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说 明 书 摘 要<br />
5<br />
本 发 明 涉 及 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗<br />
体 。 本 发 明 的 结 合 分 子 能 够 结 合 具 有 天 然 构 象 的 流 感 病 毒 血 凝 素 蛋 白 HA2 亚<br />
基 , 能 够 阻 止 多 种 亚 型 流 感 病 毒 侵 染 易 感 细 胞 。 与 一 些 动 物 源 性 的 结 合 分 子 相<br />
比 , 本 发 明 的 结 合 分 子 免 疫 原 性 大 大 减 少 , 且 亲 和 性 良 好 。 不 仅 治 疗 效 果 好 ,<br />
而 且 副 作 用 低 。<br />
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权 利 要 求 书<br />
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1. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的<br />
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 8 所 示 重 链 CDR1 区 、SEQ ID<br />
NO: 9 所 示 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 重 链 CDR3 区 。<br />
2. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的<br />
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 14 所 示 轻 链 CDR1 区 、SEQ ID<br />
NO:15 所 示 轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 轻 链 CDR3 区 。<br />
3. 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血 凝 素 蛋 白 的 HA2 亚 基 中 的<br />
表 位 , 其 特 征 在 于 , 所 述 结 合 分 子 包 含 以 下 的 氨 基 酸 序 列 :SEQ ID NO: 8 所 示<br />
的 重 链 CDR1,SEQ ID NO: 9 所 示 的 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 的 重 链<br />
CDR3,SEQ ID NO: 14 所 示 的 轻 链 CDR1、SEQ ID NO: 15 所 示 的 轻 链 CDR2 和<br />
SEQ ID NO: 16 所 示 的 轻 链 CDR3。<br />
4. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 重 链 可 变 区 ,<br />
所 述 的 重 链 可 变 区 具 有 SEQ ID NO: 2 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
5. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 轻 链 可 变 区 ,<br />
所 述 的 轻 链 可 变 区 具 有 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
6. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 重 链 可 变 区 和<br />
轻 链 可 变 区 , 其 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 分 别 具 有 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO:<br />
4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
7. 如 权 利 要 求 6 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 包 含 抗 体 的 重 链 恒 定 区 和<br />
或 轻 链 恒 定 区 , 所 述 抗 体 的 重 链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 18 的 氨 基 酸 序 列 ; 或 轻<br />
链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 20 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
8. 如 权 利 要 求 1-3 任 一 所 述 的 结 合 分 子 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 结 合 分 子 是<br />
人 单 克 隆 抗 体 。<br />
9. 编 码 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分 子 的 核 酸 分 子 。<br />
10. 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 用 于 诊 断 、 治 疗 和 / 或 预 防 流<br />
感 病 毒 所 致 的 流 感 感 染 的 药 物 中 的 用 途 。<br />
11. 如 权 利 要 求 10 所 述 的 用 途 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 流 感 病 毒 的 毒 株 选 自<br />
如 下 一 组 :H1N1、H3N2、H5N1、H7N1 和 H9N2。<br />
12. 一 种 表 达 载 体 , 其 特 征 在 于 , 所 述 表 达 载 体 中 含 有 编 码 权 利 要 求 1-8 任<br />
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一 所 述 的 结 合 分 子 的 DNA。<br />
13. 一 种 宿 主 细 胞 , 其 特 征 在 于 , 所 述 宿 主 细 胞 中 含 有 权 利 要 求 12 所 述 的<br />
表 达 载 体 。<br />
14. 一 种 组 合 物 , 其 特 征 在 于 , 它 含 有 有 效 量 的 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 单<br />
克 隆 抗 体 , 以 及 药 学 上 可 接 受 的 载 体 。<br />
15. 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 盒 , 其 包 括 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述 的 结 合 分<br />
子 。<br />
16. 一 种 抑 制 流 感 病 毒 的 方 法 , 其 特 征 在 于 , 所 述 的 方 法 包 括 给 予 患 者 有<br />
效 量 的 权 利 要 求 1-8 所 述 的 结 合 分 子 。<br />
17. 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 方 法 , 其 特 征 在 于 , 利 用 权 利 要 求 1-8 任 一 所 述<br />
的 结 合 分 子 与 待 测 样 品 进 行 接 触 , 通 过 检 测 所 述 的 结 合 分 子 与 受 试 样 品 的 结 合<br />
情 况 , 获 得 流 感 病 毒 的 存 在 情 况 以 及 存 在 量 。<br />
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说 明 书<br />
一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子<br />
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技 术 领 域<br />
