per meglio comprendere la natura chimica del vincolo che si vuole implementare,
consideriamo il legame più debole esistente, legame di Van der Waals
e immaginiamo una sfera di raggio pari alla lunghezza del legame con centro
sull’atomo che stiamo esaminando. Affinché due atomi non entrino in collisione
è necessario che ci sia una certa distanza tra i due, ovvero che le sfere
identificate dai due atomi non si intersechino mai o a meno di una certa soglia
o tolleranza.
A partire da questa considerazione, nasce il vincolo di non sovrapposizione,
il quale verificherà la consistenza di un movimento del ligando. Siano N,
N P rispettivamente gli insiemi degli atomi del ligando e della proteina. Sia
a ∈ N e sia r a il suo raggio atomico, allora ∀n ∈ (N {a}) ∪ N P
‖a − n‖ ≥ r a + r nj ∀j = 1, . . . , |(N {a}) ∪ N P |
dove r nj è il raggio atomico di n j .
L’esecuzione del test di sovrapposizione richiede un tempo quadratico sul
numero dei nodi. Osserviamo che, per motivi di efficienza, il controllo non
verterà su tutti gli atomi appartenenti all’insieme (N{a})∪N P ; nella sezione
4.4 descriveremo l’implementazione lineare utilizzata da ligand-rotation per
la verifica dell’unico vincolo esistente e si descriveranno le strutture dati
utilizzate per poter ridurre l’insieme degli atomi da verificare.
3.2 Visita dello spazio di ricerca
Il ligando si presta bene ad essere rappresentato da una struttura dati di
tipo grafo non orientato. Sia L = (N, A) il grafo in questione (illustrato
in figura 3.4) dove N rappresenta l’insieme degli atomi e A l’insieme dei
legami chimici esistenti tra atomi; e sia P = (N P , A P ) il grafo associato alla
proteina target. Le informazioni relative ai nodi e agli archi possono essere

26 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
ricavate facilmente dai file di estensione mol2, formato standard utilizzato
per la rappresentazione di molecole (si faccia riferimento alla sezione 4.1.2
per ulteriori approfondimenti).
Grazie ad una visita sul grafo L, è possibile costruire un albero Z (figura
3.5) definito spanning tree (albero di copertura) per L, dove l’insieme dei
suoi nodi coincide con N mentre l’insieme degli archi R dell’albero è un
sottoinsieme di A. L’albero Z ha lo scopo di dettare un ordine di visita degli
atomi della molecola al generatore di conformazioni. Ciò dà la possibilità di
effettuare il controllo di consistenza subito dopo la visita di un nodo, dato che
i successivi non andranno a influire quello appena visitato (ciò sta a significare
che esso sicuramente non subirà ulteriori rotazioni). Questa tecnica si traduce
quindi, in un risparmio in termini temporali: una visita topologica permette,
infatti, di minimizzare il numero di volte che un atomo viene ruotato. Senza
l’ausilio dell’albero, o di una opportuna visita della molecola, e visitando i
nodi in ordine casuale, gli atomi si stabilizzano più tardi, dopo aver fatto
molte più rotazioni del necessario: ciò a causa della dipendenza esistente tra
gli atomi. La verifica di consistenza si sarebbe dovuta applicare dopo aver
piazzato tutti i nodi con un conseguente aumento dei tempi di esecuzione
e rendendo ligand-rotation un programma inefficiente; inoltre, avrebbe reso
vano l’utilizzo di tecniche di programmazione a vincoli.
Grazie all’ordine stabilito dalla visita, è possibile costruire una lista D di
atomi, la quale verrà iterata dal generatore durante la costruzione delle molecole.
Ogni elemento della lista avrà associato il suo sottoalbero, dipendente
dallo spanning-tree effettuato su L. Da una rotazione dell’elemento D k ne
conseguirà una di tutto il suo sottoalbero.
3.2.1 Albero di ricerca
Per meglio comprendere in che modo vengono generate tutte le possibili
conformazioni, introduciamo il concetto di albero di ricerca. Daremo una
definizione costruttiva a livelli dell’albero di ricerca T di ligand-rotation. A
livello 0 compare l’elemento D 0 . Al livello 1 compare D 1 in tutte le possibili
scelte dettate dalla sua variabile di tipo legame, cioè in tutte le possibili
rotazioni che, il legame caratterizzato dal nodo x ∈ Z corrispondente a D 1 e
il padre y ∈ Z di x, può effettuare.
Il numero dei nodi che compaiono a livello k è uguale alle possibili scelte
della variabile legame dell’elemento D k moltiplicata al numero di nodi presenti
a livello k − 1 di T . Ne segue che ogni nodo del livello k − 1 ha un
numero di figli pari al numero di possibili scelte di D k .

3.3. GENERAZIONE DELLE CONFORMAZIONI 27
Avremo, dunque, una corrispondenza tra gli alberi Z e T . Un nodo n ∈ T
corrisponde ad una scelta di rotazione dell’arco di a ∈ Z, o legame chimico,
che collega il nodo di Z corrispondente a n e suo padre.
Nelle figure 3.1 e 3.2 sono raffigurati due esempi di albero Z e T .
Figura 3.1: Albero Z
Conseguentemente, un cammino radice-foglia dell’albero T corrisponde
ad una possibile soluzione e gli atomi compaiono nello stesso ordine della
lista D.
3.3 Generazione delle conformazioni
L’idea alla base della generazione delle conformazioni è quella di visitare l’albero
di ricerca T andando ad esplorare tutti i suoi cammini, ovvero esaminare
tutte le possibili scelte delle variabili di tipo legame di tutti gli elementi di
D.
Il caso base è dato dall’esplorazione del nodo D 0 ; sappiamo che, i nodi
successivi non andranno a modificare la sua posizione in quanto radice
dell’albero Z. Verifichiamo dunque la consistenza del vincolo su di esso: se
non avviene violazione, si prosegue con il nodo successivo D 1 , altrimenti la
computazione termina.
Il passo induttivo è caratterizzato dall’esplorazione del k-esimo elemento
della lista, D k , il quale si trova al livello k di un generico cammino dell’albero
T . Dalle considerazioni fatte precedentemente, sappiamo che gli elementi
dell’insieme I k = {D 1 , . . . , D k }, ruotati con un opportuno angolo delle rispettive
variabili di tipo legame, sono stati validati e quindi, non subiranno
modifiche; ne segue che D k , essendo il figlio di un elemento di I k già piazzato,
non subirà ulteriori violazioni. Verifichiamo, dunque, la consistenza del

28 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
Figura 3.2: Albero T

3.3. GENERAZIONE DELLE CONFORMAZIONI 29
Figura 3.3: Struttura molecolare del tamoxifene renderizzata con Molegro
Molecular Viewer.

30 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
Figura 3.4: Grafo rappresentante la molecola in figura 3.3. I numeri all’interno
dei nodi rappresentano l’id degli atomi mentre quelli negli archi
rappresentano l’id dei legami chimici. Grafo costruito con Graphviz.

3.3. GENERAZIONE DELLE CONFORMAZIONI 31
28
1
26
1
5
27
25
5
24
5
23
5
22
1
21
1
20
1
2
5
1
3
1
5
1
1
13
4
29
1
5
5
14
5
7
1
1
1
15
6
8
1
1
16
9
1
1
1
18
17
10
1
1
19
11
1
12
Figura 3.5: Albero ottenuto da una visita sul grafo in figura 3.4. Sui nodi
sono visibili gli id degli atomi mentre agli archi sono associati il numero delle
rotazioni che ogni legame può compiere. Gli archi tratteggiati rappresentano
quelli effettivamente presenti sul grafo, ma eliminati per evitare cicli. Albero
costruito con Graphviz.

