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说 明 书 摘 要
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本 发 明 涉 及 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗
体 。 本 发 明 的 结 合 分 子 能 够 结 合 具 有 天 然 构 象 的 流 感 病 毒 血 凝 素 蛋 白 HA2 亚
基 , 能 够 阻 止 多 种 亚 型 流 感 病 毒 侵 染 易 感 细 胞 。 与 一 些 动 物 源 性 的 结 合 分 子 相
比 , 本 发 明 的 结 合 分 子 免 疫 原 性 大 大 减 少 , 且 亲 和 性 良 好 。 不 仅 治 疗 效 果 好 ,
而 且 副 作 用 低 。
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权 利 要 求 书
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1. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 8 所 示 重 链 CDR1 区 、SEQ ID
NO: 9 所 示 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 重 链 CDR3 区 。
2. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 14 所 示 轻 链 CDR1 区 、SEQ ID
NO:15 所 示 轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 轻 链 CDR3 区 。
3. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 以 下 的 氨 基 酸 序 列 :SEQ ID NO: 8 所 示
的 重 链 CDR1,SEQ ID NO: 9 所 示 的 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 的 重 链
CDR3,SEQ ID NO: 14 所 示 的 轻 链 CDR1、SEQ ID NO: 15 所 示 的 轻 链 CDR2 和
SEQ ID NO: 16 所 示 的 轻 链 CDR3。
4. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 重 链 可 变 区 ,
所 述 的 重 链 可 变 区 具 有 SEQ ID NO: 2 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。
5. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 轻 链 可 变 区 ,
所 述 的 轻 链 可 变 区 具 有 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。
6. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 重 链 可 变 区 和
轻 链 可 变 区 , 其 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 分 别 具 有 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO:
4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。
7. 如 权 利 要 求 6 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 抗 体 的 重 链 恒 定 区 和
或 轻 链 恒 定 区 , 所 述 抗 体 的 重 链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 18 的 氨 基 酸 序 列 ; 或 轻
链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 20 的 氨 基 酸 序 列 。
8. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 结 合 分 子 是
人 单 克 隆 抗 体 。
9. 编 码 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分 子 的 核 酸 分 子 。
10. 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 用 于 诊 断 、 治 疗 和 / 或 预 防 流
感 病 毒 所 致 的 流 感 感 染 的 药 物 中 的 用 途 。
11. 如 权 利 要 求 10 所 述 的 用 途 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 流 感 病 毒 的 毒 株 选 自
如 下 一 组 :H1N1、H3N2、H5N1、H7N1 和 H9N2。
12. 一 种 表 达 载 体 , 其 特 征 在 于 , 所 述 表 达 载 体 中 含 有 编 码 权 利 要 求 1-8 任
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一 所 述 的 结 合 分 子 的 DNA。
13. 一 种 宿 主 细 胞 , 其 特 征 在 于 , 所 述 宿 主 细 胞 中 含 有 权 利 要 求 12 所 述 的
表 达 载 体 。
14. 一 种 组 合 物 , 其 特 征 在 于 , 它 含 有 有 效 量 的 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 单
克 隆 抗 体 , 以 及 药 学 上 可 接 受 的 载 体 。
15. 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 盒 , 其 包 括 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分
子 。
16. 一 种 抑 制 流 感 病 毒 的 方 法 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 方 法 包 括 给 予 患 者 有
效 量 的 权 利 要 求 1-8 所 述 的 结 合 分 子 。
17. 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 方 法 , 其 特 征 在 于 , 利 用 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述
的 结 合 分 子 与 待 测 样 品 进 行 接 触 , 通 过 检 测 所 述 的 结 合 分 子 与 受 试 样 品 的 结 合
情 况 , 获 得 流 感 病 毒 的 存 在 情 况 以 及 存 在 量 。
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说 明 书
一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子
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技 术 领 域
本 发 明 属 于 生 物 技 术 领 域 ; 更 具 体 地 , 本 发 明 涉 及 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中
和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗 体 。
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背 景 技 术
自 2009 年 4 月 起 , 甲 型 H1N1 流 感 (A/H1N) 疫 情 在 世 界 范 围 内 爆 发 。 这 一 疫
情 从 北 美 迅 速 传 播 扩 散 到 5 大 洲 200 多 个 国 家 和 地 区 。 据 世 界 卫 生 组 织 报 道 , 截
止 2010 年 4 月 9 日 , 甲 型 A/H1N1 流 感 疫 情 已 在 超 过 213 个 国 家 爆 发 , 全 球 甲 型
H1N1 流 感 死 亡 病 例 已 超 过 1.77 万 例 。 在 我 国 , 据 中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 报 道 ,
截 至 2010 年 3 月 31 日 , 全 国 31 个 省 份 累 计 报 告 甲 型 H1N1 流 感 确 诊 病 例 12.7 万 余
人 , 已 治 愈 12.2 万 , 死 亡 800 例 。
流 感 病 毒 属 于 正 粘 病 毒 科 , 有 包 膜 , 呈 球 型 、 椭 圆 型 或 丝 状 , 病 毒 包 膜 来
自 宿 主 细 胞 的 双 层 类 脂 膜 。 流 感 病 毒 属 单 链 的 RNA 病 毒 。 根 据 核 蛋 白 (NP) 和 细
胞 质 蛋 白 (M1) 的 差 异 , 流 感 病 毒 可 分 为 A、B、C( 甲 、 乙 、 丙 ) 三 种 亚 型 。 对 A
型 流 感 病 毒 , 根 据 血 凝 素 (HA) 和 神 经 氨 酸 酶 (NA) 表 面 糖 蛋 白 抗 原 性 的 不 同 , 又
可 进 一 步 分 为 不 同 的 亚 型 。 目 前 ,A 型 流 感 病 毒 有 16 种 HA 亚 型 (H1–H16) 和 9 种
NA 亚 型 (N1–N9)。
A 型 流 感 病 毒 的 基 因 组 ( 见 图 1) 由 8 个 单 独 的 单 链 RNA 片 段 组 成 , 每 个 RNA
片 段 编 码 一 至 两 个 蛋 白 。 因 此 A 型 流 感 病 毒 共 有 8 个 基 因 , 编 码 10 种 蛋 白 。 其 中 ,
HA 蛋 白 对 于 结 合 细 胞 表 面 受 体 和 病 毒 与 细 胞 的 膜 融 合 起 重 要 作 用 , 在 感 染 细 胞
前 ,HA 会 水 解 成 HA1 和 HA2, 其 中 位 于 HA1 上 的 的 受 体 结 合 区 (receptor binding
domain,RBD) 的 附 近 区 域 , 在 不 同 流 感 病 毒 株 中 高 度 变 异 (RBD 本 身 比 较 保 守 ),
是 重 要 的 中 和 性 表 位 所 在 区 域 , 目 前 发 现 的 多 种 中 和 性 抗 体 所 针 对 的 表 位 大 多
位 于 HA1 蛋 白 的 RBD 附 近 区 域 。 但 是 这 些 抗 体 大 多 不 具 备 中 和 不 同 亚 型 或 同 一
亚 型 不 同 毒 株 流 感 病 毒 的 能 力 。NA 可 以 去 除 唾 液 酸 , 帮 助 子 代 病 毒 的 释 放 和 避
免 病 毒 自 身 的 聚 集 ;PA、PB1 和 PB2 三 种 聚 合 酶 以 及 NP 核 蛋 白 主 要 用 于 病 毒
RNA 的 复 制 和 转 录 ; 基 质 蛋 白 M1 负 责 核 外 输 送 ,M2 负 责 形 成 离 子 通 道 ; 非 结
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构 蛋 白 NS1 是 干 扰 素 的 抑 制 剂 ,NS2 负 责 核 外 输 送 。
目 前 , 国 家 许 可 用 于 治 疗 流 感 的 药 物 主 要 为 以 下 两 大 类 :1) 烷 胺 类 ( 金 刚 烷
胺 和 金 刚 乙 胺 );2) 流 感 病 毒 神 经 氨 酸 酶 抑 制 剂 ( 奥 司 他 韦 和 扎 那 米 韦 )。 对 烷 胺
类 药 物 , 已 出 现 大 量 的 耐 药 性 流 感 毒 株 , 因 此 目 前 世 界 卫 生 组 织 不 建 议 使 用 烷
胺 类 药 物 作 为 治 疗 流 感 的 药 物 ; 目 前 大 部 分 流 感 病 毒 ( 包 括 甲 型 H1N1 流 感 ) 仍 对
奥 司 他 韦 和 扎 那 米 韦 敏 感 , 但 在 日 本 等 地 区 也 已 经 出 现 耐 药 性 毒 株 , 耐 药 性 毒
株 的 出 现 限 制 了 这 些 化 学 小 分 子 药 物 的 大 规 模 使 用 。
治 疗 性 抗 体 用 于 流 感 的 等 病 毒 感 染 性 疾 病 的 治 疗 早 有 报 道 , 抗 血 清 用 于 治
疗 SARS 和 重 症 H5N1 禽 流 感 病 毒 感 染 者 的 案 例 已 经 证 明 了 抗 体 在 治 疗 病 毒 感 染
中 发 挥 的 重 要 作 用 。 具 有 广 谱 中 和 活 性 的 抗 流 感 病 毒 的 治 疗 性 抗 体 具 有 以 下 潜
在 优 势 , 一 方 面 它 可 以 阻 断 病 毒 与 靶 细 胞 的 结 合 , 另 一 方 面 通 过 补 体 和 T 细 胞 、
NK 细 胞 等 效 应 细 胞 的 作 用 , 将 被 病 毒 感 染 的 细 胞 杀 死 。1986 年 , 第 一 株 治 疗 器
官 移 植 出 现 的 排 斥 反 应 的 鼠 单 抗 —— 莫 罗 单 抗 -CD3 (murmonabCD3,hoclone
OKT3) 获 得 美 国 FDA 批 准 上 市 , 但 由 于 其 在 人 体 内 会 产 生 人 抗 鼠 抗 体 (HAMA)
反 应 , 限 制 了 应 用 。
因 此 , 需 要 进 一 步 开 发 出 亲 和 性 良 好 且 副 作 用 低 的 治 疗 性 抗 体 , 如 人 源 化
或 全 人 源 的 抗 体 , 以 满 足 临 床 治 疗 的 需 求 。
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发 明 内 容
本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 全 人 单 克 隆 抗 体 及 其
应 用 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血
凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 8 所 示 重 链
CDR1 区 、SEQ ID NO: 9 所 示 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 重 链 CDR3 区 。