本 发 明 属 于 生 物 技 术 领 域 ; 更 具 体 地 , 本 发 明 涉 及 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中<br />
和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗 体 。<br />
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背 景 技 术<br />
自 2009 年 4 月 起 , 甲 型 H1N1 流 感 (A/H1N) 疫 情 在 世 界 范 围 内 爆 发 。 这 一 疫<br />
情 从 北 美 迅 速 传 播 扩 散 到 5 大 洲 200 多 个 国 家 和 地 区 。 据 世 界 卫 生 组 织 报 道 , 截<br />
止 2010 年 4 月 9 日 , 甲 型 A/H1N1 流 感 疫 情 已 在 超 过 213 个 国 家 爆 发 , 全 球 甲 型<br />
H1N1 流 感 死 亡 病 例 已 超 过 1.77 万 例 。 在 我 国 , 据 中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 报 道 ,<br />
截 至 2010 年 3 月 31 日 , 全 国 31 个 省 份 累 计 报 告 甲 型 H1N1 流 感 确 诊 病 例 12.7 万 余<br />
人 , 已 治 愈 12.2 万 , 死 亡 800 例 。<br />
流 感 病 毒 属 于 正 粘 病 毒 科 , 有 包 膜 , 呈 球 型 、 椭 圆 型 或 丝 状 , 病 毒 包 膜 来<br />
自 宿 主 细 胞 的 双 层 类 脂 膜 。 流 感 病 毒 属 单 链 的 RNA 病 毒 。 根 据 核 蛋 白 (NP) 和 细<br />
胞 质 蛋 白 (M1) 的 差 异 , 流 感 病 毒 可 分 为 A、B、C( 甲 、 乙 、 丙 ) 三 种 亚 型 。 对 A<br />
型 流 感 病 毒 , 根 据 血 凝 素 (HA) 和 神 经 氨 酸 酶 (NA) 表 面 糖 蛋 白 抗 原 性 的 不 同 , 又<br />
可 进 一 步 分 为 不 同 的 亚 型 。 目 前 ,A 型 流 感 病 毒 有 16 种 HA 亚 型 (H1–H16) 和 9 种<br />
NA 亚 型 (N1–N9)。<br />
A 型 流 感 病 毒 的 基 因 组 ( 见 图 1) 由 8 个 单 独 的 单 链 RNA 片 段 组 成 , 每 个 RNA<br />
片 段 编 码 一 至 两 个 蛋 白 。 因 此 A 型 流 感 病 毒 共 有 8 个 基 因 , 编 码 10 种 蛋 白 。 其 中 ,<br />
HA 蛋 白 对 于 结 合 细 胞 表 面 受 体 和 病 毒 与 细 胞 的 膜 融 合 起 重 要 作 用 , 在 感 染 细 胞<br />
前 ,HA 会 水 解 成 HA1 和 HA2, 其 中 位 于 HA1 上 的 的 受 体 结 合 区 (receptor binding<br />
domain,RBD) 的 附 近 区 域 , 在 不 同 流 感 病 毒 株 中 高 度 变 异 (RBD 本 身 比 较 保 守 ),<br />
是 重 要 的 中 和 性 表 位 所 在 区 域 , 目 前 发 现 的 多 种 中 和 性 抗 体 所 针 对 的 表 位 大 多<br />
位 于 HA1 蛋 白 的 RBD 附 近 区 域 。 但 是 这 些 抗 体 大 多 不 具 备 中 和 不 同 亚 型 或 同 一<br />
亚 型 不 同 毒 株 流 感 病 毒 的 能 力 。NA 可 以 去 除 唾 液 酸 , 帮 助 子 代 病 毒 的 释 放 和 避<br />
免 病 毒 自 身 的 聚 集 ;PA、PB1 和 PB2 三 种 聚 合 酶 以 及 NP 核 蛋 白 主 要 用 于 病 毒<br />
RNA 的 复 制 和 转 录 ; 基 质 蛋 白 M1 负 责 核 外 输 送 ,M2 负 责 形 成 离 子 通 道 ; 非 结<br />
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构 蛋 白 NS1 是 干 扰 素 的 抑 制 剂 ,NS2 负 责 核 外 输 送 。<br />
目 前 , 国 家 许 可 用 于 治 疗 流 感 的 药 物 主 要 为 以 下 两 大 类 :1) 烷 胺 类 ( 金 刚 烷<br />
胺 和 金 刚 乙 胺 );2) 流 感 病 毒 神 经 氨 酸 酶 抑 制 剂 ( 奥 司 他 韦 和 扎 那 米 韦 )。 对 烷 胺<br />
类 药 物 , 已 出 现 大 量 的 耐 药 性 流 感 毒 株 , 因 此 目 前 世 界 卫 生 组 织 不 建 议 使 用 烷<br />
胺 类 药 物 作 为 治 疗 流 感 的 药 物 ; 目 前 大 部 分 流 感 病 毒 ( 包 括 甲 型 H1N1 流 感 ) 仍 对<br />
奥 司 他 韦 和 扎 那 米 韦 敏 感 , 但 在 日 本 等 地 区 也 已 经 出 现 耐 药 性 毒 株 , 耐 药 性 毒<br />
株 的 出 现 限 制 了 这 些 化 学 小 分 子 药 物 的 大 规 模 使 用 。<br />
治 疗 性 抗 体 用 于 流 感 的 等 病 毒 感 染 性 疾 病 的 治 疗 早 有 报 道 , 抗 血 清 用 于 治<br />
疗 SARS 和 重 症 H5N1 禽 流 感 病 毒 感 染 者 的 案 例 已 经 证 明 了 抗 体 在 治 疗 病 毒 感 染<br />
中 发 挥 的 重 要 作 用 。 具 有 广 谱 中 和 活 性 的 抗 流 感 病 毒 的 治 疗 性 抗 体 具 有 以 下 潜<br />
在 优 势 , 一 方 面 它 可 以 阻 断 病 毒 与 靶 细 胞 的 结 合 , 另 一 方 面 通 过 补 体 和 T 细 胞 、<br />
NK 细 胞 等 效 应 细 胞 的 作 用 , 将 被 病 毒 感 染 的 细 胞 杀 死 。1986 年 , 第 一 株 治 疗 器<br />
官 移 植 出 现 的 排 斥 反 应 的 鼠 单 抗 —— 莫 罗 单 抗 -CD3 (murmonabCD3,hoclone<br />
OKT3) 获 得 美 国 FDA 批 准 上 市 , 但 由 于 其 在 人 体 内 会 产 生 人 抗 鼠 抗 体 (HAMA)<br />
反 应 , 限 制 了 应 用 。<br />
因 此 , 需 要 进 一 步 开 发 出 亲 和 性 良 好 且 副 作 用 低 的 治 疗 性 抗 体 , 如 人 源 化<br />
或 全 人 源 的 抗 体 , 以 满 足 临 床 治 疗 的 需 求 。<br />
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发 明 内 容<br />
本 发 明 的 目 的 在 于 提 供 一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 全 人 单 克 隆 抗 体 及 其<br />
应 用 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感 血<br />
凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 8 所 示 重 链<br />
CDR1 区 、SEQ ID NO: 9 所 示 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所 示 重 链 CDR3 区 。<br />
在 本 发 明 的 另 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感<br />
血 凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 SEQ ID NO: 14 所 示 轻<br />
链 CDR1 区 、SEQ ID NO:15 所 示 轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 轻 链 CDR3 区 。<br />
在 本 发 明 的 另 一 个 方 面 , 提 供 一 种 分 离 的 结 合 分 子 , 其 能 识 别 并 结 合 流 感<br />
血 凝 素 蛋 白 (HA) 的 HA2 亚 基 中 的 表 位 , 所 述 结 合 分 子 包 含 以 下 的 氨 基 酸 序 列 :<br />
