I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali
I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali
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I <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong> e <strong>loro</strong><br />
<strong>applicazioni</strong> <strong>nelle</strong><br />
<strong>produzioni</strong> <strong>animali</strong><br />
Dott.ssa Chiara Targhetta
LOCUS<br />
localizzazione genomica unica all’interno<br />
di un cromosoma; permette di definire<br />
la posizione di un gene o di una qualsiasi<br />
sequenza di DNA<br />
ALLELE<br />
una delle varie forme alternative di un<br />
gene o di una sequenza di DNA in una<br />
specifica localizzazione cromosomica<br />
(locus)<br />
Varianti alleliche<br />
Responsabili del<br />
POLIMORFISMO del<br />
genoma<br />
(VARIABILITÀ<br />
GENETICA)
I <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong><br />
Sono sequenze polimorfiche (presentano più<br />
varianti alleliche) che si trovano in un locus<br />
specifico all’interno del cromosoma; si<br />
comportano in modo mendeliano e sono di facile<br />
rilevazione<br />
Identificano regioni cromosomiche <strong>nelle</strong> quali<br />
possono essere localizzati geni importanti la cui<br />
segregazione è difficile o impossibile da seguire
I <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong><br />
Poiché sono polimorfici possono essere utilizzati<br />
per valutare la variabilità genetica presente <strong>nelle</strong><br />
specie e <strong>nelle</strong> popolazioni<br />
Locus 1<br />
Locus 2<br />
I <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong> infatti identificano in modo<br />
semplice le mutazioni che si sono accumulate nel<br />
corso della storia evolutiva delle popolazioni
I <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong><br />
m1<br />
m2<br />
m1<br />
m2<br />
m3<br />
m3<br />
Essi permettono di costruire mappe<br />
genomiche dette mappe di linkage, definite<br />
in base alla frequenza di ricombinazione di<br />
tali <strong>marcatori</strong><br />
Avendo a disposizione <strong>marcatori</strong> distribuiti<br />
uniformemente sul genoma è possibile<br />
seguire in modo indiretto la segregazione di<br />
qualsiasi gene
Classi di <strong>marcatori</strong> <strong>genetici</strong>..<br />
..rilevabili a vari livelli<br />
a) livello morfologico:<br />
- caratteri mendeliani (caratteri qualitativi)<br />
b) livello biochimico:<br />
- gruppi sanguigni<br />
- isoenzimi<br />
- proteine (del plasma, del latte etc.)<br />
c) livello di DNA:<br />
- SNP, microsatelliti, RFLP, AFLP, RAPD,……
Caratteristiche favorevoli dei<br />
<strong>marcatori</strong> del DNA<br />
•Non influenzati dall’ambiente<br />
•Analisi indipendenti da sesso ed età<br />
•Campioni di qualsiasi tessuto<br />
•Neutrali<br />
•Stabili<br />
•Numerosi<br />
•Polimorfici<br />
•Generalmente codominanti<br />
•Facili da monitorare<br />
•Analisi automatizzabili
SNPs<br />
Polimorfismi a livello di singoli nucleotidi<br />
Variazioni di singole basi<br />
GAT CAG TTC GAT GTC<br />
GAT CAG TTA GAT GTC<br />
Frequenza elevata (più dell’1%)<br />
Molto abbondanti<br />
Distribuiti in modo casuale
Caratteristiche SNPs<br />
Numerosità (sono milioni)<br />
Alta riproducibilità e accuratezza<br />
Analisi è automatizzabile<br />
Sono spesso contenuti nei geni espressi<br />
Richiedono un lungo lavoro di messa a punto<br />
(per l’individuazione del marcatore e del<br />
metodo per la sua rilevazione)<br />
Ne servono molti di più in fase di<br />
genotipizzazione
MICROSATELLITI o SSR<br />
(Simple Sequence Repeats)<br />
Ripetizioni in tandem di corte sequenze di<br />
nucleotidi:<br />
(AC) n , o (GT) n o (CAC) n o (GATA) n<br />
di- di- tri- tetra- nucleotidi<br />
Distribuite nel genoma animale in numero<br />