在 本 发 明 的 另 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感
血 凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 14 所 示 轻
链 CDR1 区 、SEQ ID NO:15 所 示 轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 轻 链 CDR3 区 。
在 本 发 明 的 另 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感
血 凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 以 下 的 氨 基 酸 序 列 :
SEQ ID NO: 8 所 示 的 重 链 CDR1,SEQ ID NO: 9 所 示 的 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO:
10 所 示 的 重 链 CDR3,SEQ ID NO: 14 所 示 的 轻 链 CDR1、SEQ ID NO: 15 所 示 的
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轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 的 轻 链 CDR3。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 重 链 可 变 区 , 所 述 的 重 链 可 变 区 具
有 SEQ ID NO: 2 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 轻 链 可 变 区 , 所 述 的 轻 链 可 变 区 具
有 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 , 其 重 链
可 变 区 和 轻 链 可 变 区 分 别 具 有 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序
列 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 抗 体 的 重 链 恒 定 区 和 或 轻 链 恒 定
区 , 所 述 抗 体 的 重 链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 18 的 氨 基 酸 序 列 ; 或 轻 链 恒 定 区 具
有 SEQ ID NO: 20 的 氨 基 酸 序 列 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 是 人 单 克 隆 抗 体 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 单 克 隆 抗 体 识 别 流 感 病 毒 HA 蛋 白 上 空 间 构 象 的
表 位 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 编 码 所 述 的 结 合 分 子 的 核 酸 分 子 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 用 于 诊 断 、 治 疗 和 / 或 预
防 流 感 病 毒 所 致 的 流 感 感 染 的 药 物 中 的 用 途 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 流 感 病 毒 的 毒 株 选 自 如 下 一 组 :H1N1、H3N2、
H5N1、H7N1 和 H9N2。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 表 达 载 体 , 所 述 表 达 载 体 中 含 有 编 码 所 述
的 结 合 分 子 的 DNA。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 宿 主 细 胞 , 所 述 宿 主 细 胞 中 含 有 所 述 的 表
达 载 体 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 组 合 物 , 它 含 有 有 效 量 的 所 述 的 单 克 隆 抗
体 , 以 及 药 学 上 可 接 受 的 载 体 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 盒 , 其 包 括 所 述 的 结
合 分 子 。
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 试 剂 盒 还 包 括 : 抗 原 或 抗 体 包 被 用 试 剂 , 洗 涤 试
剂 , 第 二 抗 体 , 标 记 物 ( 如 辣 根 过 氧 化 物 酶 、 碱 性 磷 酸 酯 酶 、 葡 萄 糖 氧 化 酶 、β –
D - 半 乳 糖 苷 酶 、 脲 酶 、 过 氧 化 氢 酶 、 或 葡 萄 糖 淀 粉 酶 ), 显 色 剂 酶 底 物 等 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 ( 优 选 非 治 疗 性 地 ) 抑 制 流 感 病 毒 的 方 法 ,
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所 述 的 方 法 包 括 给 予 患 者 有 效 量 的 所 述 的 结 合 分 子 。
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 ( 优 选 非 诊 断 性 地 ) 检 测 流 感 病 毒 的 方 法 ,
利 用 所 述 的 结 合 分 子 与 待 测 样 品 进 行 接 触 , 通 过 检 测 所 述 的 结 合 分 子 与 受 试 样
品 的 结 合 情 况 , 获 得 流 感 病 毒 的 存 在 情 况 以 及 存 在 量 。
本 发 明 的 其 它 方 面 由 于 本 文 的 公 开 内 容 , 对 本 领 域 的 技 术 人 员 而 言 是 显 而
易 见 的 。
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附 图 说 明
图 1、A 型 流 感 病 毒 的 基 因 组 示 意 图 。
图 2、β-actin 内 参 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。
图 3、 重 链 基 因 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。
图 4、 轻 链 基 因 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。
图 5、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 浓 度 。
图 6、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 识 别 HA/HA1 蛋 白 。
图 7、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 识 别 流 感 病 毒 的 广 谱 性 。
图 8、 不 同 浓 度 3E1 对 H1 流 感 病 毒 中 和 活 性 。A:A/California/7/2009 (H1N1);
B:NYMCX-179A;C:A/Brisbane/59/2007 (H1N1);D:A/Puerto Rico/8/34
(H1N1)。
图 9、3E1 广 谱 中 和 活 性 。A: A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2);B:
A/Anhui/1/2005 (H5N1) ; C : A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1) ; D :
A/Guangzhou/333/1999 (H9N2)。
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具 体 实 施 方 式
本 发 明 人 经 过 广 泛 而 深 入 的 研 究 , 获 得 一 种 含 有 独 特 的 CDR 区 的 抗 流 感
病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗 体 , 该 结 合 分 子 对 于 流 感 病 毒
具 有 广 谱 中 和 作 用 。 在 此 基 础 上 完 成 了 本 发 明 。
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结 合 分 子
本 发 明 提 供 了 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 结 合 分 子 。 优 选 地 , 所 述 结 合 分 子
是 人 结 合 分 子 。 优 选 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 呈 现 对 于 流 感 病 毒 的 中 和 活 性 。
本 发 明 的 结 合 分 子 也 可 以 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 一 或 多 个 片 段 。 对 于 治 疗
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和 / 或 预 防 流 感 病 毒 的 方 法 而 言 , 所 述 结 合 分 子 优 选 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 表
面 可 及 蛋 白 质 如 为 病 毒 附 着 和 细 胞 释 放 所 必 需 的 表 面 糖 蛋 白 血 凝 素 (HA) 和 神
经 氨 酸 酶 (NA) 或 者 膜 蛋 白 (M1 和 M2)。 在 特 定 的 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 结 合 分
子 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 HA2 分 子 。
为 了 诊 断 目 的 , 结 合 分 子 也 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 表 面 上 不 存 在 的 蛋 白
质 , 包 括 核 蛋 白 、 核 壳 结 构 蛋 白 、 聚 合 酶 (PA,PB 和 PB2) 以 及 非 结 构 蛋 白 (NS 1
和 NS2)。 各 种 H5N1 毒 株 的 核 苷 酸 序 列 和 / 或 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 可 见 于
GenBank 数 据 库 、NCBI 流 感 病 毒 序 列 数 据 库 、 流 感 病 毒 序 列 数 据 库 (ISD)。EMBL
数 据 库 和 / 或 其 它 数 据 库 。 本 领 域 技 术 人 员 易 于 在 各 自 的 数 据 库 中 发 现 这 种 序
列 。
本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 是 完 整 的 免 疫 球 蛋 白 分 子 例 如 多 克 隆 或 单 克 隆 抗
体 或 者 所 述 结 合 分 子 可 以 是 抗 原 结 合 片 段 , 包 括 但 不 限 于 Fab、F(ab')、F(ab') 2 、
Fv、dAb、Fd、 互 补 决 定 区 (CDR) 片 段 、 单 链 抗 体 (scFv)、 二 价 单 链 抗 体 、 单 链
噬 菌 体 抗 体 、 双 特 异 双 链 抗 体 、 三 链 抗 体 、 四 链 抗 体 以 及 至 少 含 有 足 以 赋 予 与
流 感 病 毒 毒 株 的 特 异 性 抗 原 结 合 的 免 疫 球 蛋 白 的 片 段 的 ( 多 ) 肤 或 其 片 段 。 在 优
选 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 结 合 分 子 是 人 单 克 隆 抗 体 。
本 发 明 还 提 供 了 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 诊 断 、 预 防 和 / 或 治 疗 流 感 病 毒 感 染
的 药 物 中 的 应 用 。 这 种 感 染 可 以 在 小 群 体 中 发 生 , 但 是 也 可 以 以 季 节 流 行 病 方
式 在 世 界 范 围 传 播 , 或 者 更 严 重 地 在 全 球 蔓 延 , 数 百 万 个 体 处 于 危 险 之 中 。 本
发 明 提 供 了 可 以 中 和 导 致 这 种 季 节 流 行 病 以 及 潜 在 的 全 球 性 流 行 病 的 流 感 病
毒 毒 株 的 感 染 的 结 合 分 子 。 重 要 的 是 , 目 前 可 以 预 期 利 用 本 发 明 的 结 合 分 子 对
于 多 种 流 感 病 毒 毒 株 起 到 防 护 和 治 疗 作 用 , 因 为 己 经 揭 示 了 由 于 与 在 不 同 流 感
病 毒 毒 株 的 HA 蛋 白 之 间 共 享 的 表 位 的 结 合 , 因 此 目 前 可 以 使 用 本 发 明 的 结 合 分
子 在 这 些 毒 株 之 间 进 行 交 叉 中 和 作 用 。 这 是 特 别 有 利 的 , 因 为 在 感 染 之 前 或 者
之 后 给 予 所 述 结 合 分 子 可 以 保 护 哺 乳 动 物 , 因 此 在 还 不 清 楚 所 述 感 染 是 否 由 基
于 H1、H3、H5、H7 或 H9 的 毒 株 的 引 起 时 ( 在 发 病 的 早 期 阶 段 ) 也 起 到 如 此 作 用 。
可 以 使 用 本 发 明 的 结 合 分 子 预 防 性 治 疗 或 者 感 染 时 治 疗 健 康 工 人 、 军 人 以 及 普
通 人 群 。 潜 在 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 大 规 模 地 制 备 和 贮 存 , 因 为 其 提 供 了
针 对 不 同 的 流 行 性 毒 株 的 保 护 作 用 , 且 对 于 为 将 来 可 能 发 生 的 流 感 爆 发 做 准 备