SEQ ID NO: 8 所 示 的 重 链 CDR1,SEQ ID NO: 9 所 示 的 重 链 CDR2 和 SEQ ID NO:<br />
10 所 示 的 重 链 CDR3,SEQ ID NO: 14 所 示 的 轻 链 CDR1、SEQ ID NO: 15 所 示 的<br />
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轻 链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16 所 示 的 轻 链 CDR3。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 重 链 可 变 区 , 所 述 的 重 链 可 变 区 具<br />
有 SEQ ID NO: 2 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 轻 链 可 变 区 , 所 述 的 轻 链 可 变 区 具<br />
有 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 , 其 重 链<br />
可 变 区 和 轻 链 可 变 区 分 别 具 有 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 4 所 示 的 氨 基 酸 序<br />
列 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 包 含 抗 体 的 重 链 恒 定 区 和 或 轻 链 恒 定<br />
区 , 所 述 抗 体 的 重 链 恒 定 区 具 有 SEQ ID NO: 18 的 氨 基 酸 序 列 ; 或 轻 链 恒 定 区 具<br />
有 SEQ ID NO: 20 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 结 合 分 子 是 人 单 克 隆 抗 体 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 单 克 隆 抗 体 识 别 流 感 病 毒 HA 蛋 白 上 空 间 构 象 的<br />
表 位 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 编 码 所 述 的 结 合 分 子 的 核 酸 分 子 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 用 于 诊 断 、 治 疗 和 / 或 预<br />
防 流 感 病 毒 所 致 的 流 感 感 染 的 药 物 中 的 用 途 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 流 感 病 毒 的 毒 株 选 自 如 下 一 组 :H1N1、H3N2、<br />
H5N1、H7N1 和 H9N2。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 表 达 载 体 , 所 述 表 达 载 体 中 含 有 编 码 所 述<br />
的 结 合 分 子 的 DNA。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 宿 主 细 胞 , 所 述 宿 主 细 胞 中 含 有 所 述 的 表<br />
达 载 体 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 组 合 物 , 它 含 有 有 效 量 的 所 述 的 单 克 隆 抗<br />
体 , 以 及 药 学 上 可 接 受 的 载 体 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 盒 , 其 包 括 所 述 的 结<br />
合 分 子 。<br />
在 另 一 优 选 例 中 , 所 述 的 试 剂 盒 还 包 括 : 抗 原 或 抗 体 包 被 用 试 剂 , 洗 涤 试<br />
剂 , 第 二 抗 体 , 标 记 物 ( 如 辣 根 过 氧 化 物 酶 、 碱 性 磷 酸 酯 酶 、 葡 萄 糖 氧 化 酶 、β –<br />
D - 半 乳 糖 苷 酶 、 脲 酶 、 过 氧 化 氢 酶 、 或 葡 萄 糖 淀 粉 酶 ), 显 色 剂 酶 底 物 等 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 ( 优 选 非 治 疗 性 地 ) 抑 制 流 感 病 毒 的 方 法 ,<br />
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所 述 的 方 法 包 括 给 予 患 者 有 效 量 的 所 述 的 结 合 分 子 。<br />
在 本 发 明 的 一 个 方 面 , 提 供 一 种 ( 优 选 非 诊 断 性 地 ) 检 测 流 感 病 毒 的 方 法 ,<br />
利 用 所 述 的 结 合 分 子 与 待 测 样 品 进 行 接 触 , 通 过 检 测 所 述 的 结 合 分 子 与 受 试 样<br />
品 的 结 合 情 况 , 获 得 流 感 病 毒 的 存 在 情 况 以 及 存 在 量 。<br />
本 发 明 的 其 它 方 面 由 于 本 文 的 公 开 内 容 , 对 本 领 域 的 技 术 人 员 而 言 是 显 而<br />
易 见 的 。<br />
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附 图 说 明<br />
图 1、A 型 流 感 病 毒 的 基 因 组 示 意 图 。<br />
图 2、β-actin 内 参 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。<br />
图 3、 重 链 基 因 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。<br />
图 4、 轻 链 基 因 的 PCR 扩 增 产 物 的 电 泳 结 果 。<br />
图 5、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 浓 度 。<br />
图 6、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 识 别 HA/HA1 蛋 白 。<br />
图 7、 全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 识 别 流 感 病 毒 的 广 谱 性 。<br />
图 8、 不 同 浓 度 3E1 对 H1 流 感 病 毒 中 和 活 性 。A:A/California/7/2009 (H1N1);<br />
B:NYMCX-179A;C:A/Brisbane/59/2007 (H1N1);D:A/Puerto Rico/8/34<br />
(H1N1)。<br />
图 9、3E1 广 谱 中 和 活 性 。A: A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2);B:<br />
A/Anhui/1/2005 (H5N1) ; C : A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1) ; D :<br />
A/Guangzhou/333/1999 (H9N2)。<br />
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具 体 实 施 方 式<br />
本 发 明 人 经 过 广 泛 而 深 入 的 研 究 , 获 得 一 种 含 有 独 特 的 CDR 区 的 抗 流 感<br />
病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子 , 优 选 全 人 单 克 隆 抗 体 , 该 结 合 分 子 对 于 流 感 病 毒<br />
具 有 广 谱 中 和 作 用 。 在 此 基 础 上 完 成 了 本 发 明 。<br />
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结 合 分 子<br />
本 发 明 提 供 了 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 结 合 分 子 。 优 选 地 , 所 述 结 合 分 子<br />