elevatissimo<br />
Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero<br />
di ripetizioni del motivo di base del microsatellite n<br />
Le regioni fiancheggianti tali ripetizioni sono<br />
conservate entro la specie e spesso anche a livello<br />
interspecifico
MICROSATELLITI o SSR
Visualizzazione microsatelliti<br />
1) ESTRAZIONE DEL DNA<br />
Sangue<br />
Pelo<br />
Feci Seme<br />
2) PCR<br />
DNA<br />
POLYMERASE CHAIN REACTION<br />
Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo<br />
3 paia di<br />
cromosomi<br />
omologhi<br />
3) ELETTROFORESI
PCR<br />
(polymerase chain reaction)<br />
Strumento per ottenere molte copie di una sequenza di DNA<br />
La reazione di amplificazione avviene ad opera di un enzima,<br />
la DNA polimerasi, e di sonde (primer) in grado di legarsi in<br />
modo complementare alle regioni fiancheggianti la mia<br />
sequenza bersaglio<br />
Il processo di amplificazione avviene in tre fasi:<br />
1) Denaturazione del DNA (94-95°C)<br />
2) Ibridazione del primer ad una temperatura variabile da 45 a<br />
65 °C a seconda della lunghezza e sequenza del primer<br />
3) Estensione del frammento bersaglio (72 °C)<br />
Tale ciclo si ripete n volte.<br />
La reazione viene effettuata in un termostato programmabile<br />
I prodotti possono essere visualizzati su un gel d’agarosio
Microsatelliti o SSR
AFLP<br />
(amplified fragment lenght polimorphism)<br />
Evidenziano polimorfismi di<br />
restrizione, delezioni e inserzioni<br />
Allele 1<br />
Allele 2<br />
X<br />
Sequenza di taglio dell’enzima di restrizione
AFLP – fasi sperimentali<br />
EcoRI<br />
TaqI<br />
•Digestione<br />
del DNA con enzimi di<br />
restrizione<br />
•Legame di oligonucleotidi adattatori alle estremità dei<br />
frammenti (permettono l’attacco dei primer nella fase<br />
successiva)<br />
•Preamplificazione<br />
tramite PCR di parte dei<br />
frammenti generati<br />
•Amplificazione<br />
selettiva e contemporanea<br />
marcatura di parte dei frammenti<br />
preamplificati<br />
•Visualizzazione<br />
tramite elettroforesi dei<br />
frammenti selezionati e marcati
AFLP<br />
Marcatore<br />
polimorfico<br />
Marcatore<br />
monomorfico
Applicazioni dei <strong>marcatori</strong> nel settore<br />
zootecnico<br />
•Costruzione di mappe genetiche e fisiche<br />
•Mappatura di geni utili<br />
•Isolamento di geni utili<br />
•Mappatura di QTL<br />
•Diagnosi di anomalie genetiche<br />
•Analisi di paternità<br />
•Studi su filogenesi, variabilità genetica,<br />
struttura e dinamica di specie e popolazioni<br />
•Stima della consanguineità e ausilio ai piani<br />
di accoppiamento<br />
•Tracciabilità dei prodotti
QTL: QUANTITATIVE TRAIT LOCUS<br />
sequenza genomica che ha un ruolo<br />
nell’espressione di un carattere quantitativo<br />
è associata alla manifestazione di un carattere<br />
produttivo; probabilmente contiene un gene che<br />
è coinvolto nell’espressione di quel carattere<br />
se si individua un marcatore ad essa<br />
contiguo/associato si può selezionare per il<br />
carattere desiderato (es. produzione di latte)<br />
semplicemente valutando la presenza/assenza di<br />
determinate varianti alleliche del marcatore
Mappa genetica<br />
..e identificazione di QTL<br />
SELEZIONE ASSISTITA DA<br />
MARCATORI<br />
l’identificazione di<br />
un’associazione tra marcatore<br />
e QTL permette una selezione<br />
più efficiente<br />
CLONAGGIO DI POSIZIONE<br />
identificare e clonare un gene<br />
che influenza un carattere<br />
quantitativo
Analisi paternità con microsatelliti<br />
Due alleli del microsatellite<br />
PADRE<br />
GENOTIPO: 263/263<br />
PADRE<br />
GENOTIPO: 128/140<br />
263<br />
128 140<br />
GENOTIPO: 128/146<br />
GENOTIPO: 263/277<br />
MADRE<br />
MADRE<br />
128 146<br />
263 277<br />
FIGLIO<br />
GENOTIPO: 128/128<br />