是 有 利 的 。
根 据 Kabat et al. (1991) 所 述 ,CDR 区 是 免 疫 学 感 兴 趣 的 蛋 白 质 的 序 列 。 在
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本 发 明 的 实 施 方 案 中 , 结 合 分 子 可 包 含 本 文 揭 示 的 二 、 三 、 四 、 五 或 者 所 有 六
个 CDR 区 。 优 选 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 包 含 本 文 揭 示 的 至 少 两 个 CDR。
本 发 明 的 另 一 方 面 包 括 本 文 所 述 结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 如 果 变 体 能 与 亲 代
结 合 分 子 竞 争 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 或 其 蛋 白 片 段 , 则 认 为 该 变 体 分 子 是 本 发 明
结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 换 句 话 说 , 所 述 功 能 变 体 仍 能 结 合 流 感 病 毒 或 其 片 段 。
优 选 地 , 所 述 功 能 变 体 能 竞 争 性 特 异 性 结 合 由 亲 代 结 合 分 子 特 异 性 结 合 的 至 少
两 ( 或 更 多 个 ) 不 同 的 流 感 病 毒 毒 株 或 其 片 段 。 此 外 , 如 果 某 分 子 对 于 亲 代 结 合
分 子 对 其 具 有 中 和 活 性 的 流 感 病 毒 、 优 选 对 于 至 少 两 ( 或 多 个 ) 流 感 病 毒 毒 株 具
有 中 和 活 性 , 则 认 为 该 分 子 是 本 发 明 结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 功 能 变 体 包 括 但 不
限 于 一 级 结 构 序 列 基 本 相 似 、 但 是 含 有 例 如 在 亲 代 结 合 分 子 中 未 发 现 的 体 外 或
体 内 化 学 和 / 或 生 物 化 学 修 饰 的 衍 生 物 。 这 种 修 饰 包 括 乙 酞 化 、 酞 化 、 核 苷 酸 或
者 核 苷 酸 衍 生 物 的 共 价 附 着 、 脂 质 或 者 脂 质 衍 生 物 的 共 价 附 着 、 交 联 、 二 硫 键
形 成 、 糖 基 化 、 羟 基 化 、 甲 基 化 、 氧 化 、 聚 乙 二 醇 化 、 蛋 白 酶 解 加 工 、 磷 酸 化
等 。 换 句 话 说 , 亲 代 结 合 分 子 的 氨 基 酸 和 / 或 核 苷 酸 序 列 中 的 修 饰 不 显 著 影 响 或
改 变 由 所 述 核 苷 酸 序 列 编 码 的 或 者 含 有 所 述 氨 基 酸 序 列 的 所 述 结 合 分 子 的 结
合 特 性 , 即 所 述 结 合 分 子 仍 能 识 别 并 结 合 其 靶 位 。
所 述 功 能 变 体 可 以 具 有 保 守 序 列 修 饰 , 包 括 核 苷 酸 和 氨 基 酸 取 代 、 添 加 和
缺 失 。 这 些 修 饰 可 以 通 过 本 领 域 己 知 的 标 准 技 术 导 入 , 例 如 定 向 诱 变 和 随 机 PCR
介 导 的 诱 变 , 并 且 可 包 含 天 然 以 及 非 天 然 核 苷 酸 和 氨 基 酸 。
保 守 氨 基 酸 取 代 包 括 其 中 氨 基 酸 残 基 由 具 有 相 似 结 构 或 者 化 学 性 质 的 另
一 氨 基 酸 残 基 置 换 的 取 代 。 具 有 相 似 侧 链 的 氨 基 酸 残 基 的 家 族 己 经 在 本 领 域 中
限 定 。 这 些 家 族 包 括 具 有 碱 性 侧 链 的 氨 基 酸 ( 例 如 赖 氨 酸 、 精 氨 酸 、 组 氨 酸 )、
酸 性 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 天 冬 氨 酸 、 谷 氨 酸 )、 无 电 荷 极 性 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 天 冬 酞
胺 、 谷 氨 酞 胺 、 丝 氨 酸 、 苏 氨 酸 、 酪 氨 酸 、 半 肤 氨 酸 、 色 氨 酸 )、 非 极 性 侧 链 氨
基 酸 ( 例 如 甘 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 缬 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 异 亮 氨 酸 、 脯 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、
甲 硫 氨 酸 )、 分 支 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 苏 氨 酸 、 缬 氨 酸 、 异 亮 氨 酸 ) 以 及 芳 香 侧 链 氨
基 酸 ( 例 如 酪 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 )。 本 领 域 技 术 人 员 明 白 也 可 以 使 用 除 了
上 述 家 族 之 外 的 其 它 氨 基 酸 残 基 家 族 分 类 方 式 。 另 外 , 变 体 可 具 有 非 保 守 的 氨
基 酸 取 代 , 例 如 氨 基 酸 由 具 有 不 同 结 构 或 者 化 学 性 质 的 另 一 氨 基 酸 残 基 置 换 。
相 似 的 小 变 异 也 可 包 括 氨 基 酸 缺 失 或 者 插 入 , 或 者 这 二 者 。 使 用 本 领 域 熟 知 的
计 算 机 程 序 可 以 发 现 确 定 哪 些 氨 基 酸 残 基 可 以 被 取 代 、 插 入 或 者 缺 失 而 不 消 除
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免 疫 学 活 性 的 指 导 。
此 外 , 功 能 变 体 可 包 含 氨 基 酸 序 列 在 氨 基 末 端 或 者 羧 基 末 端 或 者 这 两 端 的
截 短 体 。 本 发 明 的 功 能 变 体 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 可 具 有 相 同 或 不 同 的 、 更 高 或
更 低 的 结 合 亲 和 性 , 但 是 仍 能 结 合 流 感 病 毒 或 其 片 段 。 例 如 , 本 发 明 的 功 能 变
体 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 对 于 流 感 病 毒 H5N1 或 其 片 段 可 具 有 增 加 或 降 低 的 结 合
亲 和 性 。 优 选 地 , 可 变 区 包 括 但 不 限 于 构 架 区 、 高 变 区 、 特 别 是 CDR3 区 的 氨
基 酸 序 列 被 修 饰 。 通 常 , 轻 链 和 重 链 可 变 区 包 含 三 个 高 变 区 , 包 括 三 个 CDR,
以 及 更 保 守 的 区 域 , 即 所 谓 的 构 架 区 ((FR)。 高 变 区 包 含 来 自 CDR 的 氨 基 酸 残 基
和 来 自 高 变 环 的 氨 基 酸 残 基 。 在 本 发 明 范 围 内 的 功 能 变 体 与 本 文 所 述 亲 代 结 合
分 子 具 有 至 少 大 约 50% 至 大 约 99%、 优 选 至 少 大 约 60% 至 大 约 99%、 更 优 选 至 少
大 约 70% 至 大 约 99%、 甚 至 更 优 选 至 少 大 约 80% 至 大 约 99%、 最 优 选 至 少 大 约
90% 至 大 约 99%、 特 别 是 至 少 大 约 95% 至 大 约 99%, 以 及 特 别 是 至 少 大 约 97% 至
大 约 99% 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 。 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 计 算 机 算 法 如 Gap 或 者
Bestfit 可 用 于 最 佳 地 排 列 氨 基 酸 序 列 以 进 行 对 比 以 及 明 确 相 似 或 相 同 的 氨 基 酸
残 基 。 功 能 变 体 可 以 通 过 使 用 本 领 域 己 知 的 普 通 分 子 生 物 学 方 法 改 变 亲 代 结 合
分 子 或 其 一 部 分 而 获 得 , 所 述 方 法 包 括 但 不 限 于 易 错 PCR、 寡 核 苷 酸 指 导 的 诱
变 、 定 点 诱 变 以 及 重 链 和 / 或 轻 链 改 组 法 。 在 一 个 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 功 能 变
体 对 于 流 感 病 毒 具 有 中 和 活 性 。 所 述 中 和 活 性 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 可 以 相 同 或
者 更 高 或 更 低 。 此 后 , 当 使 用 术 语 ( 人 ) 结 合 分 子 时 , 其 也 涵 盖 所 述 ( 人 ) 结 合 分 子
的 功 能 变 体 。
作 为 本 发 明 的 优 选 方 式 , 所 述 的 结 合 分 子 是 单 克 隆 抗 体 , 优 选 它 包 括 人 源
的 恒 定 区 ( 如 人 源 恒 定 区 IgH 序 列 和 IgKappa 序 列 )。 所 述 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗
体 的 重 链 可 变 区 、 轻 链 可 变 区 以 及 位 于 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 的 互 补 决 定 区
(CDR) 均 具 有 独 特 的 不 同 于 现 有 技 术 的 结 构 , 且 它 们 是 全 人 源 的 。
本 发 明 包 括 : 具 有 所 述 单 克 隆 抗 体 的 相 应 氨 基 酸 序 列 的 单 克 隆 抗 体 , 具 有
所 述 单 克 隆 抗 体 可 变 区 链 的 单 克 隆 抗 体 。 本 发 明 还 包 括 具 有 含 所 述 的 互 补 决 定
区 (CDR) 的 轻 链 和 重 链 的 任 何 抗 体 , 以 及 CDR 区 与 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 的 CDR
具 有 90% 以 上 ( 较 佳 地 95% 以 上 ) 的 同 源 性 的 任 何 抗 体 。
抗 体 的 抗 原 结 合 特 性 可 由 位 于 重 链 和 轻 链 可 变 区 的 3 个 特 定 的 区 域 来 描
述 , 称 为 互 补 决 定 区 (complementarity determining region,CDR), 所 述 的 CDR
区 将 可 变 区 间 隔 成 4 个 框 架 区 域 (FR),4 个 FR 的 氨 基 酸 序 列 相 对 比 较 保 守 , 不 直
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接 参 与 结 合 反 应 。 这 些 CDR 形 成 环 状 结 构 , 通 过 其 间 的 FR 形 成 的 β 折 叠 在 空 间
结 构 上 相 互 靠 近 , 重 链 上 的 CDR 和 相 应 轻 链 上 的 CDR 构 成 了 抗 体 的 抗 原 结 合 位
点 。 可 以 通 过 比 较 同 类 型 的 抗 体 的 氨 基 酸 序 列 来 确 定 是 哪 些 氨 基 酸 构 成 了 FR 或
CDR 区 域 。
对 于 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 重 链 和 轻 链 序 列 , 可 以 用 常 规 方 法 测 定 。
经 验 证 , 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 CDR 区 是 全 新 的 , 其 针 对 的
是 一 个 独 特 的 流 感 病 毒 HA 蛋 白 上 的 抗 原 表 位 , 技 术 构 思 不 同 于 现 有 的 抗 流 感
病 毒 抗 体 。 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 所 识 别 的 表 位 是 位 于 其 空 间 构 象 上
的 表 位 。
本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 是 全 人 源 的 , 其 重 链 、 轻 链 可 变 区 以 及 恒 定 区 均 来 源
于 人 抗 体 。 因 此 , 其 在 具 有 特 别 优 异 的 识 别 和 中 和 流 感 病 毒 的 作 用 的 同 时 , 还
具 有 免 疫 原 性 低 、 安 全 性 高 的 特 点 。
在 本 发 明 的 实 施 例 中 , 本 发 明 人 从 接 种 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 裂 解 疫 苗
(2009/Cal) 志 愿 者 体 内 获 得 外 周 血 单 个 核 细 胞 (PBMC), 使 用 CD19 + /IgG + /HA 为
特 异 性 标 志 物 , 经 流 式 细 胞 仪 分 选 (FACS) 获 得 识 别 HA 蛋 白 特 异 性 B 细 胞 。 使 用
单 细 胞 RT-PCR 技 术 (Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124), 获
得 了 抗 体 基 因 并 在 293T 细 胞 中 进 行 表 达 获 得 全 人 单 克 隆 抗 体 3C4。ELISA 表 位
分 析 得 知 这 株 抗 体 识 别 血 凝 素 HA 蛋 白 的 HA2 亚 基 ,HA2 在 不 同 种 属 流 感 病 毒 中
具 有 保 守 性 , 表 明 这 株 抗 体 可 能 的 识 别 广 谱 性 。 微 中 和 实 验 证 明 此 抗 体 能 够 中
和 A/California/7/2009 (H1N1),NYMCX-179A,A/Brisbane/59/2007 (H1N1),
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2),A/Anhui/1/2005