32 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
vincolo su D k . Proseguendo con l’elemento D k+1 , del livello k + 1 di T , si
aprono un numero di scelte pari al numero di rotazioni assegnate alla sua
variabile legame, la quale corrisponde all’arco dell’albero Z che collega il
vertice x ∈ Z (identificato da D k+1 ) e suo padre y ∈ Z. In questo punto
dell’operazione, non è necessario conoscere la scelta esplorata sul nodo D k ,
ovvero non è importante sapere quale particolare cammino stiamo seguendo;
esploriamo, dunque, la prima scelta con conseguente verifica del vincolo.
Se ha esito positivo, si piazza l’atomo D k+1 , aggiornando l’insieme I k , che
diventa I k+1 = I k ∪{D k+1 } e proseguendo con D k+2 . In caso contrario, grazie
alla procedura di backtracking, si seleziona una scelta non ancora esplorata
per D k+1 .
Giunti ad una foglia di T , ovvero all’elemento D n , la quale si rivela consistente
rispetto al vincolo implementato, il nuovo insieme I n = I n−1 ∪ {D n }
contiene tutti gli atomi consistenti, posizionati rispetto alla particolare variabile
di legame a loro corrispondente. Le loro coordinate attuali rappresentano
una soluzione del problema P. A questo punto, si genera un file mol2,
rappresentante una conformazione valida della molecola.
Si prosegue ricercando le altre soluzioni, attivando il backtracking che
risale lungo la lista e quindi lungo l’albero di ricerca T , per analizzare le
scelte non ancora intraprese.
La procedura globale termina quando il backtracking arriva alla radice.
3.4 Rotazione di un legame
Le rotazioni dei legami rappresentano uno dei gradi di libertà di liganrotation.
Attraverso di esse è possibile muovere strutturalmente il ligando
e, con l’intervento della consistenza dei vincoli, si andrà a valutare geometricamente
se il movimento è accettabile o meno.
È doveroso precisare alcuni dettagli qui di seguito. Solitamente un ligando
ha un numero elevato di legami; ne segue che non tutti ruoteranno. Ciò è
dovuto al fatto che alcuni di essi vanno a formare particolari composti. Un
esempio sono gli anelli aromatici, composti organici a struttura planare i cui
legami non sono singoli; ciò implica che il composto è molto stabile e una
rotazione dei suoi legami sarebbe molto improbabile.
Inoltre, eviteremo di far ruotare i legami nei quali in una delle due estremità
compare un idrogeno. Si tratta di una scelta implementativa fatta sostanzialmente
per due motivi: in primis, la rotazione di un idrogeno non
è necessaria perché questa non apporta benefici all’energia del complesso
proteina-ligando e, in secondo luogo, la rotazione di molti legami aumenta la
complessità in tempo di ligand-rotation (si veda la sezione 4.5).

3.4. ROTAZIONE DI UN LEGAME 33
a
b
d
c
y
l
e
x
f
g
h
Figura 3.6: Esempio di albero Z. In rosso sono evidenziati i nodi che caratterizzano
il legame ruotante l e in blu gli elementi di B che subiranno la
rotazione.
Detto ciò, possiamo ora dare la definizione formale di rotazione.
Sia L l’insieme dei legami ruotabili, ovvero l’insieme dei legami tali che:
• non compaiano in composti aromatici;
• gli atomi caratterizzanti il legame non sono degli idrogeni
Poiché un legame identifica un particolare arco dell’albero Z, la sua rotazione
andrà a modificare tutto il sottoalbero con radice proprio il figlio
dell’arco. Sia l ∈ L un legame che ammette rotazione, x, y rispettivamente
il padre e il figlio del corrispondente arco di A e sia B l’insieme dei nodi
del sottoalbero radicato in y (figura 3.6). L’obiettivo è quello di ruotare ogni
nodo di B. Ad esempio, data la rotazione del legame l di figura 3.6, l’insieme
B è composto dagli elementi {f, g, h}.
Siano X, Y i punti dello spazio associati ai nodi x, y. Sia inoltre S Y
l’insieme dei punti dello spazio associati all’insieme dei nodi B. Sia P ∈ S Y
generico e sia t la retta passante per i punti X e Y che identifica l’asse di
rotazione.
Si definisce rotazione di Φ gradi su t la rotazione effettuata su tutti gli
atomi appartenenti a S Y .

34 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
Figura 3.7: Formula della Rotazione descritta in [8]
Operativamente, la rotazione viene effettuata nel seguente modo: sia P ∈
S Y come mostrato in figura 3.7 e sia s la retta passante per N ed O. Calcolo
il versore ˆn attraverso la formula:
ˆn =
N − O
‖N − O‖
Applicando ora la formula 3.2 al punto P , otterremo la retta r ′ e quindi il
punto Q. Procedendo con questo algoritmo per tutti i punti di S Y otterremo
la rotazione lungo s di angolo Φ di tutto il sottoalbero.
r ′ = −−→ ON + −−→ NV + −→ V Q (3.1)
= r cos Φ + ˆn(ˆn · r)(1 − cos Φ) + (r × ˆn) sin Φ (3.2)
3.5 Esplorazione del sito attivo della proteina
La generazione delle combinazioni del ligando (presentata nella sezione 3.3)
non è sufficiente per i nostri scopi. Essa ha luogo sul sistema di riferimento del
ligando, ignorando completamente la struttura della proteina. In altre parole,
le semplici rotazioni lungo i legami del ligando non bastano, ma sono necessari
altri gradi di libertà che permettano a ligand-rotation di poter esplorare la
cavità della proteina.
L’idea implementata in ligand-rotation consiste nella generazione di una
serie di basi ortonormali che andranno a campionare i tre gradi di libertà e,
per ognuno di essi, si andrà a testare diverse origini sul quale posizionare l’atomo
D 0 . L’applicazione di queste basi al nostro ligando di partenza su tutte

3.5. ESPLORAZIONE DEL SITO ATTIVO DELLA PROTEINA 35
le origini definite dall’utente daranno luogo a una serie di ligandi, chiamati
ligandi base, dall’orientamento spaziale molto vario. Avviando la ricerca delle
conformazioni su ognuno di questi ligandi, ligand-rotation sarà in grado di
ottenere risultati molto soddisfacenti.
Definiamo ora formalmente questi concetti.
3.5.1 Construzione delle basi ortonormali
Consideriamo l’insieme H ⊂ R 3 che identifica n punti su una sfera di raggio
unitario e su ognuno di essi costruiamo un sistema di riferimento. Effettuando
k rotazioni di 2π/k lungo l’asse individuato dal versore uscente da ogni punto
di H si andranno a generare k sistemi di riferimento su ogni punto, con un
totale di n · k.
Sia c il versore uscente da un generico punto h ∈ H e sia B = (0, 0, 1) un
versore della base canonica di R 3 . Chiamiamo a e b rispettivamente i versori
ottenuti dal prodotto vettoriale tra c e B e tra c e a, ovvero:
a = c × B
b = c × a
(3.3)
Nel caso in cui c sia proprio il versore B, i versori a e b avranno componenti
rispettivamente (1, 0, 0) e (0, 1, 0).
I versori a, b e c identificano il sistema di riferimento ortogonale R con
origine nel punto h. Eseguendo k step di rotazioni lungo l’asse c, ognuna di
2π/k, otteniamo i k sistemi di riferimento.
Eseguendo questo procedimento per ogni punto della sfera otteniamo m =
n · k sistemi di riferimento R 1 , . . . , R m .
3.5.2 Generazione ligandi base
Avendo ora a disposizione m sistemi di riferimento, andiamo ad applicare
questi ultimi al ligando iniziale, ottenendo appunto m ligandi base.
Per ogni sistema di riferimento R i con i = 1, . . . , m, definiamo le matrici
M i ∈ R 3 in modo tale che la prima riga corrisponda al versore a di R i , la
seconda e la terza riga rispettivamente b e c di R i .
⎡ ⎤ ⎡
⎤
a i a x i a y i a z i
M i = ⎣b i
⎦ = ⎣b x i b y i b z i ⎦ (3.4)
c i c x i c y i c z i
Chiamiamo queste matrici M i , al variare di i tra 1 e m, matrice associata
alla base ortonormale per R i .

36 CAPITOLO 3. FORMALIZZAZIONE
Il passo successivo consiste nell’applicazione del ligando su ogni sistema
di riferimento, con lo scopo di ottenerne un insieme da usare come input per
ligand-rotation. Questo processo può essere descritto grazie alle matrici delle
basi ortonormali definite poco sopra dalla formula 3.4.
Sia L così definito
L = {q j : j = 1, . . . t}
l’insieme dei punti di R 3 , con |L| = t, tale che q j rappresenta la posizione
nello spazio del j-esimo atomo del ligando di partenza. Quel che vogliamo
ottenere è un insieme di ligandi L R 1
, . . . , L Rm tali che:
{
}
L R i
= p (i)
j : j = 1, . . . , t i = 0, . . . , m
con
⎡
⎢
⎣
p (i)
x (i) p j
y (i) p j
z (i) p j
j = M i · q j j = 1, . . . , t
⎤
⎡
⎤ ⎡ ⎤
a x i b x i c x i x qj
⎥
⎦ = ⎣a y i b y i c y i⎦
⎣y qj
⎦
a z i b z i c z i z qj
j = 1, . . . , t
i = 1, . . . , m
dove le M i rappresentano le matrici definite nella formula 3.4.
(3.5)
3.5.3 Campionamento di S
L’ultimo passo che resta da fare prima di far parire l’algoritmo vero e proprio
è quello di traslare ogni ligando L R i
su ogni punto di S in modo che D 0
2
coincida con l’origine dei sistemi di riferimento; in questo modo partiranno
|S| · m istanze dell’algoritmo generatore di tutte le combinazioni valide.
L’insieme S è costruito dai dati forniti dall’utente: due punti e un passo
l. Si costruisce un cubo a partire dalle 2 coordinate e lo si partiziona in tanti
cubetti tali che il loro lato sia uguale a l e che il lato del cubo sia divisibile
per l. L’insieme di tutti gli spigoli dei cubetti è proprio S.
Ligand-rotation non è un software statico, bensì dinamico e completamente
configurabile dall’utente. Per quanto riguarda la costruzione dell’insieme
S, si dovranno specificare gli estremi dello spazio in cui si vuole che abbia
inizio la costruzione del ligando e il passo di campionamento di questi punti;
mentre, per quel che riguarda i sistemi di riferimento, le costanti k e n sono
personalizzabili.
2 D è l’elenco degli atomi del ligando; sono in ordine secondo la visita effettuata su G.
Si faccia riferimento alla sezione 3.2