FIGLIO<br />
GENOTIPO: 263/263<br />
128<br />
263<br />
FIGLIO<br />
GENOTIPO: 124/128<br />
GENOTIPO: 263/277<br />
124<br />
128<br />
FIGLIO<br />
263 277<br />
FIGLIO<br />
GENOTIPO: 128/128<br />
128<br />
DIAGNOSI POSITIVA<br />
DIAGNOSI NEGATIVA
Paternità:<br />
APPLICAZIONI<br />
Analisi di paternità<br />
• esclusa in modo deterministico<br />
- il figlio ha un allele diverso da quello dei<br />
genitori<br />
- il figlio non ha almeno un allele di<br />
ciascun genitore<br />
• provata solo in modo probabilistico<br />
•Stime degli indici <strong>genetici</strong> con il metodo<br />
BLUP-Animal Model<br />
•Piani di accoppiamento<br />
•Calcolo dell’ereditabilità
Marcatori e tracciabilità<br />
Utilizzando contemporanemente più<br />
<strong>marcatori</strong> si ottengono profili allelici in<br />
grado di identificare in modo univoco<br />
gli individui<br />
impronte digitali del DNA (fingerprinting)<br />
Se il profilo dell’individuo è unico o è altamente<br />
probabile che lo sia, posso riconoscere l’individuo<br />
stesso a partire da campioni di tessuto (sangue, pelo,<br />
carne, latte) dai quali ottengo il DNA da sottoporre<br />
all’analisi dei <strong>marcatori</strong><br />
TRACCIABILITÀ
In corrispondenza di ogni marcatore ogni individuo avrà uno<br />
solo (omozigosi) o due degli alleli possibili<br />
la probabilità che due individui abbiano la stessa<br />
combinazione di alleli in un locus può essere alta<br />
se aumentiamo il numero dei <strong>marcatori</strong> la probabilità che due<br />
individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i<br />
loci diventa piccolissima<br />
Numero loci<br />
(<strong>marcatori</strong>)<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
10<br />
Probabilità di<br />
matching (stesso<br />
profilo) *<br />
12.50000000 %<br />
1.56250000 %<br />
0.19531250 %<br />
0.02441406 %<br />
0.00305176 %<br />
0.00000005 %<br />
*considerando che tutti gli alleli in tutti i loci abbiano una frequenza pari a 0.25<br />
(quattro alleli per ogni locus)
Marcatori<br />
e variabilità genetica<br />
BIODIVERSITA’:<br />
“...the variability among living organism in all<br />
the ecosystems in which they are part …”<br />
(FAO 1992)
Misurare la diversità<br />
a) a livello fenotipico:<br />
- caratteri morfometrici<br />
- caratteri morfologici<br />
•Una porzione molto elevata di diversità<br />
genetica non è espressa<br />
•Nuove tecnologie permettono di rivelarla<br />
b) a livello genotipico:<br />
- <strong>marcatori</strong> biochimici<br />
- <strong>marcatori</strong> molecolari
Marcatori molecolari<br />
La variabilità è espressa da:<br />
•Numero e % di <strong>marcatori</strong> polimorfici<br />
•Numero medio di alleli per locus<br />
La variabilità è quantificabile tramite:<br />
•Eterozigosi attesa H exp =1-p 2 - q 2<br />
•Calcolo delle distanze genetiche
Rappresentazione delle<br />
distanze attraverso un<br />
dendrogramma
Marcatori molecolari e distanze<br />
genetiche<br />
Individuo A<br />
Individuo B<br />
Confronto profili ottenuti<br />
con analisi <strong>marcatori</strong><br />
Stima della diversità in<br />
termini di numero di bande<br />
comuni e bande non<br />
condivise<br />
Maggiori le differenze fra i<br />
profili ⇒<br />
Maggiori le diversità a livello<br />
genomico
Importanza della conservazione della<br />
biodiversità <strong>nelle</strong> specie zootecniche<br />
üSoddisfare future richieste di mercato<br />
üSoddisfare futuri bisogni dell’uomo<br />
üAffrontare nuove patologie e condizioni ambientali<br />
üValore storico e culturale<br />
üValore ecologico (equilibrio ecosistema)<br />
üConservazione del territorio<br />
üValore socio-economico in aree marginali e PVS (es.<br />
prodotti tipici, turismo)
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