(H5N1),A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1),A/Guangzhou/333/1999 (H9N2) 流 感
病 毒 , 表 明 此 株 抗 体 具 有 广 谱 中 和 活 性 , 在 临 床 上 具 有 预 防 和 治 疗 多 种 亚 型 流
感 病 毒 感 染 的 潜 在 价 值 。
另 一 方 面 , 本 发 明 包 括 免 疫 缀 合 物 , 即 包 含 本 文 所 述 至 少 一 个 结 合 分 子 以
及 进 一 步 包 含 至 少 一 个 标 记 如 可 检 测 的 部 分 / 物 质 的 分 子 。 本 发 明 还 涉 及 本 发 明
免 疫 缀 合 物 的 混 合 物 或 者 至 少 一 种 本 发 明 免 疫 缀 合 物 与 另 一 分 子 的 混 合 物 , 所
述 另 一 分 子 如 治 疗 剂 或 者 另 一 结 合 分 子 或 免 疫 缀 合 物 。 本 发 明 的 免 疫 缀 合 物 可
包 含 一 个 以 上 的 标 记 。 这 些 标 记 可 以 彼 此 相 同 或 不 同 , 并 且 可 以 与 结 合 分 子 非
共 价 地 结 合 / 缀 合 。 所 述 标 记 也 可 以 通 过 共 价 键 与 人 结 合 分 子 直 接 结 合 / 缀 合 。
或 者 , 所 述 标 记 可 以 通 过 一 或 多 种 连 接 化 合 物 与 所 述 结 合 分 子 结 合 / 缀 合 。 标 记
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与 结 合 分 子 的 缀 合 技 术 为 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 。
本 发 明 的 免 疫 缀 合 物 的 标 记 可 以 是 治 疗 剂 , 但 是 它 们 也 可 以 是 可 检 测 的 部
分 / 物 质 。 适 于 治 疗 和 / 或 预 防 的 标 记 可 以 是 毒 素 或 者 其 功 能 部 分 、 抗 生 素 、 酶 、
增 强 吞 噬 作 用 或 者 免 疫 刺 激 作 用 的 其 它 结 合 分 子 。 包 含 可 检 测 物 质 的 免 疫 缀 合
物 可 诊 断 性 地 用 于 例 如 评 定 对 象 是 否 己 经 感 染 流 感 病 毒 毒 株 或 者 作 为 临 床 实
验 程 序 的 一 部 分 监 测 流 感 病 毒 感 染 的 发 生 或 进 展 以 例 如 确 定 指 定 治 疗 方 案 的
功 效 。 然 而 , 它 们 也 可 以 用 于 其 它 检 测 和 / 或 分 析 和 / 或 诊 断 目 的 。 可 检 测 的 部
分 / 物 质 包 括 但 不 限 于 酶 、 辅 基 、 荧 光 材 料 、 发 光 材 料 , 生 物 发 光 材 料 、 放 射 性
材 料 、 正 电 子 发 射 金 属 以 及 非 放 射 性 顺 磁 性 金 属 离 子 。 为 了 检 测 和 / 或 分 析 和 /
或 诊 断 目 的 用 于 标 记 结 合 分 子 的 标 记 依 赖 于 使 用 的 特 定 检 测 / 分 析 / 诊 断 技 术 和 /
或 方 法 例 如 免 疫 组 织 化 学 染 色 ( 组 织 ) 样 品 、 流 式 细 胞 计 量 术 、 激 光 扫 描 细 胞 计
量 术 检 测 、 荧 光 免 疫 测 定 、 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (ELISA)、 放 射 免 疫 测 定 (RIA)、
生 物 测 定 ( 例 如 吞 噬 作 用 测 定 )、 蛋 白 质 印 迹 应 用 等 。 对 于 本 领 域 已 知 的 检 测 / 分
析 / 诊 断 技 术 和 / 或 方 法 合 适 的 标 记 为 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 。
此 外 , 本 发 明 的 人 结 合 分 子 或 者 免 疫 缀 合 物 也 可 以 附 着 于 固 体 支 持 物 上 ,
其 特 别 用 于 流 感 病 毒 HA 蛋 白 或 其 片 段 的 体 外 免 疫 测 定 或 者 纯 化 。 这 种 固 体 支 持
物 可 以 是 多 孔 或 者 无 孔 的 、 平 面 或 非 平 面 的 。 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 与 标 记 序
列 如 肤 融 合 以 便 于 纯 化 。 所 述 标 记 序 列 的 例 子 包 括 但 不 限 于 六 组 氨 酸 标 记 、 血
凝 素 (HA) 标 记 、myc 标 记 或 者 flag 标 记 。 或 者 , 一 种 抗 体 可 以 与 另 一 种 抗 体 缀 合
形 成 抗 体 异 源 缀 合 物 (heteroconjugate)。
另 一 方 面 , 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 与 一 或 多 个 抗 原 缀 合 / 附 着 。 优 选 地 , 这
些 抗 原 是 由 给 予 了 结 合 分 子 - 抗 原 缀 合 物 的 对 象 的 免 疫 系 统 识 别 的 抗 原 。 所 述 抗
原 可 以 彼 此 相 同 , 但 也 可 以 是 不 同 的 。 使 附 着 抗 原 和 结 合 分 子 的 缀 合 方 法 为 本
领 域 所 熟 知 , 包 括 但 不 限 于 使 用 交 联 剂 。 本 发 明 的 结 合 分 子 结 合 流 感 病 毒 并 且
附 着 于 结 合 分 子 的 抗 原 将 引 发 对 于 所 述 缀 合 物 的 有 力 T 细 胞 攻 击 , 最 终 导 致 流
感 病 毒 的 破 坏 。
除 了 通 过 直 接 或 间 接 ( 例 如 通 过 接 头 ) 缀 合 而 化 学 产 生 免 疫 缀 合 物 之 外 , 所
述 免 疫 缀 合 物 可 以 作 为 融 合 蛋 白 而 产 生 , 所 述 融 合 蛋 白 包 含 本 发 明 的 结 合 分 子
及 合 适 的 标 记 。 融 合 蛋 白 可 以 通 过 本 领 域 已 知 方 法 产 生 , 例 如 通 过 构 建 核 酸 分
子 以 及 随 后 表 达 所 述 核 酸 分 子 而 重 组 产 生 , 所 述 核 酸 分 子 包 含 符 合 读 框 的 编 码
结 合 分 子 的 核 苷 酸 序 列 以 及 编 码 合 适 标 记 的 核 苷 酸 序 列 。
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本 发 明 另 一 方 面 提 供 了 编 码 本 发 明 的 至 少 一 种 结 合 分 子 、 其 功 能 变 体 或 者
免 疫 缀 合 物 的 核 酸 分 子 。 这 种 核 酸 分 子 可 以 用 作 中 间 物 以 进 行 克 隆 , 例 如 用 于
如 上 述 的 亲 和 力 成 熟 方 法 中 。 在 一 个 优 选 的 实 施 方 案 中 , 所 述 核 酸 分 子 是 分 离
或 纯 化 的 。DNA 分 子 的 序 列 可 以 用 常 规 技 术 , 或 利 用 杂 交 瘤 技 术 获 得 。
本 领 域 技 术 人 员 将 意 识 到 这 些 核 酸 分 子 的 功 能 变 体 也 是 本 发 明 的 一 部 分 。
功 能 变 体 是 这 样 的 核 酸 序 列 , 通 过 使 用 标 准 遗 传 密 码 可 以 将 其 直 接 翻 译 以 提 供
与 从 亲 代 核 酸 分 子 中 翻 译 的 序 列 相 同 的 氨 基 酸 序 列 。
一 旦 获 得 了 有 关 的 序 列 , 就 可 以 用 重 组 法 来 大 批 量 地 获 得 有 关 序 列 。 这 通
常 是 将 其 克 隆 入 载 体 , 再 转 入 细 胞 , 然 后 通 过 常 规 方 法 从 增 殖 后 的 宿 主 细 胞 中
分 离 得 到 有 关 序 列 。
此 外 , 还 可 用 人 工 合 成 的 方 法 来 合 成 有 关 序 列 , 尤 其 是 片 段 长 度 较 短 时 。
通 常 , 通 过 先 合 成 多 个 小 片 段 , 然 后 再 进 行 连 接 可 获 得 序 列 很 长 的 片 段 。
目 前 , 已 经 可 以 完 全 通 过 化 学 合 成 来 得 到 编 码 本 发 明 的 结 合 分 子 ( 或 其 片
段 , 或 其 衍 生 物 ) 的 DNA 序 列 。 然 后 可 将 该 DNA 序 列 引 入 本 领 域 中 已 知 的 各 种
现 有 的 DNA 分 子 ( 或 如 载 体 ) 和 细 胞 中 。 此 外 , 还 可 通 过 化 学 合 成 将 突 变 引 入 本
发 明 的 结 合 分 子 的 序 列 中 。
本 发 明 还 涉 及 包 含 上 述 的 适 当 DNA 序 列 以 及 适 当 启 动 子 或 者 控 制 序 列 的
载 体 。 这 些 载 体 可 以 用 于 转 化 适 当 的 宿 主 细 胞 , 以 使 其 能 够 表 达 蛋 白 质 。 优 选
的 , 本 发 明 的 载 体 是 例 如 含 病 毒 启 动 子 的 质 粒 表 达 载 体 , 且 在 所 述 表 达 载 体 中
分 别 插 入 了 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 重 链 可 变 区 (VH) 与 恒 定 区 的 IgH( 来 自 人 源
IgH 的 恒 定 区 ) 融 合 序 列 和 轻 链 可 变 区 VL 与 人 体 Igkappa ( 来 自 人 源 Igkappa 的 恒
定 区 ) 融 合 序 列 。
宿 主 细 胞 可 以 是 原 核 细 胞 , 如 细 菌 细 胞 ; 或 是 低 等 真 核 细 胞 , 如 酵 母 细 胞 ;
或 是 高 等 真 核 细 胞 , 如 哺 乳 动 物 细 胞 。 代 表 性 例 子 有 : 细 菌 细 胞 如 大 肠 杆 菌 ,
链 霉 菌 属 ; 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 ; 真 菌 细 胞 如 酵 母 ; 植 物 细 胞 ; 昆 虫 细 胞 如 果 蝇 S2
或 Sf9; 动 物 细 胞 如 CHO、COS7、NSO 或 Bowes 黑 素 瘤 细 胞 等 。 特 别 适 用 于 本
发 明 的 宿 主 细 胞 是 真 核 宿 主 细 胞 , 尤 其 是 哺 乳 动 物 细 胞 , 如 293 细 胞 。
用 重 组 DNA 转 化 宿 主 细 胞 可 用 本 领 域 技 术 人 员 熟 知 的 常 规 技 术 进 行 。 当 宿
主 为 原 核 生 物 如 大 肠 杆 菌 时 , 能 吸 收 DNA 的 感 受 态 细 胞 可 在 指 数 生 长 期 后 收
获 , 用 CaCl 2 法 处 理 , 所 用 的 步 骤 在 本 领 域 众 所 周 知 。 另 一 种 方 法 是 使 用 MgCl 2 。
如 果 需 要 , 转 化 也 可 用 电 穿 孔 的 方 法 进 行 。 当 宿 主 是 真 核 生 物 , 可 选 用 如 下 的
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DNA 转 染 方 法 : 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 , 或 常 规 机 械 方 法 如 显 微 注 射 、 电 穿 孔 、 脂 质
体 包 装 等 。
获 得 的 转 化 子 可 以 用 常 规 方 法 培 养 , 表 达 本 发 明 的 结 合 分 子 。 根 据 所 用 的
宿 主 细 胞 , 培 养 中 所 用 的 培 养 基 可 选 自 各 种 常 规 培 养 基 。 在 适 于 宿 主 细 胞 生 长
的 条 件 下 进 行 培 养 。 当 宿 主 细 胞 生 长 到 适 当 的 细 胞 密 度 后 , 用 合 适 的 方 法 ( 如 温
度 转 换 或 化 学 诱 导 ) 诱 导 选 择 的 启 动 子 , 将 细 胞 再 培 养 一 段 时 间 。
本 发 明 的 结 合 分 子 优 选 的 是 采 用 哺 乳 动 物 细 胞 来 生 产 , 哺 乳 动 物 细 胞 通 常
需 要 在 含 血 清 的 培 养 基 中 进 行 培 养 。 需 要 对 细 胞 进 行 无 血 清 的 适 应 过 程 后 , 方
可 让 细 胞 在 无 血 清 培 养 基 中 正 常 的 生 长 。
如 果 需 要 , 可 利 用 其 物 理 的 、 化 学 的 和 其 它 特 性 通 过 各 种 分 离 方 法 分 离 和
纯 化 重 组 的 蛋 白 。 这 些 方 法 是 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 的 。 这 些 方 法 的 例 子 包 括
但 并 不 限 于 : 常 规 的 复 性 处 理 、 用 蛋 白 沉 淀 剂 处 理 ( 盐 析 方 法 )、 离 心 、 渗 透 破
菌 、 超 声 处 理 、 超 离 心 、 分 子 筛 层 析 ( 凝 胶 过 滤 )、 吸 附 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、
高 效 液 相 层 析 (HPLC) 和 其 它 各 种 液 相 层 析 技 术 及 这 些 方 法 的 结 合 。
本 发 明 的 结 合 分 子 也 可 以 在 转 基 因 非 人 哺 乳 动 物 如 兔 、 山 羊 或 者 牛 中 产
生 , 并 且 分 泌 进 例 如 其 乳 中 。
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药 物 组 合 物
本 发 明 的 结 合 分 子 可 用 于 制 备 抑 制 流 感 病 毒 的 组 合 物 。
基 于 本 发 明 的 新 发 现 , 还 提 供 了 一 种 可 抑 制 流 感 病 毒 或 流 感 病 毒 感 染 相 关
疾 病 的 组 合 物 , 其 包 含 : 有 效 量 的 本 发 明 所 述 的 结 合 分 子 ; 以 及 药 学 上 可 接 受
的 载 体 。
本 文 所 用 的 术 语 “ 药 学 上 可 接 受 的 ” 是 指 当 分 子 本 体 和 组 合 物 适 当 地 给 予
动 物 或 人 时 , 它 们 不 会 产 生 不 利 的 、 过 敏 的 或 其 它 不 良 反 应 。 本 文 所 用 的 “ 药
学 上 可 接 受 的 载 体 ” 应 当 与 本 发 明 的 结 合 分 子 相 容 , 即 能 与 其 共 混 而 不 会 在 通