Capitolo 4
Dettagli implementativi
In questo capitolo verranno descritti gli algoritmi implementati e le strutture
dati utilizzate in ligand-rotation. In particolare si mostrerà (nella sezione
4.1) come, a partire da un file di configurazione, si caricheranno tutte
le informazioni relative al ligando ed alla proteina. Non soltanto, andremo
anche a specificare tutte le opzioni disponibili per permettere una buona
personalizzazione.
In aggiunta, andremo a definire (nella sezione 4.2) delle strutture dati che
permetteranno a ligand-rotation un incremento delle prestazioni, per quanto
riguarda la verifica della consistenza del vincolo (sezione 4.4). Questo è
un aspetto molto importante, che ci permette di notare che la procedura
che verifica i vincoli viene chiamata dopo ogni movimento del ligando (ossia
parecchie volte) e non è accettabile una inefficienza a questo riguardo.
Andremo ad esaminare nei dettagli (nella sezione 4.3) l’algoritmo principale
del pacchetto. Descriveremo come le varie tecniche presentate fino ad
ora interagiscono tra loro a partire dall’esplorazione del sito attivo fino alla
generazione di una conformazione consistente.
Come ultimo argomento (nella sezione 4.5) daremo alcuni accenni circa
la complessità di ligand-rotation, in termini di tempo e di spazio occupato.
4.1 Inizializzazione di ligand-rotation
In questa sezione verranno descritte le fasi iniziali in cui ligand-rotation viene
configurato, a partire dal file di input di configurazione, e inizializzate le sue
strutture dati.
37

38 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
4.1.1 Acquisizione informazioni di configurazione
L’unico modo che ha un utente di comunicare con ligand-rotation è attraverso
il file di configurazione; configurazione, in cui è possibile specificare tutti i
parametri, sia funzionali che qualitativi, utilizzati dall’algoritmo di docking:
• ligando: specificare file mol2 1 contenente le coordinate del candidato
ligando
• proteina: file mol2 contenente le posizioni degli atomi della proteina
target
• step rotazioni: specifica il numero di rotazioni che un legame ruotante
compie
• legami bloccati: specifica, in sequenza, l’id 2 dei legami che non devono
ruotare
• coordinate sito attivo: specifica gli estremi dell’area in cui si trova il
sito attivo della proteina
• passo area di lavoro: indica il passo con cui l’area del sito attivo verrà
partizionata
• set punti iniziali: specifica gli estremi dell’area in cui si piazzerà il primo
atomo del ligando
• passo punti iniziali: passo di partizionamento dell’area contenente i
punti iniziali
• punti sfera: numero dei punti sulla sfera di raggio unitario nei quali si
genereranno le basi ortonormali
• rotazioni su Z: step di rotazioni delle basi ortonormali sull’asse Z
Una volta in possesso di questi parametri, si andrà a generare prima di
tutto il grafo rappresentante il ligando, L = (N, A) e, in un secondo momento,
l’albero T , grazie ad una visita V su L.
1 mol2 rappresenta un formato standard di rappresentazione delle molecole.
Approfondiremo l’argomento nella sezione 4.1.2
2 L’Id corrisponde a quello specificato nel file mol2

4.1. INIZIALIZZAZIONE DI LIGAND-ROTATION 39
Implementazione
La realizzazione dei nodi e degli archi è stata resa possibile grazie all’ausilio
delle classi Nodo e Arco (nelle figure 4.1 e 4.2 viene presentata una possibile
implementazione delle due strutture). Il grafo che rappresenta la molecola è
stato implementato con delle liste di adiacenza (codice 4.3), con particolare
riguardo all’efficienza, visti i numerosi accessi in lettura.
✞
✡✝
Codice 4.1: Struttura della classe Nodo
class Nodo {
public :
// . . .
private :
int id atomo ;
s t r i n g nome atomo ;
MyReal x ;
MyReal y ;
MyReal z ;
s t r i n g tipo atomo ;
MyReal r a g g i o a t o m ico ;
} ;
✆
✞
✡✝
Codice 4.2: Struttura della classe Arco
class Arco {
public :
// . . .
private :
int id legame ;
int atomo1 ;
int atomo2 ;
s t r i n g tipo legame ;
int r o t a z i o n i l e g a m e ;
} ;
✆
Per motivi di efficienza, l’implementazione del grafo è stata realizzata per
mezzo di una matrice di vettori della libreria standard del C++. Nella prima
colonna sono stati disposti tutti gli id dei nodi, mentre, su ogni riga, una
lista degli id corrispondenti agli archi caratterizzanti il nodo stesso.

40 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
✞
Codice 4.3: Struttura della classe Grafo
class Grafo {
public :
// . . .
private :
std : : vector legami ;
std : : vector atomi ;
std : : vector < std : : vector > molecola ;
✡✝
} ;
// . . .
✆
Il passo successivo consiste nell’impostare, negli oggetti di tipo Arco, le
rotazioni possibili per ogni legame attraverso il metodo imposta legami(),
specificate nel file mol2 con la seguente sintassi:
• ar: legame facente parte di un composto aromatico
• 1: legame singolo o semplice
• 2: legame doppio
Qui di seguito lo pseudocodice della procedura:
✞ Codice 4.4: Pseudocodice del metodo imposta rotazioni()
for arco in a r c h i m o l e c o l a ( )
i f arco . tipo legame i s ‘ ‘ ar ’ ’
arco . r o t a z i o n i l e g a m e = 1
else i f arco . tipo legame i s not ‘ ‘1 ’ ’
arco . r o t a z i o n i l e g a m e = 1
else i f arco . c o n t a i n s (H)
arco . r o t a z i o n i l e g a m e = 1
else
arco . r o t a z i o n i l e g a m e = k
✡✝
✆
4.1.2 Struttura file mol2
Il file mol2 è uno dei sistemi per poter rappresentare la struttura di una
molecola attraverso file. Qui di seguito un esempio di file mol2:

4.2. STRUTTURE DATI DEL RISOLUTORE 41
@MOLECULE
4OHT
29 31 1 0 0
SMALL
USER_CHARGES
@ATOM
1 C1 31.1300 -1.5780 24.9020 C.ar 1 LIG600 0.00
2 O1 25.1930 -1.6480 26.9150 O.3 1 LIG600 0.00
3 C2 31.5550 -1.7460 26.2270 C.ar 1 LIG600 0.00
4 O2 33.4760 -3.6110 23.0430 O.3 1 LIG600 0.00
5 N1 34.3180 -4.9410 20.4290 N.3 1 LIG600 1.00
@BOND
1 1 2 ar
2 2 3 1
3 3 4 1
4 4 5 2
@SUBSTRUCTURE
1 LIG600 1 GROUP 1 LIG 1
Nella sezione MOLECULE vengono riassunte le informazioni principali
della molecola, come il suo nome, il numero degli atomi e dei legami chimici.
Le sessioni ATOM e BOND sono le più importanti per i nostri scopi. Nella
prima, infatti, vengono elencati tutti gli atomi della molecola, identificati da
un Id, con le loro posizioni nello spazio e il tipo di ibridizzazione assunta. Per
esempio, l’atomo indentificato dall’Id 2 è un ossigeno con coordinate x, y, z
rispettivamente (25.1930, −1.6480, 26.9150), caratterizzato da una ibridizzazione
sp 3 . Nella seconda, si elencano i legami chimici esistenti tra atomi, in
cui la prima colonna contiene l’id del legame, la seconda e la terza, rispettivamente
gli Id degli atomi coinvolti e la quarta il tipo di legame (ar per
legame facente parte di un composto aromatico, 1 legame singolo, etc..).
Per ulteriori approfondimenti si rimanda al sito web
http://tripos.com/data/support/mol2.pdf
4.2 Strutture dati del risolutore
Qui di seguito verranno illustrate alcune strutture dati utilizzate dal risolutore
dei vincoli di ligand-rotation.