是 人 结 合 分 子 。 优 选 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 呈 现 对 于 流 感 病 毒 的 中 和 活 性 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 也 可 以 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 一 或 多 个 片 段 。 对 于 治 疗<br />
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和 / 或 预 防 流 感 病 毒 的 方 法 而 言 , 所 述 结 合 分 子 优 选 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 表<br />
面 可 及 蛋 白 质 如 为 病 毒 附 着 和 细 胞 释 放 所 必 需 的 表 面 糖 蛋 白 血 凝 素 (HA) 和 神<br />
经 氨 酸 酶 (NA) 或 者 膜 蛋 白 (M1 和 M2)。 在 特 定 的 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 结 合 分<br />
子 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 的 HA2 分 子 。<br />
为 了 诊 断 目 的 , 结 合 分 子 也 能 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 表 面 上 不 存 在 的 蛋 白<br />
质 , 包 括 核 蛋 白 、 核 壳 结 构 蛋 白 、 聚 合 酶 (PA,PB 和 PB2) 以 及 非 结 构 蛋 白 (NS 1<br />
和 NS2)。 各 种 H5N1 毒 株 的 核 苷 酸 序 列 和 / 或 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 可 见 于<br />
GenBank 数 据 库 、NCBI 流 感 病 毒 序 列 数 据 库 、 流 感 病 毒 序 列 数 据 库 (ISD)。EMBL<br />
数 据 库 和 / 或 其 它 数 据 库 。 本 领 域 技 术 人 员 易 于 在 各 自 的 数 据 库 中 发 现 这 种 序<br />
列 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 是 完 整 的 免 疫 球 蛋 白 分 子 例 如 多 克 隆 或 单 克 隆 抗<br />
体 或 者 所 述 结 合 分 子 可 以 是 抗 原 结 合 片 段 , 包 括 但 不 限 于 Fab、F(ab')、F(ab') 2 、<br />
Fv、dAb、Fd、 互 补 决 定 区 (CDR) 片 段 、 单 链 抗 体 (scFv)、 二 价 单 链 抗 体 、 单 链<br />
噬 菌 体 抗 体 、 双 特 异 双 链 抗 体 、 三 链 抗 体 、 四 链 抗 体 以 及 至 少 含 有 足 以 赋 予 与<br />
流 感 病 毒 毒 株 的 特 异 性 抗 原 结 合 的 免 疫 球 蛋 白 的 片 段 的 ( 多 ) 肤 或 其 片 段 。 在 优<br />
选 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 结 合 分 子 是 人 单 克 隆 抗 体 。<br />
本 发 明 还 提 供 了 所 述 的 结 合 分 子 在 制 备 诊 断 、 预 防 和 / 或 治 疗 流 感 病 毒 感 染<br />
的 药 物 中 的 应 用 。 这 种 感 染 可 以 在 小 群 体 中 发 生 , 但 是 也 可 以 以 季 节 流 行 病 方<br />
式 在 世 界 范 围 传 播 , 或 者 更 严 重 地 在 全 球 蔓 延 , 数 百 万 个 体 处 于 危 险 之 中 。 本<br />
发 明 提 供 了 可 以 中 和 导 致 这 种 季 节 流 行 病 以 及 潜 在 的 全 球 性 流 行 病 的 流 感 病<br />
毒 毒 株 的 感 染 的 结 合 分 子 。 重 要 的 是 , 目 前 可 以 预 期 利 用 本 发 明 的 结 合 分 子 对<br />
于 多 种 流 感 病 毒 毒 株 起 到 防 护 和 治 疗 作 用 , 因 为 己 经 揭 示 了 由 于 与 在 不 同 流 感<br />
病 毒 毒 株 的 HA 蛋 白 之 间 共 享 的 表 位 的 结 合 , 因 此 目 前 可 以 使 用 本 发 明 的 结 合 分<br />
子 在 这 些 毒 株 之 间 进 行 交 叉 中 和 作 用 。 这 是 特 别 有 利 的 , 因 为 在 感 染 之 前 或 者<br />
之 后 给 予 所 述 结 合 分 子 可 以 保 护 哺 乳 动 物 , 因 此 在 还 不 清 楚 所 述 感 染 是 否 由 基<br />
于 H1、H3、H5、H7 或 H9 的 毒 株 的 引 起 时 ( 在 发 病 的 早 期 阶 段 ) 也 起 到 如 此 作 用 。<br />
可 以 使 用 本 发 明 的 结 合 分 子 预 防 性 治 疗 或 者 感 染 时 治 疗 健 康 工 人 、 军 人 以 及 普<br />
通 人 群 。 潜 在 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 大 规 模 地 制 备 和 贮 存 , 因 为 其 提 供 了<br />
针 对 不 同 的 流 行 性 毒 株 的 保 护 作 用 , 且 对 于 为 将 来 可 能 发 生 的 流 感 爆 发 做 准 备<br />
是 有 利 的 。<br />
根 据 Kabat et al. (1991) 所 述 ,CDR 区 是 免 疫 学 感 兴 趣 的 蛋 白 质 的 序 列 。 在<br />
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本 发 明 的 实 施 方 案 中 , 结 合 分 子 可 包 含 本 文 揭 示 的 二 、 三 、 四 、 五 或 者 所 有 六<br />
个 CDR 区 。 优 选 地 , 本 发 明 的 结 合 分 子 包 含 本 文 揭 示 的 至 少 两 个 CDR。<br />
本 发 明 的 另 一 方 面 包 括 本 文 所 述 结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 如 果 变 体 能 与 亲 代<br />
结 合 分 子 竞 争 特 异 性 结 合 流 感 病 毒 或 其 蛋 白 片 段 , 则 认 为 该 变 体 分 子 是 本 发 明<br />
结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 换 句 话 说 , 所 述 功 能 变 体 仍 能 结 合 流 感 病 毒 或 其 片 段 。<br />
优 选 地 , 所 述 功 能 变 体 能 竞 争 性 特 异 性 结 合 由 亲 代 结 合 分 子 特 异 性 结 合 的 至 少<br />
两 ( 或 更 多 个 ) 不 同 的 流 感 病 毒 毒 株 或 其 片 段 。 此 外 , 如 果 某 分 子 对 于 亲 代 结 合<br />
分 子 对 其 具 有 中 和 活 性 的 流 感 病 毒 、 优 选 对 于 至 少 两 ( 或 多 个 ) 流 感 病 毒 毒 株 具<br />
有 中 和 活 性 , 则 认 为 该 分 子 是 本 发 明 结 合 分 子 的 功 能 变 体 。 功 能 变 体 包 括 但 不<br />
限 于 一 级 结 构 序 列 基 本 相 似 、 但 是 含 有 例 如 在 亲 代 结 合 分 子 中 未 发 现 的 体 外 或<br />
体 内 化 学 和 / 或 生 物 化 学 修 饰 的 衍 生 物 。 这 种 修 饰 包 括 乙 酞 化 、 酞 化 、 核 苷 酸 或<br />
者 核 苷 酸 衍 生 物 的 共 价 附 着 、 脂 质 或 者 脂 质 衍 生 物 的 共 价 附 着 、 交 联 、 二 硫 键<br />
形 成 、 糖 基 化 、 羟 基 化 、 甲 基 化 、 氧 化 、 聚 乙 二 醇 化 、 蛋 白 酶 解 加 工 、 磷 酸 化<br />