常 情 况 下 大 幅 度 降 低 组 合 物 的 效 果 。
可 作 为 药 学 上 可 接 受 的 载 体 或 其 组 分 的 一 些 物 质 的 具 体 例 子 是 糖 类 , 如 乳
糖 、 葡 萄 糖 和 蔗 糖 ; 淀 粉 , 如 玉 米 淀 粉 和 土 豆 淀 粉 ; 纤 维 素 及 其 衍 生 物 , 如 羧
甲 基 纤 维 素 钠 、 乙 基 纤 维 素 和 甲 基 纤 维 素 ; 西 黄 蓍 胶 粉 末 ; 麦 芽 ; 明 胶 ; 滑 石 ;
固 体 润 滑 剂 , 如 硬 脂 酸 和 硬 脂 酸 镁 ; 硫 酸 钙 ; 植 物 油 , 如 花 生 油 、 棉 籽 油 、 芝
麻 油 、 橄 榄 油 、 玉 米 油 和 可 可 油 ; 多 元 醇 , 如 丙 二 醇 、 甘 油 、 山 梨 糖 醇 、 甘 露
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糖 醇 和 聚 乙 二 醇 ; 海 藻 酸 ; 乳 化 剂 , 如 Tween®; 润 湿 剂 , 如 月 桂 基 硫 酸 钠 ;
着 色 剂 ; 调 味 剂 ; 压 片 剂 、 稳 定 剂 ; 抗 氧 化 剂 ; 防 腐 剂 ; 无 热 原 水 ; 等 渗 盐 溶
液 ; 和 磷 酸 盐 缓 冲 液 等 。
本 发 明 的 组 合 物 可 根 据 需 要 制 成 各 种 剂 型 , 并 可 由 医 师 根 据 患 者 种 类 、 年
龄 、 体 重 和 大 致 疾 病 状 况 、 给 药 方 式 等 因 素 确 定 对 病 人 有 益 的 剂 量 进 行 施 用 。
给 药 方 式 例 如 可 以 采 用 注 射 或 其 它 治 疗 方 式 。
本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 以 未 分 离 的 或 者 分 离 的 形 式 使 用 。 此 外 , 本 发 明 的
结 合 分 子 可 以 单 独 应 用 或 者 于 包 含 至 少 一 种 本 发 明 的 结 合 分 子 ( 或 其 变 体 或 片
段 ) 的 混 合 物 中 应 用 。 换 句 话 说 , 所 述 结 合 分 子 可 以 组 合 应 用 , 例 如 作 为 包 含 两
或 更 多 种 本 发 明 的 结 合 分 子 、 其 变 体 或 片 段 的 药 物 组 合 物 。 例 如 , 具 有 不 同 但
互 补 活 性 的 结 合 分 子 可 以 组 合 在 一 个 治 疗 方 案 中 以 达 到 希 望 的 预 防 、 治 疗 或 诊
断 作 用 , 但 是 或 者 也 可 以 将 具 有 相 同 活 性 的 结 合 分 子 组 合 在 一 个 治 疗 方 案 中 以
达 到 希 望 的 预 防 、 治 疗 或 诊 断 作 用 。 任 选 地 , 所 述 混 合 物 进 一 步 包 含 至 少 一 种
其 它 治 疗 剂 。 优 选 地 , 所 述 治 疗 剂 如 MZ 抑 制 剂 ( 例 如 amantidine、 金 刚 乙 胺
(rimantadine)) 和 / 或 神 经 氨 酸 酶 抑 制 剂 ( 例 如 扎 那 米 韦 ((zanamivir)、 奥 司 他 韦
(oseltamivir)) 可 用 于 预 防 和 / 或 治 疗 流 感 病 毒 感 染 。
所 述 药 物 组 合 物 可 包 含 两 或 多 个 对 于 流 感 病 毒 具 有 中 和 活 性 的 结 合 分 子 。
在 一 个 实 施 方 案 中 , 当 组 合 应 用 时 , 所 述 结 合 分 子 呈 现 协 同 中 和 活 性 。 换 句 话
说 , 所 述 组 合 物 包 含 至 少 两 种 具 有 中 和 活 性 的 结 合 分 子 , 特 征 在 于 所 述 结 合 分
子 在 中 和 流 感 病 毒 中 起 协 同 作 用 。 如 本 文 所 用 , 术 语 “ 协 同 ” 是 指 当 组 合 应 用
时 , 结 合 分 子 的 组 合 作 用 高 于 单 独 应 用 时 的 加 合 作 用 。 所 述 协 同 作 用 的 结 合 分
子 可 以 结 合 流 感 病 毒 的 相 同 或 不 同 片 段 上 的 不 同 结 构 。 计 算 协 同 作 用 的 方 式 是
通 过 组 合 指 数 计 算 。 组 合 指 数 (CI) 的 概 念 己 经 由 Chou and Talalay (1984) 描 述 。
所 述 组 合 物 也 可 包 含 具 有 中 和 活 性 的 一 种 结 合 分 子 以 及 一 种 非 中 和 性 流 感 病
毒 特 异 性 结 合 分 子 。 所 述 非 中 和 性 及 中 和 性 流 感 病 毒 特 异 性 结 合 分 子 在 中 和 流
感 病 毒 H5N1 中 也 可 以 协 同 作 用 。
本 发 明 的 结 合 分 子 或 药 物 组 合 在 用 于 人 体 之 前 可 以 在 合 适 的 动 物 模 型 系
统 中 检 测 。 这 种 动 物 模 型 系 统 包 括 但 不 限 于 小 鼠 、 雪 貂 (ferret) 和 猴 。 感 病 毒 流
感 病 毒 中 也 可 以 协 同 作 用 。
可 以 调 整 给 药 方 案 以 提 供 最 佳 的 所 需 应 答 ( 例 如 治 疗 应 答 )。 合 适 的 剂 量 范
围 可 例 如 是 0.1-100mg/kg 体 重 , 优 选 0.5-15mg/kg 体 重 。 此 外 , 例 如 可 以 给 予
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一 次 推 注 、 随 时 间 给 予 多 次 分 开 剂 量 或 者 根 据 治 疗 情 况 的 紧 急 性 而 可 以 按 比 例
降 低 或 增 加 剂 量 。 本 发 明 的 分 子 和 组 合 物 优 选 是 无 菌 的 。 使 得 这 些 分 子 和 组 合
物 无 菌 的 方 法 为 本 领 域 所 熟 知 。 用 于 诊 断 、 预 防 和 / 或 治 疗 的 其 它 分 子 可 以 以 与
本 发 明 的 结 合 分 子 相 似 的 给 药 方 案 给 予 。 如 果 单 独 给 予 其 它 分 子 , 则 可 以 在 给
予 本 发 明 的 一 或 多 种 人 结 合 分 子 或 药 物 组 合 物 之 前 、 同 时 或 者 之 后 给 予 患 者 。
对 于 人 患 者 的 精 确 给 药 方 案 通 常 在 临 床 实 验 期 间 挑 选 出 。
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检 测 试 剂 和 试 剂 盒
本 发 明 的 结 合 分 子 可 用 于 制 备 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 或 试 剂 盒 。
如 本 文 所 用 , 术 语 “ 待 测 样 品 ” 涵 盖 了 多 种 样 品 类 型 , 包 括 生 物 学 来 源 的
血 液 及 其 它 体 液 样 品 , 实 体 组 织 样 品 如 活 检 组 织 样 品 或 者 组 织 培 养 物 , 或 者 衍
生 自 其 中 的 细 胞 或 者 其 后 代 。 该 术 语 还 包 括 在 获 得 后 已 经 通 过 任 何 方 式 处 理 的
样 品 , 例 如 用 试 剂 处 理 、 溶 解 、 或 者 富 集 某 些 成 分 如 蛋 白 质 或 者 多 核 苷 酸 。 该
术 语 涵 盖 了 得 自 任 何 物 种 的 各 种 临 床 样 品 , 也 包 括 培 养 的 细 胞 、 细 胞 上 清 和 细
胞 溶 解 产 物 。
以 所 述 的 结 合 分 子 为 基 础 , 可 制 备 方 便 、 快 速 且 准 确 地 检 测 流 感 病 毒 ( 如 甲
型 流 感 病 毒 ; 更 特 别 地 如 甲 型 H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H9N2 病 毒 ) 的 试
剂 盒 。
因 此 , 本 发 明 提 供 了 一 种 用 于 检 测 样 品 中 是 否 存 在 流 感 病 毒 的 检 测 试 剂
盒 , 该 试 剂 盒 中 含 有 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 的 结 合 分 子 。
在 获 得 了 本 发 明 提 供 的 结 合 分 子 后 , 可 以 方 便 地 制 备 出 用 于 特 异 性 检 测 流
感 病 毒 的 检 测 试 剂 盒 。
作 为 本 发 明 的 一 种 检 测 方 式 , 采 用 间 接 ELISA 法 , 将 待 测 的 抗 原 包 被 于 固
相 载 体 上 , 利 用 本 发 明 的 结 合 分 子 进 行 检 测 。
作 为 本 发 明 的 一 种 优 选 方 式 , 所 述 的 结 合 分 子 是 抗 体 , 可 根 据 双 抗 夹 心 法
的 原 理 来 检 测 。 双 抗 夹 心 法 常 规 的 做 法 是 将 一 抗 ( 如 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 ) 固 定
于 载 体 , 然 后 使 一 抗 与 抗 原 反 应 , 洗 涤 后 再 与 二 抗 反 应 ( 所 述 的 二 抗 携 带 可 检 测
信 号 , 或 可 与 携 带 可 检 测 信 号 的 物 质 结 合 ), 最 后 进 行 化 学 发 光 或 酶 联 显 色 反 应
检 测 信 号 。 双 抗 夹 心 法 特 别 适 用 于 具 有 两 个 或 两 个 以 上 表 位 的 抗 原 的 检 测 。
为 了 在 检 测 时 更 方 便 , 所 述 试 剂 盒 中 除 了 含 有 本 发 明 的 结 合 分 子 以 外 , 还
可 以 包 含 其 它 检 测 试 剂 或 辅 助 试 剂 , 所 述 的 辅 助 试 剂 例 如 是 ELISA 试 剂 盒 中 常
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规 使 用 的 一 些 试 剂 , 这 些 试 剂 的 特 性 以 及 它 们 的 配 制 方 法 均 是 本 领 域 技 术 人 员
所 熟 知 的 , 如 显 色 剂 、 标 记 物 、 二 抗 、 抗 抗 体 、 增 敏 剂 等 。 本 领 域 人 员 应 理 解 ,
各 种 变 化 形 式 的 检 测 试 剂 盒 均 是 包 含 在 本 发 明 中 的 , 只 要 在 其 中 利 用 了 本 发 明
的 结 合 分 子 作 为 识 别 流 感 病 毒 的 试 剂 。
此 外 , 在 所 述 试 剂 盒 中 还 可 包 含 使 用 说 明 书 , 用 于 说 明 其 中 装 载 的 试 剂 的
使 用 方 法 。
在 获 得 了 本 发 明 提 供 的 结 合 分 子 和 / 或 试 剂 盒 后 , 可 以 利 用 多 种 免 疫 学 相 关
方 法 来 检 测 样 品 中 HA 蛋 白 或 其 含 量 , 从 而 得 知 待 测 样 品 的 供 体 是 否 感 染 流 感 病
毒 , 这 些 方 法 均 被 包 含 在 本 发 明 中 。 较 佳 地 , 所 述 的 方 法 是 以 非 疾 病 诊 断 为 目
的 的 。
作 为 一 种 优 选 方 式 , 本 发 明 提 供 一 种 体 外 ( 非 诊 断 或 治 疗 性 地 ) 检 测 流 感 病
毒 的 方 法 , 包 括 以 下 步 骤 :
(a1) 将 待 测 样 品 包 被 于 固 相 载 体 ;
(a2) 将 本 发 明 的 结 合 分 子 加 样 于 (a1) 的 固 相 载 体 , 从 而 使 待 测 样 品 中 的 流
感 病 毒 与 结 合 分 子 结 合 , 形 成 带 有 “ 流 感 病 毒 - 本 发 明 的 结 合 分 子 ” 二 元 复 合 物
的 固 相 载 体 ;
(a3) 将 特 异 性 结 合 本 发 明 的 结 合 分 子 的 检 测 物 加 样 于 (a2) 的 固 相 载 体 , 形
成 带 有 “ 流 感 病 毒 - 本 发 明 的 结 合 分 子 - 检 测 物 ” 三 元 复 合 物 的 固 相 载 体 ; 所 述
的 检 测 物 上 携 带 一 标 记 物 ;
(a4) 检 测 三 元 复 合 物 中 的 标 记 物 , 确 定 待 检 测 样 品 中 流 感 病 毒 的 存 在 与 否
以 或 存 在 的 量 。
按 照 上 述 方 法 , 只 要 设 置 已 知 浓 度 的 抗 原 对 照 , 制 作 浓 度 标 准 曲 线 , 通 过
比 照 浓 度 标 准 曲 线 就 可 以 得 出 待 测 样 品 中 的 流 感 病 毒 含 量 。
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本 发 明 的 主 要 优 点 在 于 :
(1) 提 供 了 一 种 具 有 全 新 的 结 合 分 子 , 其 是 全 人 源 的 , 与 其 它 动 物 源 性 ( 如
鼠 源 性 ) 抗 流 感 病 毒 的 分 子 相 比 , 免 疫 原 性 大 大 减 少 , 且 亲 和 性 良 好 。 不 仅 治 疗
效 果 好 , 而 且 副 作 用 低 。
(2) 本 发 明 的 结 合 分 子 能 够 结 合 具 有 天 然 构 象 的 流 感 病 毒 血 凝 素 蛋 白 (HA)
的 HA2 亚 基 , 能 够 阻 止 多 种 亚 型 流 感 病 毒 侵 染 易 感 细 胞 。
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下 面 结 合 具 体 实 施 例 , 进 一 步 阐 述 本 发 明 。 应 理 解 , 这 些 实 施 例 仅 用 于 说
明 本 发 明 而 不 用 于 限 制 本 发 明 的 范 围 。 下 列 实 施 例 中 未 注 明 具 体 条 件 的 实 验 方
法 , 通 常 按 照 常 规 条 件 如 J. 萨 姆 布 鲁 克 等 编 著 , 分 子 克 隆 实 验 指 南 , 科 学 出 版
社 ,2002 中 所 述 的 条 件 , 或 按 照 制 造 厂 商 所 建 议 的 条 件 。 除 非 另 外 说 明 , 否 则
百 分 比 和 份 数 按 重 量 计 算 。
除 非 另 行 定 义 , 文 中 所 使 用 的 所 有 专 业 与 科 学 用 语 与 本 领 域 熟 练 人 员 所 熟
悉 的 意 义 相 同 。 此 外 , 任 何 与 所 记 载 内 容 相 似 或 均 等 的 方 法 及 材 料 皆 可 应 用 于
本 发 明 中 。 文 中 所 述 的 较 佳 实 施 方 法 与 材 料 仅 作 示 范 之 用 。