42 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
4.2.1 Matrice di Vicinanza
La matrice di vicinanza, indicata con M ∈ {0, 1} n×n , n = |N| con N l’insieme
degli atomi del ligando, è una matrice quadrata di ordine n, booleana, dove
gli indici di riga e di colonna corrispondono agli id degli atomi. Lo scopo
di M è quello di specificare gli atomi adiacenti per ogni atomo del ligando.
Nel momento in cui si posizionerà un atomo a ∈ V e si andrà a verificare la
consistenza del vincolo di distanza su di esso, si eviterà di calcolare la distanza
euclidea tra a e i suoi adiacenti. Questo perché, essendo i vicini una catena
di atomi legati tra loro covalentemente, non vale più il concetto di sfera di
Van der Waals. La lunghezza del legame covalente è inferiore rispetto alla
lunghezza di un legame di Van der Waals e, evitando questo controllo, si
otterrebbero dei ‘falsi positivi’.
Formalizziamo il concetto di adiacenza:
Definizione 4.1. Un atomo x ∈ N è adiacente ad un altro atomo y ∈ N se
e solo se il cammino tra x e y ha lunghezza massima 3, ovvero il cammino
non deve essere composto da più di tre legami.
Avremo quindi, per ogni atomo del ligando una serie di atomi adicenti.
Indichiamo questo fatto con la seguente notazione: per ogni atomo a ∈ N
adj(a) = {v ∈ N : M(a, v) = M(v, a) = M(a, a) = true}
La costruzione di M viene effettuata grazie a n visite in ampiezza sul
grafo L del ligando, dove |N| = |n|, specificando su ogni computazione il
livello di profondità, cioè 3.
4.2.2 Discretizzazione di un sottoinsieme limitato di
R 3
Consideriamo una porzione cubica di spazio, V, identificato da due punti
(due vertici del cubo) corrispondenti rispettivamente alle coordinate minime
e massime delle tre dimensioni: lunghezza, larghezza e profondità. Siano Min
e Max tali punti e sia p il lato del cubo.
Consideriamo una sua discretizzazione: dividiamo V in tante celle cubiche
C di uguale dimensione, caratterizzate anch’esse da un minimo, Min C , un
massimo, Max C , e un passo l ≤ p tale che p sia divisibile per l. Sia C l’insieme
di tutte le celle di V; ogni cella rappresenta anch’essa un sottoinsieme limitato
di R 3 .
Ogni cella potrà memorizzare al suo interno un insieme di atomi. Dato un
atomo a, esso stazionerà all’interno di una particolare cella C a se le coordinate
di a appartengono all’insieme dei punti di R 3 , individuati da C a .

4.2. STRUTTURE DATI DEL RISOLUTORE 43
Definizione 4.2. [Appartenenza]
Siano (x a , y a , z a ) le coordinate di a e sia P Ca l’insieme dei punti di R 3 appartenenti
alla cella C a :
P Ca = { }
(x, y, z) ∈ R 3 : Min x ≤ x < Max x ∧ Min y ≤ y < Max y ∧ Min z ≤ z < Min z
dove (Min x , Min y , Min z ) = Min C e (Max x , Max y , Max z ) = Max C . Allora:
a ∈ C a
⇐⇒ (x a , y a , z a ) ∈ P Ca
Figura 4.1: Quattro celle cubiche con all’interno alcuni atomi.
L’insieme V appena introdotto avrà un ruolo fondamentale nel risolutore
di vincoli da noi implementato. Le celle rappresentano la struttura base a
cui si accederà per la verifica della consistenza del vincolo di non sovrapposizione.
Durante l’esecuzione dell’algoritmo di ligand-rotation, quando siamo
sicuri che un atomo, supponiamo D k , non verrà può ruotato 3 , è necessario
verificare la consistenza su di esso. Per far ciò, ci cerca di inserirlo all’interno
di una cella; se nelle sue vicinanze ci sono altri atomi, l’inserimento fallisce,
altrimenti ha successo. Viceversa, nel momento in cui si fa backtracking su
D k , l’operazione da eseguire è quella inversa: eliminare l’atomo D k dalla cella
in cui si trova, in quanto si sta cercando una nuova configurazione e quindi subirà
una potenziale rotazione. In questo modo, la struttura dati conterrà solo
atomi consistenti e la verifica dei vicini sarà effettuata molto efficientemente
grazie ai metodi implementati su di essa.
3 Nella sezione 4.3.2 descriveremo nei dettagli il momento esatto in cui si verifica la
consistenza.

44 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
Identificazione delle celle
Supponendo di dover inserire un atomo a all’interno di una cella, la sua
identificazione si ottiene ricavando tre indici, univoci per ogni cella, (X, Y, Z),
a partire dalle coordinate (x, y, z) di a:
X = ⌊ x − Min x
⌋
l
Implementazione
Y = ⌊ y − Min y
⌋
l
Z = ⌊ z − Min z
⌋
l
Una simile struttura dati può essere facilmente implementata con dei vector
della libreria standard del C++.
✞
Codice 4.5: Implementazione di V
std : : vector < std : : vector < std : : vector > >
✡✝
✆
Al contrario, una cella è stata implementata per mezzo di una classe,
affinché possa memorizzare al suo interno l’insieme degli atomi.
✞
✡✝
Codice 4.6: Implementazione di una cella
class C e l l a {
private :
std : : vector atomi ;
public :
. . .
} ;
✆
Insieme delle operazioni
L’insieme delle operazioni ammesse per la struttura V e per la Cella sono
elencate qui di seguito con il relativo pseudocodice.
• dato un atomo, identificazione della sua cella (codice 4.7)
• inserimento di un atomo in una cella (codice 4.8)
• eliminazione di un atomo da una cella (codice 4.9)

4.2. STRUTTURE DATI DEL RISOLUTORE 45
✞
✡✝
Codice 4.7: Pseudocodice per l’identificazione di una cella
V : : i d e n t i f i c a c e l l a ( atomo ) {
// . . .
i d c e l l a [ 0 ] = ( atomo . x − Min . x )/p ;
i d c e l l a [ 1 ] = ( atomo . y − Min . y )/p ;
i d c e l l a [ 2 ] = ( atomo . z − Min . z )/p ;
return i d c e l l a ;
}
✆
✞
✡✝
Codice 4.8: Pseudocodice per l’inserimento di un atomo in una cella
V : : i n s e r i s c i ( atomo ) {
// . . .
i d c e l l a = V : : i d e n t i f i c a c e l l a ( atomo ) ;
i f ( i d c e l l a != NULL)
C e l l a : : i n s e r i s c i ( i d c e l l a , atomo ) ;
}
C e l l a : : i n s e r i s c i ( i d c e l l a , atomo ) {
// . . .
cubo . at ( i d c e l l a ) . push back ( atomo ) ;
}
✆
Osserviamo che, durante l’identificazione della cella, nel caso in cui le
coordinate dell’atomo non appartengano alla porzione di spazio V riene restituito
il valore NULL.
4.2.3 Celle contenenti atomi ‘vicini’
Lo scopo di questo paragrafo è illustrare in che modo vengono recuperate
le celle contenenti gli atomi definiti ‘vicini’, ovvero quelli che subiranno il
controllo della distanza euclidea con l’atomo da inserire da parte del risolutore
di vincoli. Definiamo prima di tutto il concetto di atomo vicino e l’insieme
formato da questi ultimi.
Definizione 4.3. Sia a ∈ C un generico atomo appartente ad una cella,
anch’essa generica. L’insieme G è composto dall’insieme degli atomi appartenenti
ad una qualche cella di V tali che la loro distanza euclidea da a sia
inferiore o uguale alla somma del raggio atomico di a e del raggio atomico
massimale degli atomi del ligando.

46 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
✞
✡✝
Codice 4.9: Pseudocodice per l’eliminazione di un atomo da una cella
V : : e l i m i n a ( atomo ) {
// . . .
i d c e l l a = V : : i d e n t i f i c a c e l l a ( atomo ) ;
C e l l a : : e l i m i n a ( i d c e l l a , atomo ) ;
}
C e l l a : : i n s e r i s c i ( i d c e l l a , atomo ) {
// . . .
cubo . at ( i d c e l l a ) . pop back ( atomo ) ;
}
✆
Costruire l’insieme G non è affatto semplice, in quanto occorre esplorare
tutta la porzione di spazio che comprende l’atomo da inserire. L’approccio
utilizzato da ligand-rotation consiste nell’individuazione di tutte le celle che
potenzialmente potrebbero contenere atomi vicini. Sia R il raggio massimo
degli atomi componenti il complesso ligando-proteina, sia r il raggio dell’atomo
da inserire e c la cella in cui inserirlo. Da queste due informazioni ci
costruiamo il range delle celle da controllare, dato da:
range = ⌊ R + r ⌋ + 1
l
L’insieme delle celle K i cui indici rispetto c spaziano della quantità range
sono proprio quelle che il risolutore andrà ad esaminare per la verifica del
vincolo di vicinanza.
4.3 Algoritmo di ligand-rotation
In questa sezione verrà presentato nei dettagli il cuore dell’algoritmo di docking.
Si parlerà di consistenza in riferimento all’unico vincolo implementato
su ligand-rotation, ovvero quello di non sovrapposizione. La prima operazione
effettuata su V è quella relativa al piazzamento degli atomi della proteina.
Questi, infatti, vengono inseriti immediatamente per il semplice motivo che
la proteina è un corpo statico e quindi gli atomi non verranno mai spostati
di posizione. Notiamo che l’inserimento avviene senza il controllo della
consistenza.