等 。 换 句 话 说 , 亲 代 结 合 分 子 的 氨 基 酸 和 / 或 核 苷 酸 序 列 中 的 修 饰 不 显 著 影 响 或<br />
改 变 由 所 述 核 苷 酸 序 列 编 码 的 或 者 含 有 所 述 氨 基 酸 序 列 的 所 述 结 合 分 子 的 结<br />
合 特 性 , 即 所 述 结 合 分 子 仍 能 识 别 并 结 合 其 靶 位 。<br />
所 述 功 能 变 体 可 以 具 有 保 守 序 列 修 饰 , 包 括 核 苷 酸 和 氨 基 酸 取 代 、 添 加 和<br />
缺 失 。 这 些 修 饰 可 以 通 过 本 领 域 己 知 的 标 准 技 术 导 入 , 例 如 定 向 诱 变 和 随 机 PCR<br />
介 导 的 诱 变 , 并 且 可 包 含 天 然 以 及 非 天 然 核 苷 酸 和 氨 基 酸 。<br />
保 守 氨 基 酸 取 代 包 括 其 中 氨 基 酸 残 基 由 具 有 相 似 结 构 或 者 化 学 性 质 的 另<br />
一 氨 基 酸 残 基 置 换 的 取 代 。 具 有 相 似 侧 链 的 氨 基 酸 残 基 的 家 族 己 经 在 本 领 域 中<br />
限 定 。 这 些 家 族 包 括 具 有 碱 性 侧 链 的 氨 基 酸 ( 例 如 赖 氨 酸 、 精 氨 酸 、 组 氨 酸 )、<br />
酸 性 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 天 冬 氨 酸 、 谷 氨 酸 )、 无 电 荷 极 性 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 天 冬 酞<br />
胺 、 谷 氨 酞 胺 、 丝 氨 酸 、 苏 氨 酸 、 酪 氨 酸 、 半 肤 氨 酸 、 色 氨 酸 )、 非 极 性 侧 链 氨<br />
基 酸 ( 例 如 甘 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 缬 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 异 亮 氨 酸 、 脯 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、<br />
甲 硫 氨 酸 )、 分 支 侧 链 氨 基 酸 ( 例 如 苏 氨 酸 、 缬 氨 酸 、 异 亮 氨 酸 ) 以 及 芳 香 侧 链 氨<br />
基 酸 ( 例 如 酪 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 色 氨 酸 )。 本 领 域 技 术 人 员 明 白 也 可 以 使 用 除 了<br />
上 述 家 族 之 外 的 其 它 氨 基 酸 残 基 家 族 分 类 方 式 。 另 外 , 变 体 可 具 有 非 保 守 的 氨<br />
基 酸 取 代 , 例 如 氨 基 酸 由 具 有 不 同 结 构 或 者 化 学 性 质 的 另 一 氨 基 酸 残 基 置 换 。<br />
相 似 的 小 变 异 也 可 包 括 氨 基 酸 缺 失 或 者 插 入 , 或 者 这 二 者 。 使 用 本 领 域 熟 知 的<br />
计 算 机 程 序 可 以 发 现 确 定 哪 些 氨 基 酸 残 基 可 以 被 取 代 、 插 入 或 者 缺 失 而 不 消 除<br />
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30<br />
免 疫 学 活 性 的 指 导 。<br />
此 外 , 功 能 变 体 可 包 含 氨 基 酸 序 列 在 氨 基 末 端 或 者 羧 基 末 端 或 者 这 两 端 的<br />
截 短 体 。 本 发 明 的 功 能 变 体 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 可 具 有 相 同 或 不 同 的 、 更 高 或<br />
更 低 的 结 合 亲 和 性 , 但 是 仍 能 结 合 流 感 病 毒 或 其 片 段 。 例 如 , 本 发 明 的 功 能 变<br />
体 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 对 于 流 感 病 毒 H5N1 或 其 片 段 可 具 有 增 加 或 降 低 的 结 合<br />
亲 和 性 。 优 选 地 , 可 变 区 包 括 但 不 限 于 构 架 区 、 高 变 区 、 特 别 是 CDR3 区 的 氨<br />
基 酸 序 列 被 修 饰 。 通 常 , 轻 链 和 重 链 可 变 区 包 含 三 个 高 变 区 , 包 括 三 个 CDR,<br />
以 及 更 保 守 的 区 域 , 即 所 谓 的 构 架 区 ((FR)。 高 变 区 包 含 来 自 CDR 的 氨 基 酸 残 基<br />
和 来 自 高 变 环 的 氨 基 酸 残 基 。 在 本 发 明 范 围 内 的 功 能 变 体 与 本 文 所 述 亲 代 结 合<br />
分 子 具 有 至 少 大 约 50% 至 大 约 99%、 优 选 至 少 大 约 60% 至 大 约 99%、 更 优 选 至 少<br />
大 约 70% 至 大 约 99%、 甚 至 更 优 选 至 少 大 约 80% 至 大 约 99%、 最 优 选 至 少 大 约<br />
90% 至 大 约 99%、 特 别 是 至 少 大 约 95% 至 大 约 99%, 以 及 特 别 是 至 少 大 约 97% 至<br />
大 约 99% 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 。 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 计 算 机 算 法 如 Gap 或 者<br />
Bestfit 可 用 于 最 佳 地 排 列 氨 基 酸 序 列 以 进 行 对 比 以 及 明 确 相 似 或 相 同 的 氨 基 酸<br />
残 基 。 功 能 变 体 可 以 通 过 使 用 本 领 域 己 知 的 普 通 分 子 生 物 学 方 法 改 变 亲 代 结 合<br />
分 子 或 其 一 部 分 而 获 得 , 所 述 方 法 包 括 但 不 限 于 易 错 PCR、 寡 核 苷 酸 指 导 的 诱<br />
变 、 定 点 诱 变 以 及 重 链 和 / 或 轻 链 改 组 法 。 在 一 个 实 施 方 案 中 , 本 发 明 的 功 能 变<br />
体 对 于 流 感 病 毒 具 有 中 和 活 性 。 所 述 中 和 活 性 与 亲 代 结 合 分 子 相 比 可 以 相 同 或<br />
者 更 高 或 更 低 。 此 后 , 当 使 用 术 语 ( 人 ) 结 合 分 子 时 , 其 也 涵 盖 所 述 ( 人 ) 结 合 分 子<br />
的 功 能 变 体 。<br />
作 为 本 发 明 的 优 选 方 式 , 所 述 的 结 合 分 子 是 单 克 隆 抗 体 , 优 选 它 包 括 人 源<br />
的 恒 定 区 ( 如 人 源 恒 定 区 IgH 序 列 和 IgKappa 序 列 )。 所 述 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗<br />
体 的 重 链 可 变 区 、 轻 链 可 变 区 以 及 位 于 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 的 互 补 决 定 区<br />
(CDR) 均 具 有 独 特 的 不 同 于 现 有 技 术 的 结 构 , 且 它 们 是 全 人 源 的 。<br />
本 发 明 包 括 : 具 有 所 述 单 克 隆 抗 体 的 相 应 氨 基 酸 序 列 的 单 克 隆 抗 体 , 具 有<br />
所 述 单 克 隆 抗 体 可 变 区 链 的 单 克 隆 抗 体 。 本 发 明 还 包 括 具 有 含 所 述 的 互 补 决 定<br />
区 (CDR) 的 轻 链 和 重 链 的 任 何 抗 体 , 以 及 CDR 区 与 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 的 CDR<br />
具 有 90% 以 上 ( 较 佳 地 95% 以 上 ) 的 同 源 性 的 任 何 抗 体 。<br />
抗 体 的 抗 原 结 合 特 性 可 由 位 于 重 链 和 轻 链 可 变 区 的 3 个 特 定 的 区 域 来 描<br />