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I. 材 料 和 方 法
本 发 明 的 全 人 单 克 隆 抗 体 制 备 以 及 抗 体 特 性 分 析 过 程 分 为 两 部 分 : 单 细 胞
RT-PCR 法 获 得 抗 体 基 因 以 及 抗 体 表 达 ; 以 及 抗 体 特 性 分 析 。
具 体 过 程 如 下 :
1、 外 周 血 单 核 细 胞 (PBMC) 的 获 得
从 接 种 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 裂 解 疫 苗 (A/California/07/2009 (H1N1),
简 称 2009/Cal) 志 愿 者 体 内 抽 取 外 周 血 , 采 用 常 规 Ficoll-Paque 密 度 梯 度 离 心 , 得
到 10 7 以 上 个 外 周 血 单 核 细 胞 (PBMC)。
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2、HA 特 异 性 记 忆 B 细 胞 分 选
2.1、HA-His、HA1-Fc 载 体 构 建
1. 取 得 目 的 基 因 模 板
HA 的 GenBank 号 为 FJ966082.1( 由 TAKARA 公 司 全 基 因 合 成 该 目 的 基 因
模 板 )。
2. 引 物 的 设 计 与 合 成 , 加 入 酶 切 位 点 (EcoRI/XhoI);
按 照 引 物 设 计 原 则 , 使 用 Primer premier5.0 软 件 设 计 引 物 , 引 物 由 上 海 生
工 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成 。 序 列 分 别 为 :
HA-SP:5’-CCGGAATTCTACTTCCGTTATGATCATC-3’
HA-AS:5’-CCGCTCGAGTTAAATACATATTCTAC-3’
HA1-SP:5’-CCGGAATTCGACACATTATGTATAGGTTATCA-3’
HA1-AS:5’-CCGCTGGAGTCTAGATTGAATAGACGGGA-3’
引 物 序 列 中 的 方 框 分 别 表 示 限 制 性 内 切 酶 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 位 点 。
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3. 目 的 基 因 进 行 常 规 方 法 PCR 扩 增 ;
按 照 以 下 50ul 体 系 加 入 各 反 应 物 并 混 合 均 匀
2×Pfu Plus PCR Master Mix( 购 自 TIANGEN) 25µl
引 物
1+1ul
模 板 1µl
ddH 2 O 22µl
将 加 好 的 反 应 体 系 按 下 列 反 应 条 件 进 行 PCR 扩 增 :94℃,5min;(94℃,
45sec;55℃,45sec;72℃,2min;32 循 环 );72℃,5min;4℃, 终 止 。
4. 扩 增 产 物 用 限 制 性 内 切 酶 EcoRⅠ(TAKARA) 和 XhoⅠ(TAKARA) 酶 切
然 后 割 胶 回 收 ;
5. pFastBac-HTb 质 粒 ( 购 自 Invitrogen) 使 用 限 制 性 内 切 酶 EcoR Ⅰ
(TAKARA) 和 XhoⅠ(TAKARA) 酶 切 , 然 后 割 胶 回 收 ;
6. 目 的 基 因 与 载 体 的 连 接 , 获 得 pFastBac-HA-His;
7. 感 受 态 DH5α( 购 自 Transgen) 的 转 化 、 涂 板 、 挑 克 隆 、 摇 菌 ;
8. 菌 液 PCR 验 证 ;
9. 小 量 抽 提 质 粒 ( 试 剂 盒 购 自 TIANGEN);
10. 测 序 , 经 BLAST 验 证 ,100% 匹 配 ;
11. 感 受 态 DH10Bac 的 重 组 转 位 、 涂 板 、 挑 克 隆 、 摇 菌 ;
12. 菌 液 PCR 验 证 , 采 用 M13 通 用 引 物 , 序 列 为 :
M13-SP:5’- CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’
M13-AS:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAAGG-3’
13. 常 规 方 法 进 行 Bacmid 粘 粒 的 大 量 抽 提 与 纯 化 。
1.2、HA-His、HA1-Fc 蛋 白 的 细 胞 表 达
1.2.1 病 毒 包 装 , 脂 质 体 细 胞 转 染 (6 孔 板 )
1.2.1.1 转 染 前 一 天 铺 板 ,3 孔 (9×10 5 个 / 孔 )。
1.2.1.2 首 先 观 察 High Five 细 胞 , 细 胞 长 至 50-80% 可 以 转 染 。
1.2.1.3 在 6 个 1.5 ml 离 心 管 中 各 加 入 100μl 的 Sf900 II SFM( 沿 管 壁 加 , 不 要
有 气 泡 ),6 个 离 心 管 中 分 为 3 个 A 管 ,3 个 B 管 。
1.2.1.4 在 B 管 中 加 入 10μl 的 脂 质 体 , 加 进 去 后 用 抢 轻 轻 吹 打 混 匀 。
1.2.1.5 在 A 管 中 加 入 4μg 的 质 粒 (Bacmid 粘 粒 ), 同 样 用 移 液 枪 轻 轻 吹 打 混
匀 。
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1.2.1.6 待 前 面 两 步 全 部 加 完 后 , 在 用 手 指 轻 弹 一 下 , 保 证 充 分 混 匀 。
1.2.1.7 用 微 量 移 液 器 将 A 管 中 的 液 体 全 部 转 移 至 B 管 中 , 吸 A 管 中 的 液 体
时 , 注 意 用 抢 混 匀 , 吹 时 沿 着 管 壁 减 少 气 泡 的 产 生 , 转 移 至 B 管 中 后 在 用 微 量
移 液 器 上 下 吹 打 几 次 , 保 证 混 匀 。
1.2.1.8 静 置 15 分 钟 。
1.2.1.9 取 1000ml 微 量 移 液 器 在 1.5ml 离 心 管 中 补 加 入 800μl Sf900 II SFM,
共 约 1ml 左 右 。
1.2.1.10 用 吸 管 吸 去 六 孔 板 之 前 的 培 液 , 用 微 量 移 液 器 沿 孔 壁 慢 慢 加 入 1ml
的 混 合 物 ( 加 液 体 的 时 候 速 度 要 慢 ), 盖 上 盖 子 , 做 好 标 记 。
1.2.1.11 放 入 37℃ 培 养 箱 继 续 培 养 。
1.2.1.12 培 养 6-8 小 时 后 , 将 转 染 液 吸 去 , 重 新 换 新 鲜 的 培 养 液 (Sf900 II
SFM)3ml。
1.2.1.13 继 续 培 养 72 小 时 。
1.2.1.14 72 小 时 后 , 开 始 收 细 胞 上 清 ( 第 一 代 重 组 杆 状 病 毒 ) 和 细 胞 裂 解 液 。
3000rpm 离 心 5min, 将 细 胞 上 清 , 即 第 一 代 病 毒 冻 存 于 -70℃; 将 离 下 的 细 胞 加
入 细 胞 裂 解 液 , 充 分 振 荡 使 细 胞 裂 解 , 或 超 声 若 干 次 (5 秒 一 次 ),100℃ 反 应 五
分 钟 , 冻 存 于 -20℃。
1.3、HA-His、HA1-Fc 蛋 白 的 纯 化
1 前 期 预 处 理 :20mM PB(pH 5.89) 透 析 过 夜 ,0.45mm 孔 径 膜 抽 滤 ;
2 纯 化 方 法 : 先 后 以 Q-FF 柱 和 SP 柱 ( 购 自 GE Healthcare) 串 联 纯 化 利 用 羟
基 磷 灰 石 填 料 柱 ( 购 自 Bio-rad) 进 行 精 细 纯 化 ;
3 Q-FF 与 SP 串 联 纯 化 后 , 用 SDS-PAGE 检 测 纯 化 效 果 , 如 图
1A(SDS-PAGE) 和 B(Western Blot)。
Q-FF 柱 和 SP 柱 串 联 纯 化 方 法 ( 吸 光 值 图 谱 见 下 图 ):
1 平 衡 柱 子 , 使 用 Buffer A (Buffer A:20mM 磷 酸 钠 ,1.0mM EDTA,0.01%
表 面 活 性 剂 -NP9,5% 丙 三 醇 ,pH 5.89) 进 行 平 衡 ,3ml/min 流 速 , 直 至
吸 光 值 平 稳 , 约 10 个 柱 体 积 ;
2 上 样 , 暂 停 纯 化 仪 , 将 进 液 管 从 Buffer A 中 取 出 , 插 入 预 处 理 好 的 样 本
中 ,2ml/min 流 速 进 行 上 样 , 并 收 集 穿 透 ;
3 再 平 衡 , 当 样 品 上 样 完 毕 时 , 将 进 液 管 取 出 , 放 入 Buffer A 中 ,2ml/min
流 速 直 至 吸 光 值 再 次 平 稳 ;
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4 使 用 Buffer B(20mM 磷 酸 钠 ,0.03 % Tergitol( 表 面 活 性 剂 ),5% 丙 三 醇 ,
pH 7.02) 洗 脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;
5 使 用 Buffer C(20mM 磷 酸 钠 ,150mM NaCl,0.03% Tergitol,5% 丙 三 醇 ,
pH 7.02) 洗 脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;
6 最 后 用 0.5M 氢 氧 化 钠 清 洗 柱 子 上 的 所 有 杂 蛋 白 , 不 收 集 。
羟 基 磷 灰 石 填 料 柱 纯 化 方 法 ( 吸 光 值 图 谱 见 下 图 ):
7 平 衡 柱 子 , 使 用 buffer B 进 行 平 衡 ,3ml/min 流 速 , 直 至 吸 光 值 平 稳 , 约
10 个 柱 体 积 ;
8 上 样 , 暂 停 纯 化 仪 , 将 进 液 管 从 buffer B 中 取 出 , 插 入 预 处 理 好 的 样 本 中 ,
2ml/min 流 速 进 行 上 样 , 并 收 集 穿 透 ;
9 再 平 衡 , 当 样 品 上 样 完 毕 时 , 将 进 液 管 取 出 , 放 入 buffer B 中 ,2ml/min
流 速 直 至 吸 光 值 再 次 平 稳 ;
10 使 用 buffer D(40mM 磷 酸 钠 ,0.05% Tween-20,5% 丙 三 醇 ,pH 7.20) 洗 脱 ,
并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;
⑾ 使 用 buffer E(100mM 磷 酸 钠 ,0.05% Tween-20,5% 丙 三 醇 ,pH 7.20) 洗
脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;
⑿ 最 后 用 0.5M 氢 氧 化 钠 清 洗 柱 子 上 的 所 有 杂 蛋 白 , 不 收 集 。
2.2 HA-His 生 物 素 化 标 记
参 照 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin kit(Pierce) 试 剂 盒 操 作 手 册 , 将 HA-His 生 物
素 标 记 。
2.3 使 用 FITC-CD19/APC-IgG/Cy3-streptavidin-biotin-HA(FITC-CD19/APC-IgG
购 自 BD,Cy3-streptavidin 购 自 Sigma) 为 标 志 物 , 经 流 式 细 胞 仪 获 得 特 异 性 B 细 胞
至 96 孔 RT-PCR 板 , 每 孔 一 个 细 胞 , 获 得 HA 特 异 性 记 忆 B 细 胞 。
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3、 抗 体 基 因
使 用 RT-PCR 和 Nested-PCR 技 术 (Nat Protoc. 2009;4(3):372-84), 获 得 抗 体 基
因 。 连 接 p GEM-T Easy (Promega), 进 行 测 序 , 验 证 抗 体 基 因 。
IgH、IgL 载 体 的 序 列 分 别 见 GenBank:FJ475055.1 和 GenBank:FJ475056.1。
其 中 ,IgH 中 的 重 链 恒 定 区 核 苷 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 17):
cggtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaagga
ctacttccccgaacctgtgacggtctcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggac
tctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacc
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aaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagt
cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc
ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt
gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccat
cgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccagg
tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc
acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc
atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
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重 链 恒 定 区 氨 基 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 18):
RSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEQKSLSLSPGK
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其 中 ,IgL 中 的 轻 链 (Kappa 链 ) 恒 定 区 核 苷 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 19):
Cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataa
cttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca
aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag
ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
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Kappa 链 恒 定 区 氨 基 酸 序 列 (SEQ ID NO: 20):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC
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然 后 将 重 、 轻 链 基 因 分 别 连 接 表 达 载 体 IgH( 插 入 位 点 为 AgeI 和 SalI) 和
IgL( 插 入 位 点 为 AgeI 和 BsiwI), 获 得 IgH-3E1H 和 IgL-3E1L。
4、 抗 体 的 重 组 表 达
脂 质 体 法 瞬 时 转 染 293T 细 胞 (ATCC), 进 行 全 人 抗 体 表 达 。
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1) 在 转 染 前 一 天 将 1.0×10 6 细 胞 接 种 到 6 孔 细 胞 培 养 板 中 ;
2) A 管 :500µl Opti-MEM + 4µg 带 有 重 链 基 因 的 IgH(IgH-3E1H) +4µg 带
有 轻 链 基 因 的 IgL(IgL-3E1L);
3) B 管 :500µl Opti-MEM + 20µl Lipofectamine Reagent;
4) 静 置 5 分 钟 后 , 将 A 管 与 B 管 混 合 , 在 室 温 静 置 20 min;
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5) A、B 管 混 合 物 加 入 细 胞 培 养 盘 中 ,37℃ 孵 育 6 h;
6) 6 h 后 , 吸 除 含 有 Lipofectamine Reagent DNA 的 培 养 液 , 每 孔 加 入 2ml
FreeStyle 293 Expression Medium;
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7) 72h 后 , 收 集 细 胞 上 清 ,4℃,3000rpm,5min。
获 得 的 细 胞 上 清 用 于 进 行 后 续 细 胞 试 验 。
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5、 抗 体 浓 度 测 定
ELISA 方 法 测 定 全 人 抗 体 浓 度 。
1) 包 被 Goat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody( 购 自 Sigma) 于 ELISA 板 ,
10µg/ml, 每 孔 100µl,4℃ 过 夜 ;
2) PBST 洗 板 ,3 次 ;
3) 封 闭 :1% BSA, 每 孔 200µl,37℃,2h;
4) PBST 洗 板 ,3 次 ;
5) 使 用 倍 比 稀 释 的 human IgG( 购 自 Sigma) 做 标 准 曲 线 , 浓 度 400 ng/ml、200
ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml、6.25 ng/ml、0 ng/ml,100µl/
孔 ; 全 人 抗 体 细 胞 上 清 稀 释 5000 倍 , 每 孔 100µl,37℃,2h;
6) PBST 洗 板 ,3 次 ;
7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific)-Peroxidase antibody( 购 自 Sigma),1:10000
稀 释 , 每 孔 100µl,37℃,1h;
8) PBST 洗 板 ,3 次 ;
9) 加 入 底 物 TMB(Sigma), 每 孔 100µl,37℃,15min, 避 光 反 应 ;
10) 加 入 2M H 2 SO 4 , 每 孔 50µl;
11) 测 定 OD450, 并 进 行 数 据 处 理 。
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6、 抗 原 特 异 性 检 测
检 测 表 达 的 全 人 抗 体 是 否 识 别 HA 蛋 白 、HA1 蛋 白 、2009 甲 型 H1N1 流 感 病
毒 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal) 和 2008-2009 季 节 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液
(A/Brisbane/59/2007 (H1N1))。ELISA 进 行 检 测 , 分 别 包 被 HA-His、100℃5 分 钟
热 变 性 HA-His、HA1-Fc、2009 甲 型 H1N1 流 感 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal) 和 2008-2009
季 节 流 感 疫 苗 裂 解 液 (A/Brisbane/59/2007(H1N1))。
1) 分 别 包 被 HA-His、 热 变 性 HA-His(100℃, 处 理 5min)、HA1-Fc、2009 甲
型 H1N1 流 感 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal)( 购 自 华 兰 生 物 ) 和 2008-2009 季 节 流 感 疫 苗 裂 解
液 A/Brisbane/59/2007(H1N1) ( 购 自 华 兰 生 物 ) 于 ELISA 板 ,10µg/ml, 每 个 样 品 两
个 复 孔 , 每 孔 100µl,4℃ 过 夜 ;
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2) PBST 洗 板 ,3 次 ;
3) 封 闭 :1% BSA, 每 孔 200µl,37℃,2h;
4) PBST 洗 板 ,3 次 ;
5) 根 据 测 定 浓 度 , 调 整 全 人 抗 体 细 胞 至 相 同 浓 度 , 每 孔 100µl, 鼠 源 单 克 隆 抗
体 S-95-7( 识 别 位 于 HA1 上 的 构 象 依 赖 表 位 , 其 保 藏 于 中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 ,
保 藏 号 CCTCC NO:C201024) 为 阳 性 对 照 ,37℃,2h;
6) PBST 洗 板 ,3 次 ;
7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific) − Peroxidase antibody,1:10000 稀 释 , 每
孔 100µl, 加 到 HA-His、 热 变 性 HA-His、2009 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液 和
2008-2009 季 节 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液 ELISA 板 ;Goat Anti-Human IgG (Fab specific)
− Peroxidase antibody,1:10000 稀 释 , 每 孔 100µl, 加 到 HA1-Fc ELISA 板 ,37℃,
1h;
8) PBST 洗 板 ,3 次 ;
9) 底 物 A 液 :B 液 =1:1, 每 孔 100µl, 37℃,15min, 避 光 反 应 ;
10) 加 入 2M H 2 SO 4 , 每 孔 50µl;
11) 测 定 OD450, 并 进 行 数 据 处 理 。
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7、 抗 体 中 和 活 性 测 定
1.1 微 中 和 试 验
1) MDCK 细 胞 ( 购 自 ATCC) 铺 至 96 孔 板 (1-11 列 ,A-H 行 ),DMEM+10%FBS 培
液 培 养 ,12h 后 生 长 至 90%, 备 用 。
2) 血 清 处 理
a) 56℃ 灭 活 30min。
b) 加 9 份 PBS 至 终 浓 度 为 10 -1 稀 释 度 。
3) 96 孔 板 , 处 理 好 的 血 清 用 DMEM+0.2%BSA 2× 梯 度 稀 释 (1-10 列 2 0 至 2 -9
稀 释 ), 终 体 积 50µl/ 孔 。
4) 每 孔 加 入 50µl 含 100 个 TCID50 病 毒 ( 病 毒 种 类 :A/California/7/2009 (H1N1),
NYMCX-179A (H1N1),A/Brisbane/59/2007(H1N1),A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),
A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2) , A/Anhui/1/2005 (H5N1) ,
A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1),A/Guangzhou/333/1999 (H9N2))( 购 自 ATCC)( 预 先
用 DMEM+0.2%BSA 稀 释 至 100TCID50/50µl。
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5) 每 块 板 包 括 对 照 : 病 毒 对 照 (PC):50µl DMEM 0.2%BSA + 50µl 病 毒 (11 列
A-D); 细 胞 对 照 (NC):100µl DMEM 0.2%BSA(11 列 E-H); 阳 性 血 清 对 照 ; 阴 性 血
清 对 照 。 每 份 血 清 至 少 重 复 两 组 。
6) 37℃、5% CO 2 、1h, 使 血 清 与 病 毒 充 分 作 用 。
7) MDCK 单 层 细 胞 吸 去 培 液 ,PBS 洗 两 遍 , 加 100µl DMEM+0.2%BSA+2µg/ml
TPCK-trypsin( 购 自 Sigma)。
8) 将 血 清 - 病 毒 孵 育 混 合 物 100µl 全 部 对 应 移 至 MDCK 细 胞 平 板 中 。
9) 37℃,5%CO 2 ,20h;
10) PBS 洗 一 遍 。 预 冷 的 80% 丙 酮 -PBS 溶 液 固 定 10min;
11) anti-NP ELISA;
1.2 ELISA
1) 固 定 好 的 细 胞 板 PBS + 0.05% Tween 20 ( 漂 洗 液 ) 洗 3 遍 。
2) 用 PBS + 1% BSA 0.1% Tween 20( 稀 释 液 ) 1:10000 稀 释 anti-NP(HRP) 抗
体 ,50µl/ 孔 , 室 温 1 小 时 。
3) 漂 洗 液 洗 6 遍 。
4) 新 配 制 的 底 物 2 mg OPD(o-phenylenediamine, 邻 苯 二 胺 ) 加 入 到 4 ml 0.05 M
柠 檬 酸 缓 冲 液 含 0.03% 过 硼 酸 钠 (0.05M phosphate citrate buffer,pH 5.0,containing
0.03% sodium perborate, 现 用 现 配 ) 中 ,50µl/ 孔 , 室 温 5min。
5) 2N H 2 SO 4 终 止 反 应 ,50µl/ 孔 。
6) 分 光 光 度 计 490nm 读 板 。
7) 计 算 :X = [(A490 PC 孔 的 平 均 ) +(A490 NC 孔 的 平 均 )]/2。 终 点 判 定 :A490

5
10
15
20
25
30
载 体 构 建 。
3E1 重 链 可 变 区 基 因 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 1):
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG
AGACCCTGTCCCTCACGTGCAGTGTCTCTGGTGCTTCCATCAGTAGTTACT
AC(CDR1)TGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGG
ATTGGGCGTTTCTATACCAGTGGGAGCCCC(CDR2)AACTACAACCCCTCC
CTCAGGAGTCGAGTCACCATGTCGGTGGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTG
CGAGAGAGGAGCACATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTACGTTAC(CDR3)T
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 重 链 基 因 CDR1(SEQ
ID NO: 5),CDR2(SEQ ID NO: 6),CDR3(SEQ ID NO: 7) 序 列 。
3E1 重 链 可 变 区 氨 基 酸 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 2):
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISSYY(CDR1)WIWIRQPAGKGL