4.3. ALGORITMO DI LIGAND-ROTATION 47
4.3.1 Parte I: inizializzazione
Come descritto formalmente nella sezione 3.5, questa fase si occupa della
generazione degli m sistemi di riferimento su cui applicare il ligando base,
ottenendo quindi m ligandi di partenza pronti per essere computati, ognuno
con un orientamento differente. Di seguito lo pseudocodice:
✞ Codice 4.10: Pseudocodice relativo alla generazione dei ligandi base
P = p u n t i s f e r a ( k )
S = c a m p i o n a p u n t i i n i z i a l i ( j )
for p in P
Z = a s s e z
B = base (Z)
X = p r o d o t t o V e t t o r i a l e (Z , B)
Y = p r o d o t t o V e t t o r i a l e (Z , X)
norma1 (X)
norma1 (Y)
T = numeroRotazioniZ ( )
for t in T
ruota su Z ( angolo )
t r a s l o m o l e c o l a (O(X, Y, Z ) )
r u o t a m o l e c o l a (X, Y, Z)
for s in S
t r a s l o m o l e c o l a ( s )
g e n e r a c o n f o r m a z i o n i ( )
angolo += step
✡✝
✆
La funzione punti sfera(k) genera k punti disposti uniformemente su una
sfera di raggio unitario e, su ognuno di questi, si costruirà un sistema di
riferimento (come spiegato formalmente nella sezione 3.5.1). Successivamente
lo si ruoterà di T step lungo l’asse Z, ottenendo il terzo grado di libertà.
Sull’origine dei sistemi di riferimento appena generati, si andrà a posizionare
l’atomo D 0 del ligando e si ruoterà la molecola in modo tale da applicarle
la base appena generata. I ligandi che si otterrano andranno riposizionati
su ogni punto di S, insieme di coordinate definite dall’utente e campionate
dal metodo campiona punti iniziali(j) (con passo j) facendo, come al solito,
coincidere l’atomo D 0 dei ligandi con i vari punti di S. In conclusione, per
ognuno dei ligandi applicati sui sistemi di riferimento costruiti, si farà partire
l’algoritmo che genererà tutte le strutture consistenti, attraverso la chiamata
alla funzione genera conformazioni().

48 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
4.3.2 Parte II: generazione conformazioni
In seguito all’esecuzione della prima parte dell’algoritmo, ora abbiamo a
disposizione un set di ligandi L R i
, i = 1, . . . , m da poter utilizzare come
partenza per la generazione delle conformazioni consistenti.
Sia fissato k ∈ {1, . . . , m} e consideriamo L R k il ligando su cui eseguire
la computazione.
Sia inoltre D l’elenco ordinato degli atomi di L R k ottenuto da una visita
V sul grafo G, di cui ne abbiamo discusso nella sezione 3.3.
Qui di seguito lo pseudocodice dell’algoritmo utilizzato in ligand-rotation:
✞
g e n e r a c o n f o r m a z i o n i ( i )
i f D[ i ] i s root
i f v e r i f i c a v i n c o l o (D[ i ] )
i++
g e n e r a c o n f o r m a z i o n i ( i )
backtracking ( i )
i−−
backtracking ( i )
else
termina computazione ( )
else
s a l v a s o t t o a l b e r o (D[ i ] )
a n g o l o r o t a z i o n e = 0
for r o t a z i o n e in r o t a z i o n i (D[ i ] )
i f v e r i f i c a v i n c o l o (D[ i ] )
r u o t a s o t t o a l b e r o (D[ i ] , a n g o l o r o t a z i o n e )
i++
i f not D[ i ] i s l a s t
g e n e r a c o n f o r m a z i o n i ( i )
backtracking ( i )
else
s c r i v i c o n f o r m a z i o n e ( )
i−−
r i p r i s t i n a s o t t o a l b e r o (D[ i ] )
a n g o l o r o t a z i o n e += step
else :
a n g o l o r o t a z i o n e += step
r i p r i s t i n a s o t t o a l b e r o (D[ i ] )
r u o t a s o t t o a l b e r o (D[ i ] , a n g o l o r o t a z i o n e )
✡✝
✆

4.3. ALGORITMO DI LIGAND-ROTATION 49
Il primo passo dell’algoritmo sarà quello di testare, sull’atomo radice, cioè
D 0 , il vincolo di consistenza attraverso verifica vincolo(D 0 ). Nel caso di fallimento
la computazione fallirà immediatamente e si procederà con un nuovo
ligando L Rh con h ≠ k; altrimenti, si memorizzerà la posizione dell’atomo D 0
sulla sua cella corrispondente, (cf. paragrafo 4.2.2) e si procederà con l’atomo
successivo D 1 con la chiamata ricorsiva genera conformazioni(1).
Supponiamo ora di essere arrivati ad una situazione di questo tipo: abbiamo
appena verificato e convalidato il vincolo sull’atomo D i−1 e ruotato il sottoalbero
con radice il nodo corrispondente a D i−1 . Gli atomi attualmente presenti
in V, oltre quelli appartenenti alla proteina, sono I = {D 0 , . . . , D i−1 }.
Siamo in procinto di avviare la computazione per l’atomo D i con la chiamata
ricorsiva genera conformazioni(i).
Una volta chiamata, la procedura salva sottoalbero(D i ) salva la posizione
di tutti gli atomi del sottoalbero con radice l’atomo corrispondente a D i
(approfondiremo il perché di questa scelta nel paragrafo 4.3.2). Tra le possibili
scelte di rotazione su D i , si prende la prima e si verifica, quindi, il vincolo di
consistenza su D i .
Osserviamo come la verifica di consistenza viene effettuata sull’unico atomo
D i . In questo istante, si è certi che D i non subirà ulteriori rotazioni e se
valido, lo rimarrà fino a quando non verrà rimosso dalla struttura dati di cui
si serve il risolutore, tramite la procedura di backtracking. Inoltre, essendo
gli atomi dell’insieme I già validati e quindi presenti all’interno delle celle di
V si è certi che questi sono rimasti consistenti all’avanzare dell’algoritmo.
Nel caso di consistenza di D i , si procede alla rotazione del suo sottoalbero
(come spiegato nella sezione 3.4). Fatto ciò, si passa al nodo successivo e,
se non è l’ultimo, si richiama ricorsivamente la procedura proprio su D i+1 ;
in caso contrario, avendo superato con successo tutti i vincoli su tutti gli
atomi, siamo arrivati alla fine della molecola. Creiamo, quindi, il file mol2 del
ligando appena generato. Nel caso in cui il vincolo di consistenza sull’atomo
D i fallisce, si procede ad effettuare il backtracking per portarci all’atomo
precedente, si ripristina la situazione precedente alla rotazione e quindi, si
termina la computazione del nodo D i con la sua successiva eliminazione dalla
struttura dati del risolutore attraverso la procedura backtracking(i). Se D i−1
può effettuare ulteriori rotazioni, si prosegue per questa scelta, altrimenti
termina l’esplorazione del sottoalbero con radice D i−1 .
Nel momento in cui si esplorano tutte le scelte dei nodi, l’ultima operazione
da fare è eliminare l’atomo radice dalla sua cella e procedere con un
nuovo ligando base.

50 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
Ripristino situazione precedenete alla rotazione
L’aspetto chiave della seconda fase dell’algoritmo è senza dubbio la visita
dell’albero di ricerca. Qui vengono intraprese tutte le scelte possibili dei nodi
e, di conseguenza, le rotazioni effettuate sul ligando base sono numerose;
l’effetto negativo è la presenza di errori numerici. Infatti, sapendo di avere
a che fare con una mole di calcoli su R, dobbiamo preoccuparci dell’aritmetica
macchina e quindi del risultante accumulo di errore nelle operazioni di
rotazione.
Si può ricorrere a due tipi di soluzione:
• rotazione inversa
• memorizzazione informazioni prima della rotazione
Nel caso della rotazione inversa, prima di intraprendere le diverse scelte
di rotazione di un nodo, si effettua una rotazione inversa per portarci al caso
base, quindi ruotare nuovamente per proseguire lungo una scelta. Lo svantaggio
di questa tecnica è che, seppur limitatamente, andiamo incontro ad
accumulo di errore: la rotazione inversa non è la funzione inversa della rotazione.
Per cui, l’applicazione di essa non ci porterà alla situazione iniziale,
bensì ad una simile che si riperquoterà sulle rotazioni di tutto il suo sottoalbero.
Nella seconda soluzione, implementata su ligand-rotation, il ripristino si
basa su una apposita struttura dati. Prima della rotazione di un sottoalbero,
cioè prima di effettuare una scelta sul livello k, si salva la situazione corrente
dei nodi, ovvero le loro coordinate spaziali, per poi venire ripristinata quando
la procedura del backtracking ci riporta al livello k per percorrere un’altra
scelta. Al contrario della prima soluzione, l’unico errore numerico commesso
è nel calcolo della singola rotazione il quale, non si riperquoterà né sulle rotazioni
successive dello stesso nodo né sulle rotazioni dei nodi del sottoalbero.
L’unico svantaggio è nell’occupazione di memoria: per ogni livello e per ogni
scelta si dovrà memorizzare la situazione del sottoalbero. Comunque, avendo
a che fare con ligandi composti da poche decine di atomi, al massimo un
centinaio, le informazioni da salvare sono contenute.
4.4 Consistenza del vincolo
La definizione di consistenza del vincolo data in precedenza, seppure esatta,
è estremamente inefficiente. Infatti, è inutile effettuare il controllo di sovrapposizione
su atomi distanti o addiritura su atomi non ancora piazzati. Ciò
che formalizzeremo ora è l’algoritmo implementato da ligand-rotation per la
verifica della consistenza, grazie alle strutture dati definite nella sezione 4.2.