述 , 称 为 互 补 决 定 区 (complementarity determining region,CDR), 所 述 的 CDR<br />
区 将 可 变 区 间 隔 成 4 个 框 架 区 域 (FR),4 个 FR 的 氨 基 酸 序 列 相 对 比 较 保 守 , 不 直<br />
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30<br />
接 参 与 结 合 反 应 。 这 些 CDR 形 成 环 状 结 构 , 通 过 其 间 的 FR 形 成 的 β 折 叠 在 空 间<br />
结 构 上 相 互 靠 近 , 重 链 上 的 CDR 和 相 应 轻 链 上 的 CDR 构 成 了 抗 体 的 抗 原 结 合 位<br />
点 。 可 以 通 过 比 较 同 类 型 的 抗 体 的 氨 基 酸 序 列 来 确 定 是 哪 些 氨 基 酸 构 成 了 FR 或<br />
CDR 区 域 。<br />
对 于 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 重 链 和 轻 链 序 列 , 可 以 用 常 规 方 法 测 定 。<br />
经 验 证 , 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 CDR 区 是 全 新 的 , 其 针 对 的<br />
是 一 个 独 特 的 流 感 病 毒 HA 蛋 白 上 的 抗 原 表 位 , 技 术 构 思 不 同 于 现 有 的 抗 流 感<br />
病 毒 抗 体 。 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 所 识 别 的 表 位 是 位 于 其 空 间 构 象 上<br />
的 表 位 。<br />
本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 是 全 人 源 的 , 其 重 链 、 轻 链 可 变 区 以 及 恒 定 区 均 来 源<br />
于 人 抗 体 。 因 此 , 其 在 具 有 特 别 优 异 的 识 别 和 中 和 流 感 病 毒 的 作 用 的 同 时 , 还<br />
具 有 免 疫 原 性 低 、 安 全 性 高 的 特 点 。<br />
在 本 发 明 的 实 施 例 中 , 本 发 明 人 从 接 种 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 裂 解 疫 苗<br />
(2009/Cal) 志 愿 者 体 内 获 得 外 周 血 单 个 核 细 胞 (PBMC), 使 用 CD19 + /IgG + /HA 为<br />
特 异 性 标 志 物 , 经 流 式 细 胞 仪 分 选 (FACS) 获 得 识 别 HA 蛋 白 特 异 性 B 细 胞 。 使 用<br />
单 细 胞 RT-PCR 技 术 (Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124), 获<br />
得 了 抗 体 基 因 并 在 293T 细 胞 中 进 行 表 达 获 得 全 人 单 克 隆 抗 体 3C4。ELISA 表 位<br />
分 析 得 知 这 株 抗 体 识 别 血 凝 素 HA 蛋 白 的 HA2 亚 基 ,HA2 在 不 同 种 属 流 感 病 毒 中<br />
具 有 保 守 性 , 表 明 这 株 抗 体 可 能 的 识 别 广 谱 性 。 微 中 和 实 验 证 明 此 抗 体 能 够 中<br />
和 A/California/7/2009 (H1N1),NYMCX-179A,A/Brisbane/59/2007 (H1N1),<br />
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2),A/Anhui/1/2005<br />
(H5N1),A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1),A/Guangzhou/333/1999 (H9N2) 流 感<br />
病 毒 , 表 明 此 株 抗 体 具 有 广 谱 中 和 活 性 , 在 临 床 上 具 有 预 防 和 治 疗 多 种 亚 型 流<br />
感 病 毒 感 染 的 潜 在 价 值 。<br />
另 一 方 面 , 本 发 明 包 括 免 疫 缀 合 物 , 即 包 含 本 文 所 述 至 少 一 个 结 合 分 子 以<br />
及 进 一 步 包 含 至 少 一 个 标 记 如 可 检 测 的 部 分 / 物 质 的 分 子 。 本 发 明 还 涉 及 本 发 明<br />
免 疫 缀 合 物 的 混 合 物 或 者 至 少 一 种 本 发 明 免 疫 缀 合 物 与 另 一 分 子 的 混 合 物 , 所<br />
述 另 一 分 子 如 治 疗 剂 或 者 另 一 结 合 分 子 或 免 疫 缀 合 物 。 本 发 明 的 免 疫 缀 合 物 可<br />
包 含 一 个 以 上 的 标 记 。 这 些 标 记 可 以 彼 此 相 同 或 不 同 , 并 且 可 以 与 结 合 分 子 非<br />
共 价 地 结 合 / 缀 合 。 所 述 标 记 也 可 以 通 过 共 价 键 与 人 结 合 分 子 直 接 结 合 / 缀 合 。<br />
或 者 , 所 述 标 记 可 以 通 过 一 或 多 种 连 接 化 合 物 与 所 述 结 合 分 子 结 合 / 缀 合 。 标 记<br />
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与 结 合 分 子 的 缀 合 技 术 为 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 。<br />
本 发 明 的 免 疫 缀 合 物 的 标 记 可 以 是 治 疗 剂 , 但 是 它 们 也 可 以 是 可 检 测 的 部<br />
分 / 物 质 。 适 于 治 疗 和 / 或 预 防 的 标 记 可 以 是 毒 素 或 者 其 功 能 部 分 、 抗 生 素 、 酶 、<br />
增 强 吞 噬 作 用 或 者 免 疫 刺 激 作 用 的 其 它 结 合 分 子 。 包 含 可 检 测 物 质 的 免 疫 缀 合<br />
物 可 诊 断 性 地 用 于 例 如 评 定 对 象 是 否 己 经 感 染 流 感 病 毒 毒 株 或 者 作 为 临 床 实<br />
验 程 序 的 一 部 分 监 测 流 感 病 毒 感 染 的 发 生 或 进 展 以 例 如 确 定 指 定 治 疗 方 案 的<br />
功 效 。 然 而 , 它 们 也 可 以 用 于 其 它 检 测 和 / 或 分 析 和 / 或 诊 断 目 的 。 可 检 测 的 部<br />
分 / 物 质 包 括 但 不 限 于 酶 、 辅 基 、 荧 光 材 料 、 发 光 材 料 , 生 物 发 光 材 料 、 放 射 性<br />
材 料 、 正 电 子 发 射 金 属 以 及 非 放 射 性 顺 磁 性 金 属 离 子 。 为 了 检 测 和 / 或 分 析 和 /<br />
或 诊 断 目 的 用 于 标 记 结 合 分 子 的 标 记 依 赖 于 使 用 的 特 定 检 测 / 分 析 / 诊 断 技 术 和 /<br />
或 方 法 例 如 免 疫 组 织 化 学 染 色 ( 组 织 ) 样 品 、 流 式 细 胞 计 量 术 、 激 光 扫 描 细 胞 计<br />
量 术 检 测 、 荧 光 免 疫 测 定 、 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (ELISA)、 放 射 免 疫 测 定 (RIA)、<br />
生 物 测 定 ( 例 如 吞 噬 作 用 测 定 )、 蛋 白 质 印 迹 应 用 等 。 对 于 本 领 域 已 知 的 检 测 / 分<br />
析 / 诊 断 技 术 和 / 或 方 法 合 适 的 标 记 为 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 。<br />
此 外 , 本 发 明 的 人 结 合 分 子 或 者 免 疫 缀 合 物 也 可 以 附 着 于 固 体 支 持 物 上 ,<br />