EWIGRFYTSGSP(CDR2)NYNPSLRSRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAV
YYCAREEHITFGGVIVRY(CDR3)WGQGTLVTVSS
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 重 链 氨 基 酸
CDR1(SEQ ID NO: 8),CDR2(SEQ ID NO: 9),CDR3(SEQ ID NO: 10) 序 列 。
3E1 轻 链 可 变 区 基 因 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 3):
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGCATCTGTAGG
AGACAGAGTCAGCATCACTTG(CDR1)CCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAG
TTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGA
TCTATAAGGCATCT(CDR2)AGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCA
GCGGCAGTGGATCTGGGTCAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG
CCTGATGATTTTGCAATTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATCCGTGG
ACG(CDR3)TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA
其 中 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 轻 链 基 因 CDR1(SEQ ID NO: 11),CDR2(SEQ
ID NO: 12),CDR3(SEQ ID NO: 13) 序 列 。
3E11 轻 链 可 变 区 氨 基 酸 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 4):
DIQMTQSPATLSASVGDRVSITCRASQSISSW(CDR1)LAWYQQKPGKAP
KLLIYKAS(CDR2)SLESGVPSRFSGSGSGSEFTLTISSLQPDDFAIYYCQQYNS
-23-

YPWT(CDR3)FGQGTKVEIKR
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 轻 链 氨 基 酸
CDR1(SEQ ID NO: 14),CDR2(SEQ ID NO: 15),CDR3(SEQ ID NO: 16) 序 列 。
5
ELISA 结 果 表 明 成 功 表 达 了 全 人 抗 体 , 并 且 其 浓 度 为 200-300µg/ml。 因 表
达 载 体 中 含 有 重 轻 链 的 恒 定 区 , 因 此 空 载 体 也 能 表 达 不 完 整 的 抗 体 , 见 图 5。
10
15
20
实 施 例 2、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 的 表 位 分 析
ELISA 表 明 ,3E1 能 够 识 别 HA 蛋 白 , 不 识 别 热 变 性 HA 蛋 白 , 表 明 3E1 识 别
的 表 位 为 空 间 构 象 , 但 是 3E1 不 识 别 HA1 蛋 白 ( 图 6), 而 HA 蛋 白 仅 由 HA1 和 HA2
两 部 分 组 成 , 说 明 这 此 株 抗 体 结 合 位 点 位 于 HA2。 现 有 技 术 公 知 HA2 在 不 同 流
感 病 毒 株 中 具 有 很 高 的 保 守 性 , 因 此 , 提 示 这 两 株 抗 体 具 有 识 别 流 感 病 毒 的 广
谱 性 。S-95-7 为 鼠 源 特 异 性 识 别 2009 年 甲 型 流 感 病 毒 HA1 构 象 表 位 单 克 隆 抗 体 ,
作 为 阳 性 对 照 ,Vector 为 阴 性 对 照 。
实 施 例 3、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 识 别 流 感 病 毒 广 谱 性
ELISA 结 果 表 明 ( 图 7),3E1 对 2009 年 甲 型 流 感 病 毒 (A/California/07/2009
(H1N1) , Cal/07) 具 有 很 高 的 识 别 性 , 同 时 对 2008-2009 年 季 节 流 感 病 毒
(A/Brisbane/59/2007 (H1N1),Bri/59) 也 具 有 很 强 的 结 合 特 性 。 表 明 这 株 全 人 单
克 隆 抗 体 具 有 识 别 广 谱 性 。S-95-7 为 鼠 源 特 异 性 识 别 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒
HA1 构 象 表 位 单 克 隆 抗 体 , 作 为 阳 性 对 照 ,Vector 为 阴 性 对 照 。
25
30
实 施 例 4、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 具 有 广 谱 中 和 性
全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 使 用 293T 细 胞 进 行 表 达 , 将 其 浓 度 调 整 为 1000µg/ml,
进 行 对 比 稀 释 。 使 用 微 中 和 试 验 测 定 其 对 A/California/7/2009 (H1N1),
NYMCX-179A (H1N1), A/Brisbane/59/2007(H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),
A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1),
A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1), A/Guangzhou/333/1999 (H9N2) 流 感 病 毒 的
中 和 活 性 。
实 验 表 明 ,3E1 不 仅 能 够 中 和 H1 家 族 流 感 病 毒 ( 图 8), 并 且 对 H3,H5,H7,
H9 亚 型 流 感 病 毒 均 具 有 中 和 活 性 ( 图 9), 说 明 了 此 株 抗 体 的 广 谱 中 和 活 性 。3E1
-24-

对 这 些 病 毒 的 中 和 活 性 呈 现 出 浓 度 梯 度 依 赖 性 。
5
在 本 发 明 提 及 的 所 有 文 献 都 在 本 申 请 中 引 用 作 为 参 考 , 就 如 同 每 一 篇 文 献
被 单 独 引 用 作 为 参 考 那 样 。 此 外 应 理 解 , 在 阅 读 了 本 发 明 的 上 述 讲 授 内 容 之 后 ,
本 领 域 技 术 人 员 可 以 对 本 发 明 作 各 种 改 动 或 修 改 , 这 些 等 价 形 式 同 样 落 于 本 申
请 所 附 权 利 要 求 书 所 限 定 的 范 围 。
-25-

序 列 表
中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院
一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子
112148
20
PatentIn version 3.3
1
363
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
1
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acgtgcagtg tctctggtgc ttccatcagt agttactact ggatctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt ttctatacca gtgggagccc caactacaac 180
ccctccctca ggagtcgagt caccatgtcg gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaggagcac 300
attacgtttg ggggagttat cgtacgttac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
2
121
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Phe Tyr Thr Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Glu His Ile Thr Phe Gly Gly Val Ile Val Arg Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
-1-

3
324
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
3
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcagc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agttggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggtcagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caatttatta ctgccaacag tataatagtt atccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acga 324
4
108
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
5
24
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
5
ggtgcttcca tcagtagtta ctac 24
6
21
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
-2-

6
ttctatacca gtgggagccc c 21
7
45
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
7
gcgagagagg agcacattac gtttggggga gttatcgtac gttac 45
8
8
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
8
Gly Ala Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
9
7
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
9
Phe Tyr Thr Ser Gly Ser Pro
1 5
10
15
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
10
Ala Arg Glu Glu His Ile Thr Phe Gly Gly Val Ile Val Arg Tyr
1 5 10 15
11
18
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
-3-

11
cagagtcagc atcacttg 18
12
9
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
12
aaggcatct 9
13
27
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
13
caacagtata atagttatcc gtggacg 27
14
6
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
14
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
15
3
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
15
Lys Ala Ser
1
16
9
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
16
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
-4-

17
993
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
17
cggtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtctcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
18
250
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
18
Arg Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
-5-

145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245 250
19
324
DNA
智 人 (Homo Sapiens)
19
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
20
107
PRT
智 人 (Homo Sapiens)
20
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
-6-

说 明 书 附 图
RNA 聚 合 酶
病 毒 RNA
图 1
图 2 图 3
浓 度
图 4 图 5
变 性 的
图 6 图 7
1

抑 制 率 (%)
抑 制 率 (%)
浓 度
浓 度
抑 制 率 (%)
抑 制 率 (%)
浓 度
浓 度
图 8
抑 制 率 (%)
抑 制 率 (%)
浓 度
浓 度
抑 制 率 (%)
浓 度
浓 度
浓 度
图 9
2