4.5. ACCENNI DI COMPLESSITÀ 51
4.4.1 Verifica dei vincoli
Il controllo dei vincoli durante l’esecuzione dell’algoritmo di ligand-rotation
funziona in questo modo: una volta effettuata la rotazione di un atomo e del
relativo sottoalbero, si inserisce il primo atomo all’interno di una cella. Sia
a l’atomo da inserire con coordinate spaziali (x a , y a , z a ) ∈ R e di raggio r.
L’insieme C degli atomi da verificare è definito come:
dove:
C = G adj(a)
• G è l’insieme degli atomi vicini, (cf. definizione 4.3)
• adj(a) è l’insieme degli atomi adiacenti, (cf. definizione 4.1)
Il vincolo di non sovrapposizione viene dunque verificato per ogni z ∈ C:
S(a, z) =
{
true, se ‖a − z‖ ≥ raggio(a) + raggio(z)
false,
altrimenti
✞
✡✝
Qui di seguito lo pseudocodice implementato in ligand-rotazion.
v e r i f i c a v i n c o l o ( a , Celle , Adiacenti )
i f a not in V
return f a l s e
for c e l l a in C e l l e
for atomo in atomi . c e l l a
i f atomo i s not in a d i a c e n t i
i f d ( a , atomo ) < a . r a g g i o + atomo . r a g g i o
return f a l s e
else
return true
✆
4.5 Accenni di Complessità
Il concetto di complessità computazionale è strettamente legato ai diversi
gradi di libertà che ligand-rotation possiede. Il grado di libertà che più ‘rallenta’
l’algoritmo è la rotazione sul legame: avendo a disposizione k scelte per

52 CAPITOLO 4. DETTAGLI IMPLEMENTATIVI
ogni legame, si deduce abbastanza velocemente che ligand-rotation ha una
complessità esponenziale sul numero dei legami n. In particolare, risulta:
C T (n) = O(k n )
dove k rappresenta il numero degli step effettuati per ogni legame ruotabile.
Sebbene ligand-rotation cresca esponenzialmente, le tecniche della programmazione
a vincoli permettono di ridurre notevolmente la complessità
operando dei tagli all’albero di ricerca. Infatti, intercettando l’inconsistenza
di un nodo, viene eliminato tutto il sottoalbero relativo e quindi parte delle
soluzioni totali, in modo tale da evitare la visita fino alle foglie dei percorsi
inconsistenti.
L’altro grado di libertà è dato dal possibile posizionamento del ligando
nelle tre dimensioni. Esso rappresenta una semplice costante moltiplicativa
a C T , data dal numero di sistemi di riferimento totali e dal numero di punti
iniziali. Tuttavia, questa costante è abbastanza alta 4 e, non avendo un numero
di legami ruotanti estremamente alto, il passo di discretizzazione può influire
sul costo complessivo dell’algoritmo.
4 Nel caso di 210 diversi sistemi di riferimento e 27 punti iniziali, la costante è pari a
5670, quindi da non sottovalutare.

Capitolo 5
Risultati
In questo capitolo si illustreranno i risultati ottenuti da ligand-rotation. Descriveremo
(nella sezione 5.1) il complesso preso in esame per la realizzazione
dei test. Successivamente (nella sezione 5.2) analizzaremo in dettaglio i test
eseguiti, mostrando il comportamento registrato da ligand-rotation al variare
dei parametri di qualità. Presenteremo, in particolare, una configurazione
ottimale. Infine (nella sezione 5.3) faremo dei confronti sulle possibili visite
implementabili per generare l’albero e su come esse andranno ad incidere sul
tempo di esecuzione.
Come primo test di fattibilità non consideriamo una funzione energetica
bensì confrontiamo i risultati ottenuti con il ligando minimizzato preso da
PDB attraverso un test di tipo geometrico, calcolando il Root Mean Square
Deviation (RMSD) definito come segue:
Definizione 5.1. Siano L e C gli insiemi degli atomi rispettivamente del ligando
minimizzato e di quello appena generato. Sia N = |L| = |C|; definiamo
l’RMSD come:
RMSD = √ 1 N
N∑
‖n i − m i ‖ n i ∈ L, m i ∈ C (5.1)
i=1
Valori dell’RMSD pari a 0.5Å stanno a significare che la distanza quadratica
media tra gli atomi del ligando minimizzato e quello ottenuto da
ligand-rotation è di 0.5Å. Le distanze di legame sono circa di 1.5Å; commettere
un errore sotto l’Ångström caratterizza le posizioni degli atomi con
sufficiente precisione.
53

54 CAPITOLO 5. RISULTATI
5.1 Applicazioni possibili
Figura 5.1: Struttura molecolare del tamoxifene
Il complesso ligando-proteina studiato in questa tesi ha code number (relativo
a PDB) 1XPC ; esso possiede numerosi ligandi, ma il nostro studio è
stato rivolto principalmente all’analisi del tamoxifene.
Sono stati effettuati i primi test di ligand-rotation con il tamoxifene
(OHT). In figura 5.1 è illustrata la struttura del farmaco, mentre in 5.2 è
illustrato il complesso ligando-proteina. Questo è un antitumorale appartenente
alla famiglia dei farmaci interagenti con il recettore degli estrogeni e
viene utilizzato nei casi di tumore mammario metastatico con buoni risultati.
Successivamente sono stati scoperti gli ottimi benefici nella prevenzione della
ripresa della malattia in donne già operate per tumore al seno.
Il tamoxifene presenta una struttura molecolare relativamente semplice;
altri possibili ligandi non sono stati presi in considerazione, in quanto la
loro struttura presentava dei cicli pentano e cicli esano che complicavano
pesantemente l’algoritmo (cf. sezione 6.1). Avendo svolto questo lavoro in
tempi relativamente brevi, non si è riusciti nell’intento di gestire molecole
con le caratteristiche sopra citate.
5.2 Efficienza
Considerando il fatto che ligand-rotation è ancora un programma in evoluzione
e che necessita di notevoli estensioni per essere utilizzato in ambito
professionale, i risultati ottenuti sono abbastanza soddisfacenti. Il nostro
obiettivo è quello di generare conformazioni con un RMSD minore di 1Å in
tempi ragionevoli. Come vedremo, è stato raggiunto con successo. La figura
5.3 mostra uno tra i migliori risultati ottenuti con ligand-rotation.

5.2. EFFICIENZA 55
Figura 5.2: Immagine del complesso esaminato ottenuta effettuando un rendering
con Molegro Molecular Viewer: in rosso è possibile vedere la struttura
della proteina, mentre in verde il ligando OHT

56 CAPITOLO 5. RISULTATI
Figura 5.3: In verde è visibile il ligando ottenuto con ligand-rotation mentre
in rosso è rappresentato il ligando minimizzato, scaricato da PDB. Il valore
di RMSD tra le due molecole è pari a 0.799538, ottenuto con la seguente
configurazione: 7 step di rotazioni, 210 sistemi di riferimento, passo cella di 1Å
e punti iniziali campionati a 0.5Å. Il tempo di esecuzione di ligand-rotation,
con questa specifica configurazione, è stato di 172 minuti.