其 特 别 用 于 流 感 病 毒 HA 蛋 白 或 其 片 段 的 体 外 免 疫 测 定 或 者 纯 化 。 这 种 固 体 支 持<br />
物 可 以 是 多 孔 或 者 无 孔 的 、 平 面 或 非 平 面 的 。 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 与 标 记 序<br />
列 如 肤 融 合 以 便 于 纯 化 。 所 述 标 记 序 列 的 例 子 包 括 但 不 限 于 六 组 氨 酸 标 记 、 血<br />
凝 素 (HA) 标 记 、myc 标 记 或 者 flag 标 记 。 或 者 , 一 种 抗 体 可 以 与 另 一 种 抗 体 缀 合<br />
形 成 抗 体 异 源 缀 合 物 (heteroconjugate)。<br />
另 一 方 面 , 本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 与 一 或 多 个 抗 原 缀 合 / 附 着 。 优 选 地 , 这<br />
些 抗 原 是 由 给 予 了 结 合 分 子 - 抗 原 缀 合 物 的 对 象 的 免 疫 系 统 识 别 的 抗 原 。 所 述 抗<br />
原 可 以 彼 此 相 同 , 但 也 可 以 是 不 同 的 。 使 附 着 抗 原 和 结 合 分 子 的 缀 合 方 法 为 本<br />
领 域 所 熟 知 , 包 括 但 不 限 于 使 用 交 联 剂 。 本 发 明 的 结 合 分 子 结 合 流 感 病 毒 并 且<br />
附 着 于 结 合 分 子 的 抗 原 将 引 发 对 于 所 述 缀 合 物 的 有 力 T 细 胞 攻 击 , 最 终 导 致 流<br />
感 病 毒 的 破 坏 。<br />
除 了 通 过 直 接 或 间 接 ( 例 如 通 过 接 头 ) 缀 合 而 化 学 产 生 免 疫 缀 合 物 之 外 , 所<br />
述 免 疫 缀 合 物 可 以 作 为 融 合 蛋 白 而 产 生 , 所 述 融 合 蛋 白 包 含 本 发 明 的 结 合 分 子<br />
及 合 适 的 标 记 。 融 合 蛋 白 可 以 通 过 本 领 域 已 知 方 法 产 生 , 例 如 通 过 构 建 核 酸 分<br />
子 以 及 随 后 表 达 所 述 核 酸 分 子 而 重 组 产 生 , 所 述 核 酸 分 子 包 含 符 合 读 框 的 编 码<br />
结 合 分 子 的 核 苷 酸 序 列 以 及 编 码 合 适 标 记 的 核 苷 酸 序 列 。<br />
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30<br />
本 发 明 另 一 方 面 提 供 了 编 码 本 发 明 的 至 少 一 种 结 合 分 子 、 其 功 能 变 体 或 者<br />
免 疫 缀 合 物 的 核 酸 分 子 。 这 种 核 酸 分 子 可 以 用 作 中 间 物 以 进 行 克 隆 , 例 如 用 于<br />
如 上 述 的 亲 和 力 成 熟 方 法 中 。 在 一 个 优 选 的 实 施 方 案 中 , 所 述 核 酸 分 子 是 分 离<br />
或 纯 化 的 。DNA 分 子 的 序 列 可 以 用 常 规 技 术 , 或 利 用 杂 交 瘤 技 术 获 得 。<br />
本 领 域 技 术 人 员 将 意 识 到 这 些 核 酸 分 子 的 功 能 变 体 也 是 本 发 明 的 一 部 分 。<br />
功 能 变 体 是 这 样 的 核 酸 序 列 , 通 过 使 用 标 准 遗 传 密 码 可 以 将 其 直 接 翻 译 以 提 供<br />
与 从 亲 代 核 酸 分 子 中 翻 译 的 序 列 相 同 的 氨 基 酸 序 列 。<br />
一 旦 获 得 了 有 关 的 序 列 , 就 可 以 用 重 组 法 来 大 批 量 地 获 得 有 关 序 列 。 这 通<br />
常 是 将 其 克 隆 入 载 体 , 再 转 入 细 胞 , 然 后 通 过 常 规 方 法 从 增 殖 后 的 宿 主 细 胞 中<br />
分 离 得 到 有 关 序 列 。<br />
此 外 , 还 可 用 人 工 合 成 的 方 法 来 合 成 有 关 序 列 , 尤 其 是 片 段 长 度 较 短 时 。<br />
通 常 , 通 过 先 合 成 多 个 小 片 段 , 然 后 再 进 行 连 接 可 获 得 序 列 很 长 的 片 段 。<br />
目 前 , 已 经 可 以 完 全 通 过 化 学 合 成 来 得 到 编 码 本 发 明 的 结 合 分 子 ( 或 其 片<br />
段 , 或 其 衍 生 物 ) 的 DNA 序 列 。 然 后 可 将 该 DNA 序 列 引 入 本 领 域 中 已 知 的 各 种<br />
现 有 的 DNA 分 子 ( 或 如 载 体 ) 和 细 胞 中 。 此 外 , 还 可 通 过 化 学 合 成 将 突 变 引 入 本<br />
发 明 的 结 合 分 子 的 序 列 中 。<br />
本 发 明 还 涉 及 包 含 上 述 的 适 当 DNA 序 列 以 及 适 当 启 动 子 或 者 控 制 序 列 的<br />
载 体 。 这 些 载 体 可 以 用 于 转 化 适 当 的 宿 主 细 胞 , 以 使 其 能 够 表 达 蛋 白 质 。 优 选<br />
的 , 本 发 明 的 载 体 是 例 如 含 病 毒 启 动 子 的 质 粒 表 达 载 体 , 且 在 所 述 表 达 载 体 中<br />
分 别 插 入 了 抗 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 重 链 可 变 区 (VH) 与 恒 定 区 的 IgH( 来 自 人 源<br />
IgH 的 恒 定 区 ) 融 合 序 列 和 轻 链 可 变 区 VL 与 人 体 Igkappa ( 来 自 人 源 Igkappa 的 恒<br />
定 区 ) 融 合 序 列 。<br />
宿 主 细 胞 可 以 是 原 核 细 胞 , 如 细 菌 细 胞 ; 或 是 低 等 真 核 细 胞 , 如 酵 母 细 胞 ;<br />
或 是 高 等 真 核 细 胞 , 如 哺 乳 动 物 细 胞 。 代 表 性 例 子 有 : 细 菌 细 胞 如 大 肠 杆 菌 ,<br />
链 霉 菌 属 ; 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 ; 真 菌 细 胞 如 酵 母 ; 植 物 细 胞 ; 昆 虫 细 胞 如 果 蝇 S2<br />
或 Sf9; 动 物 细 胞 如 CHO、COS7、NSO 或 Bowes 黑 素 瘤 细 胞 等 。 特 别 适 用 于 本<br />
发 明 的 宿 主 细 胞 是 真 核 宿 主 细 胞 , 尤 其 是 哺 乳 动 物 细 胞 , 如 293 细 胞 。<br />
用 重 组 DNA 转 化 宿 主 细 胞 可 用 本 领 域 技 术 人 员 熟 知 的 常 规 技 术 进 行 。 当 宿<br />
主 为 原 核 生 物 如 大 肠 杆 菌 时 , 能 吸 收 DNA 的 感 受 态 细 胞 可 在 指 数 生 长 期 后 收<br />
获 , 用 CaCl 2 法 处 理 , 所 用 的 步 骤 在 本 领 域 众 所 周 知 。 另 一 种 方 法 是 使 用 MgCl 2 。<br />
如 果 需 要 , 转 化 也 可 用 电 穿 孔 的 方 法 进 行 。 当 宿 主 是 真 核 生 物 , 可 选 用 如 下 的<br />
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5<br />
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DNA 转 染 方 法 : 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 , 或 常 规 机 械 方 法 如 显 微 注 射 、 电 穿 孔 、 脂 质<br />
体 包 装 等 。<br />
获 得 的 转 化 子 可 以 用 常 规 方 法 培 养 , 表 达 本 发 明 的 结 合 分 子 。 根 据 所 用 的<br />
宿 主 细 胞 , 培 养 中 所 用 的 培 养 基 可 选 自 各 种 常 规 培 养 基 。 在 适 于 宿 主 细 胞 生 长<br />
的 条 件 下 进 行 培 养 。 当 宿 主 细 胞 生 长 到 适 当 的 细 胞 密 度 后 , 用 合 适 的 方 法 ( 如 温<br />