5.2. EFFICIENZA 57
5.2.1 Variazione parametri qualitativi
Questa classe di test ha l’obiettivo di stabilire il grado di efficienza di ligandrotation
al variare dei parametri di configurazione; si terrà conto del valore
dell’RMSD migliore e del tempo impiegato nel generare tutte le conformazioni.
Variazione degli step di rotazione
Esaminiamo in dettaglio il comportamento registrato dal pacchetto di docking
a variazioni degli step di rotazione. Ricordiamo che lo step di rotazione
rappresenta il valore delle variabili di tipo legame.
Lo scopo è quello di misurare l’efficienza e il corretto posizionamento del
ligando al variare degli step. Fissatone uno, i test verranno condotti su configurazioni
nelle quali varierà il numero dei sistemi di riferimento. Il numero di
step di rotazione presi in considerazione sono {2, 3, 4, 5, 6, 7}. Come visibile
nel grafico 5.4, l’esecuzione con un numero di step inferiore a 5, sebbene impieghi
molto meno, in particolare non si superano i 5 minuti di calcolo, non
produce risultati significativi sotto l’Ångström. Dal grafico si può notare il
miglioramento delle conformazioni ottenute, in termini di RMSD, all’aumentare
degli step di rotazione, a discapito del tempo impiegato, il quale resta
comunque sempre ragionevole, ovvero entro le 6 ore di calcolo.
Variazione campionamento delle basi ortonormali
Questa classe di test è volta a misurare la reazione di ligand-rotation al variare
dei sistemi di riferimento. Dopo averne fissato uno, i test eseguiti varieranno
per il numero di step di rotazione. Nel grafico 5.5 sono visibili i valori ottenuti
campionando le basi ortonormali: sull’asse delle ascisse sono riportati i tempi
in scala logaritmica, mentre sull’asse delle ordinate i valori di RMSD migliori
per ogni istanza di ligand-rotation. I risultati, limitatamente al ligando testato,
mostrano che anche con soli 54 1 sistemi di riferimento ligand-rotation sia
stato in grado di ottenere strutture molecolari molto valide, entro l’Ångström
di RMSD, in tempi molto brevi, precisamente in un’ora e mezza di calcoli
per una conformazione con RMSD pari a 0,85534Å.
Campionamento delle celle di V
Il seguente test è rivolto a identificare la dimensione ottimale delle celle di
V. Nel grafico 5.6, l’asse delle ascisse individua il numero degli step di rotazione
rispetto ai quali si sono effettuati i test, mentre l’asse delle ordinate, in
1 Esattamente 9 punti sulla sfera e 6 step di rotazione sull’asse Z

58 CAPITOLO 5. RISULTATI
Prestazioni−qualità al variare degli step di rotazione
1.7
1.6
1.5
7 step
6 step
5 step
4 step
1.4
1.3
rmsd
1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7
10 −1 10 0 10 1 10 2 10 3
tempo espresso in minuti
Figura 5.4: Grafico rappresentante qualità in termini di RMSD, rispetto al
ligando minimizzato, e prestazioni, in termini di tempo di esecuzione del
programma. Le molecole accettabili si trovano sotto l’Ångström.

5.2. EFFICIENZA 59
Prestazioni−qualità al variare del passo di campionamento
della base ortonormale
3.5
3
210
120
72
54
2.5
rmsd
2
1.5
1
0.5
10 −3 10 −2 10 −1 10 0 10 1 10 2 10 3
tempo espresso in minuti
Figura 5.5: Grafico rappresentante qualità in termini di RMSD, rispetto al
ligando minimizzato, e prestazioni, in termini di tempo di esecuzione del
programma. Le molecole accettabili si trovano sotto l’Ångström.

60 CAPITOLO 5. RISULTATI
scala logaritmica, identifica il tempo in minuti dell’esecuzione di ogni istanza
di ligand-rotation. La dimensione del lato delle celle è un parametro molto
importante, che andrà ad influire sul tempo totale della computazione ma
non sulla qualità dei risultati. Questo perché, nel momento della verifica dei
vincoli, si andranno a selezionare e controllare tutte le celle che potenzialmente
possono contenere atomi sovrapposti. Una dimensione troppo piccola
comporterebbe un numero di celle da visitare elevato, con conseguente perdita
di tempo; su molte di esse potrebbe non esserci nemmeno un atomo.
Al contrario, una dimensione troppo grande comporterebbe una verifica dei
vincoli anche su atomi ‘lontani’ poiché una cella potrebbe contenere atomi
distanti tra loro, rappresentando una porzione di spazio relativamente grande.
Dai risultati, si evince che la misura ottimale è data da 2Å: considerando
l’esecuzione con 6 step, il tempo impiegato da quest’ultima rispetto ad un
campionamento a 0.5Å si dimezza.
5.3 Confronti su visite
Un aspetto molto importante è la generazione dell’albero a partire dal grafo,
dato che sta alla base della visita sullo spazio di ricerca delle combinazioni del
ligando. Modificando l’albero si influenzerà l’ordine di esplorazione delle variabili
(e di conseguenza l’albero di ricerca) e si potrà avere un miglioramento
o un peggioramento delle prestazioni, in modo dipendente a seconda dalla
particolare posizione assunta degli atomi nella lista D e da quanto spesso
falliranno.
5.3.1 DFS sul grafo della molecola
Il primo algoritmo, implementato su ligand-rotation con il compito di visitare
il grafo G = (V, E) rappresentante il ligando, è la DFS, visita in profondità.
La strategia di ricerca esplora il grafo andando, in ogni istante dell’esecuzione
dell’algoritmo, il più possibile in profondità: gli archi del grafo vengono
esplorati a partire dall’ultimo vertice scoperto v che abbia ancora degli archi
non esplorati uscenti da esso. Una volta terminata l’esplorazione di tutti gli
archi non esplorati del vertice v, si ritorna indietro per esplorare tutti gli archi
uscenti a partire dal vertice da cui v ′ era stato precedentemente scoperto.
Il processo di esplorazione continua fin quando tutti i vertici del grafo non
siano stati esplorati.
Grazie al fatto che G è connesso, ovvero che la cardinalità delle sue
componenti connesse è 1, la ricerca DFS produce un unico albero.

5.3. CONFRONTI SU VISITE 61
Prestazioni al variare del campionamento delle celle
10 5
10 4
step rotazioni
0.5Å
1Å
2Å
3Å
tempo espresso in minuti
10 3
10 2
10 1
10 0
4 5 6
Figura 5.6: Grafico rappresentante il tempo di esecuzione al variare del campionamento
delle celle di V. Raggruppati sulle ascisse, i test svolti con 4,
5, 6 step di rotazione, mentre sull’asse delle ordinate il tempo impiegato da
ligand-rotation (in scala logaritmica).

62 CAPITOLO 5. RISULTATI
La ricerca DFS, inoltre, marca ogni vertice con ben precise informazioni
temporali, in particolar modo aggiorna due etichette per ogni vertice: d[v]
che registra quando il generico vertice v è stato scoperto ed f[v] che registra
quando è stata esplorata l’intera lista di adiacenza di v.
La complessità computazionale di una DFS è pari a Ω(V +E). In ogni caso,
rispetto al tempo di esecuzione dell’intero programma, è assai irrilevante: la
DFS fa parte della fase di pre processing di ligand-rotation, per cui viene
effettuata una sola volta.
5.3.2 Modifica della DFS: first fail
Una piccola, ma sostanziale, modifica all’algoritmo della DFS consiste nell’ordinare
tutti i nodi adiacenti a quello attualmente visitato in base al numero
di rotazioni che possono effettuare: dal più basso al più alto. La strategia che
si vuole implementare è quella simile ad una first fail, ovvero si fa in modo
che durante l’iterazione della lista D si fallisca il prima possibile. Così facendo,
poiché interviene il backtracking per portarci allo stato precedente, si
elimina tutto il sottoalbero relativo al vertice in cui abbiamo fallito, andando
a ridurre il numero di soluzioni finali e risparmiando il tempo impiegato ad
una esplorazione di un sottoalbero privo di soluzioni.
L’implementazione su ligand-rotation, in pratica, è una first fail statica.
La scelta delle variabili viene effettuata nella fase di preprocessing, durante la
DFS, e l’ordinamento riguarda gli archi del singolo nodo, indipendentemente
dagli altri.
La modifica della DFS può trovare giustificazione nel fatto che avendo da
attuare due scelte, una dipendente dall’altra, conviene intraprendere prima
quella con meno possibilità. Cosicché, in caso di fallimento, il sottoalbero
eliminato conterrà più nodi.
Nel grafico 5.7 sono rappresentati i risultati ottenuti sia da istanze di
ligand-rotation su cui è stata implementata la first fail che da altre senza. Dai
test effettuati si può concludere che la first fail ha avuto successo, riducendo
i tempi di esecuzione.

5.3. CONFRONTI SU VISITE 63
Prestazioni al variare della visita sul grafo
10 4 DFS first fail
DFS
step rotazioni
10 3
tempo espresso in minuti
10 2
10 1
10 0
4 5 6
Figura 5.7: Grafico rappresentante il tempo di esecuzione di istanze di ligandrotation
con first fail e senza.

64 CAPITOLO 5. RISULTATI

Capitolo 6
Conclusioni e Sviluppi futuri
In questo lavoro di Tesi si è affrontato il problema del docking. In particolare,
lo scopo era volto alla costruzione di un nuovo pacchetto in grado di far
interagire tra loro due molecole, senza che ciò fosse influenzato da funzioni
di scoring che valutano la stabilità energetica.
La soluzione offerta a questo problema è, appunto, ligand-rotation; programma
da me studiato e implementato, in grado di generare strutture molecolari
geometricamente corrette e, oltretutto, in maniera efficiente, per quel
che riguarda il tempo impiegato nei calcoli.
Grazie all’approccio interamente geometrico, i test di validità eseguiti
su ligand-rotation hanno dimostrato che è possibile raggiungere una qualità
accettabile rispetto alle richieste reali da parte delle case farmaceutiche.
Con una configurazione standard, che porta il programma a conclusione
nel giro di 6 ore al massimo 1 , si riesce a produrre posizionamenti di molecole
entro l’Ångström di RMSD, cioè si ottengono ligandi dalla struttura molto
simile a quella minimizzata, scaricata dal database PDB.
Una passo successivo a questa Tesi consiste nell’applicare una funzione
di scoring per valutare l’energia complessiva del complesso ligando-proteina
determinando la stabilità del sistema; in particolare, ci interessa quanto sia
correlata all’RMSD ottenuto dai nostri test.
Verranno ora mostrati alcuni riferimenti utili all’evoluzione di ligandrotation.
L’ingegneria del software insegna che un programma informatico
è in costante evoluzione, sia per quel che riguarda la risoluzione di bug esistenti
che per l’aggiunta di nuove funzionalità. Essendo un progetto giovane,
l’intento è quello di poter sviluppare nuove metodologie che constentiranno a
ligand-rotation l’elaborazione di differenti tipi di molecole, anche complesse,
1 Il tempo impiegato da ligand-rotation dipende molto dal ligando scelto e dal numero
di legami ruotabili.
65

66 CAPITOLO 6. CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
garantendo tempi di esecuzione ragionevoli e più precisione nella generazione
delle strutture dei ligandi.
Nella sezione 6.1 cercheremo di dare una possibile estensione all’algoritmo
esistente, in modo tale da poter trattare molecole con caratteristiche di
struttura particolari.
Successivamente (nella sezione 6.2) si descriverà l’idea di un nuovo potenziale
modello a vincoli che prevede l’inserimento di ulteriori vincoli e
l’implementazione della propagazione.
6.1 Molecole contenenti cicloesano
Un problema incontrato nello sviluppo di ligand-rotation è stato che, per
particolari ligandi, non si è riusciti ad ottenere un loro buon posizionamento
in termini di RMSD con il ligando minimizzato. Sono stati condotti numerosi
test e le migliori conformazioni si aggiravano intorno a 1.5Å - contro il nostro
limite di accettazione di 1Å. Il problema non stava nemmeno alla base delle
opzioni di campionamento; infatti, all’aumentare dei parametri di qualità,
non si apprezzavano miglioramenti da parte delle strutture generate.
Figura 6.1: A sinistra il ligando ottenuto con ligand-rotation, a destra il
ligando minimizzato scaricato da PDB
La strada da percorrere è completamente diversa. Alla base di ciò ci sono
particolari strutture molecolari denominate Cicloesano e Ciclopentano, che
dovranno essere trattate in modo completamente differente.

6.1. MOLECOLE CONTENENTI CICLOESANO 67
6.1.1 Cicloesano
Il cicloesano fa parte della famiglia dei cicloalcani; è composto da sei atomi
di carbonio e 12 atomi di idrogeno, è privo di doppi e tripli legami e la sua
struttura è chiusa ad anello.
Gli atomi di carbonio hanno ibridizzazione sp 3 , andando a formare delle
strutture tetraedriche con angoli di legame di 109.5 ◦ . La struttura quindi
non sarà planare, la quale ha angoli di 120 ◦ , bensì tenderà ad assumere una
conformazione a sedia, visibile in figura 6.2.
Figura 6.2: La figura mostra la struttura del cicloesano con a sinistra una
conformazione a sedia e a destra una conformazione a barca
Oltre quella a sedia, esistono altre conformazioni, sebbene con maggiore
energia e quindi meno stabili: conformazione a barca (in figura 6.2) e a mezza
sedia. In figura 6.3 si esprime l’energia del cicloesano per ogni conformazione.
Figura 6.3: La figura rappresenta le possibili energie delle strutture del
cicloesano in funzione alle conformazioni assunte

68 CAPITOLO 6. CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
6.1.2 Nuovi gradi di libertà
Tutte le conformazioni del cicloesano elencate nella precedente sezione non
possono essere ottenute a partire da semplici rotazioni. È necessario implementare
un nuovo algoritmo da inglobare a quello esistente, in grado di gestire
più gradi di libertà. L’idea è quella di individuare queste strutture particolari
attraverso la visita del grafo del ligando e, successivamente, nel momento
in cui si piazzano i suoi atomi, è necessario capire la conformazione attuale
per andare a simulare tutti i suoi possibili stati conformazionali prima della
rotazione del sottoalbero.
6.2 Espansione modello a vincoli
Un primo ampliamento da realizzare su ligand-rotation potrebbe essere quello
di integrare il modello a vincoli, introducendono di ulteriori, come la verifica
della lunghezza di un legame chimico, oppure implementare la propagazione
dei vincoli. Nei paragrafi 6.2.1 e 6.2.2 svilupperemo questi due argomenti.
6.2.1 Controllo lunghezza legame
Con il modello a vincoli attualmente implementato in ligand-rotation, la verifica
della lunghezza dei legami chimici sarebbe completamente inutile, anzi
sarebbe un aggravio alla complessità totale del sistema. Al contrario, riuscendo
a trattare molecole come il cicloesano o il ciclopentano, si introdurrebbe
un nuovo grado di libertà e il controllo diventerebbe sensato. Effettuando
delle rotazioni anche sui legami delle precedenti strutture si potrebbe andare
incontro ad una rottura del ciclo.
6.2.2 Implementazione propagazione dei vincoli
Il modello a vincoli qui presentato non implementa su di sé la propagazione
dei vincoli; questione non affrontata a causa dello scarso tempo avuto a
disposizione. Dalla sezione 1.4 sappiamo che la propagazione ha il compito
di ridurre lo spazio di ricerca, eliminando eventuali elementi del dominio.
Nel nostro caso, l’eliminazione riguarda le possibili rotazioni. L’idea è
quella di evitare di visitare porzioni di albero inconsistenti. Nel contesto di
ligand-rotation, una possibile definizione di propagazione sarebbe questa:
nel momento in cui si identifica una rotazione che sicuramente porta
a fallimento, la si elimina dal dominio della sua variabile legame. Come
conseguenza di ciò, si potrebbe avere il risveglio a catena di altre propagazioni
e quindi l’eliminazione di altre rotazioni.

6.2. ESPANSIONE MODELLO A VINCOLI 69
L’interazione tra vincoli di non sovrapposizione e rotazione di un legame
possono fornire deduzioni sulla effettiva validità dei valori del dominio delle
variabili. Supponiamo di compiere un movimento alla struttura molecolare.
Attraverso un algoritmo, possiamo essere in grado di stabilire a priori che
sicuramente la rotazione appena effettuata non porta a nessuna soluzione
valida. In virtù di ciò, si deduce che i valori ammissibili di alcune variabili
di tipo legame sono incongruenti con i vincoli implementati e si effettua,
quindi, una riduzione del dominio delle variabili implicate. Osserviamo come
il costo computazionale degli algoritmi di propagazione debba essere molto
basso affinché il loro utilizzo sia giustificato.

70 CAPITOLO 6. CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI

Bibliografia
[1] Thomas Lengauer (Ed.). Bioinformatics - From Genomes to Drugs,
Volume I. WILEY-VCH, 2001.
[2] Peter Atkins, Loretta Jones. Principi di chimica. Zanichelli, 2005.
[3] William K. Purves, David Sadava, Gordon H. Orians and H. Craig
Heller. Elementi di Biologia e Genetica. Zanichelli, 2005.
[4] Harold Hart, David J. Hart, Leslie E. Craine. Chimica organica, quarta
edizione. Zanichelli, 1998.
[5] Krzysztof R. Apt. Principles of Constraint Programming. Cambridge
University Press, 2003.
[6] Bjarne Stroustrup. C++: linguaggio, libreria standard, principi di
programmazione. Addison-Wesley, 2000.
[7] Gregory L. Warren, C. Webster Andrews, Anna-Maria Capelli, Brian
Clarke, Judith LaLonde, Millard H. Lambert, Mika Lindvall, Neysa Nevins,
Simon F. Semus, Stefan Senger, Giovanna Tedesco, Ian D. Wall,
James M. Woolven, Catherine E. Peishoff and Martha S. Head. A critical
Assessment of Docking Programs and Scoring Function. Journal of
Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49, No. 20.
[8] http: // mathworld. wolfram. com/ RotationFormula. html .
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