度 转 换 或 化 学 诱 导 ) 诱 导 选 择 的 启 动 子 , 将 细 胞 再 培 养 一 段 时 间 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 优 选 的 是 采 用 哺 乳 动 物 细 胞 来 生 产 , 哺 乳 动 物 细 胞 通 常<br />
需 要 在 含 血 清 的 培 养 基 中 进 行 培 养 。 需 要 对 细 胞 进 行 无 血 清 的 适 应 过 程 后 , 方<br />
可 让 细 胞 在 无 血 清 培 养 基 中 正 常 的 生 长 。<br />
如 果 需 要 , 可 利 用 其 物 理 的 、 化 学 的 和 其 它 特 性 通 过 各 种 分 离 方 法 分 离 和<br />
纯 化 重 组 的 蛋 白 。 这 些 方 法 是 本 领 域 技 术 人 员 所 熟 知 的 。 这 些 方 法 的 例 子 包 括<br />
但 并 不 限 于 : 常 规 的 复 性 处 理 、 用 蛋 白 沉 淀 剂 处 理 ( 盐 析 方 法 )、 离 心 、 渗 透 破<br />
菌 、 超 声 处 理 、 超 离 心 、 分 子 筛 层 析 ( 凝 胶 过 滤 )、 吸 附 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、<br />
高 效 液 相 层 析 (HPLC) 和 其 它 各 种 液 相 层 析 技 术 及 这 些 方 法 的 结 合 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 也 可 以 在 转 基 因 非 人 哺 乳 动 物 如 兔 、 山 羊 或 者 牛 中 产<br />
生 , 并 且 分 泌 进 例 如 其 乳 中 。<br />
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30<br />
药 物 组 合 物<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 可 用 于 制 备 抑 制 流 感 病 毒 的 组 合 物 。<br />
基 于 本 发 明 的 新 发 现 , 还 提 供 了 一 种 可 抑 制 流 感 病 毒 或 流 感 病 毒 感 染 相 关<br />
疾 病 的 组 合 物 , 其 包 含 : 有 效 量 的 本 发 明 所 述 的 结 合 分 子 ; 以 及 药 学 上 可 接 受<br />
的 载 体 。<br />
本 文 所 用 的 术 语 “ 药 学 上 可 接 受 的 ” 是 指 当 分 子 本 体 和 组 合 物 适 当 地 给 予<br />
动 物 或 人 时 , 它 们 不 会 产 生 不 利 的 、 过 敏 的 或 其 它 不 良 反 应 。 本 文 所 用 的 “ 药<br />
学 上 可 接 受 的 载 体 ” 应 当 与 本 发 明 的 结 合 分 子 相 容 , 即 能 与 其 共 混 而 不 会 在 通<br />
常 情 况 下 大 幅 度 降 低 组 合 物 的 效 果 。<br />
可 作 为 药 学 上 可 接 受 的 载 体 或 其 组 分 的 一 些 物 质 的 具 体 例 子 是 糖 类 , 如 乳<br />
糖 、 葡 萄 糖 和 蔗 糖 ; 淀 粉 , 如 玉 米 淀 粉 和 土 豆 淀 粉 ; 纤 维 素 及 其 衍 生 物 , 如 羧<br />
甲 基 纤 维 素 钠 、 乙 基 纤 维 素 和 甲 基 纤 维 素 ; 西 黄 蓍 胶 粉 末 ; 麦 芽 ; 明 胶 ; 滑 石 ;<br />
固 体 润 滑 剂 , 如 硬 脂 酸 和 硬 脂 酸 镁 ; 硫 酸 钙 ; 植 物 油 , 如 花 生 油 、 棉 籽 油 、 芝<br />
麻 油 、 橄 榄 油 、 玉 米 油 和 可 可 油 ; 多 元 醇 , 如 丙 二 醇 、 甘 油 、 山 梨 糖 醇 、 甘 露<br />
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糖 醇 和 聚 乙 二 醇 ; 海 藻 酸 ; 乳 化 剂 , 如 Tween®; 润 湿 剂 , 如 月 桂 基 硫 酸 钠 ;<br />
着 色 剂 ; 调 味 剂 ; 压 片 剂 、 稳 定 剂 ; 抗 氧 化 剂 ; 防 腐 剂 ; 无 热 原 水 ; 等 渗 盐 溶<br />
液 ; 和 磷 酸 盐 缓 冲 液 等 。<br />
本 发 明 的 组 合 物 可 根 据 需 要 制 成 各 种 剂 型 , 并 可 由 医 师 根 据 患 者 种 类 、 年<br />
龄 、 体 重 和 大 致 疾 病 状 况 、 给 药 方 式 等 因 素 确 定 对 病 人 有 益 的 剂 量 进 行 施 用 。<br />
给 药 方 式 例 如 可 以 采 用 注 射 或 其 它 治 疗 方 式 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 可 以 以 未 分 离 的 或 者 分 离 的 形 式 使 用 。 此 外 , 本 发 明 的<br />
结 合 分 子 可 以 单 独 应 用 或 者 于 包 含 至 少 一 种 本 发 明 的 结 合 分 子 ( 或 其 变 体 或 片<br />
段 ) 的 混 合 物 中 应 用 。 换 句 话 说 , 所 述 结 合 分 子 可 以 组 合 应 用 , 例 如 作 为 包 含 两<br />
或 更 多 种 本 发 明 的 结 合 分 子 、 其 变 体 或 片 段 的 药 物 组 合 物 。 例 如 , 具 有 不 同 但<br />
互 补 活 性 的 结 合 分 子 可 以 组 合 在 一 个 治 疗 方 案 中 以 达 到 希 望 的 预 防 、 治 疗 或 诊<br />
断 作 用 , 但 是 或 者 也 可 以 将 具 有 相 同 活 性 的 结 合 分 子 组 合 在 一 个 治 疗 方 案 中 以<br />
达 到 希 望 的 预 防 、 治 疗 或 诊 断 作 用 。 任 选 地 , 所 述 混 合 物 进 一 步 包 含 至 少 一 种<br />
其 它 治 疗 剂 。 优 选 地 , 所 述 治 疗 剂 如 MZ 抑 制 剂 ( 例 如 amantidine、 金 刚 乙 胺<br />
(rimantadine)) 和 / 或 神 经 氨 酸 酶 抑 制 剂 ( 例 如 扎 那 米 韦 ((zanamivir)、 奥 司 他 韦<br />
(oseltamivir)) 可 用 于 预 防 和 / 或 治 疗 流 感 病 毒 感 染 。<br />
所 述 药 物 组 合 物 可 包 含 两 或 多 个 对 于 流 感 病 毒 具 有 中 和 活 性 的 结 合 分 子 。<br />
在 一 个 实 施 方 案 中 , 当 组 合 应 用 时 , 所 述 结 合 分 子 呈 现 协 同 中 和 活 性 。 换 句 话<br />
说 , 所 述 组 合 物 包 含 至 少 两 种 具 有 中 和 活 性 的 结 合 分 子 , 特 征 在 于 所 述 结 合 分<br />
子 在 中 和 流 感 病 毒 中 起 协 同 作 用 。 如 本 文 所 用 , 术 语 “ 协 同 ” 是 指 当 组 合 应 用<br />
时 , 结 合 分 子 的 组 合 作 用 高 于 单 独 应 用 时 的 加 合 作 用 。 所 述 协 同 作 用 的 结 合 分<br />
子 可 以 结 合 流 感 病 毒 的 相 同 或 不 同 片 段 上 的 不 同 结 构 。 计 算 协 同 作 用 的 方 式 是<br />
通 过 组 合 指 数 计 算 。 组 合 指 数 (CI) 的 概 念 己 经 由 Chou and Talalay (1984) 描 述 。<br />
所 述 组 合 物 也 可 包 含 具 有 中 和 活 性 的 一 种 结 合 分 子 以 及 一 种 非 中 和 性 流 感 病<br />
毒 特 异 性 结 合 分 子 。 所 述 非 中 和 性 及 中 和 性 流 感 病 毒 特 异 性 结 合 分 子 在 中 和 流<br />
感 病 毒 H5N1 中 也 可 以 协 同 作 用 。<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 或 药 物 组 合 在 用 于 人 体 之 前 可 以 在 合 适 的 动 物 模 型 系<br />
统 中 检 测 。 这 种 动 物 模 型 系 统 包 括 但 不 限 于 小 鼠 、 雪 貂 (ferret) 和 猴 。 感 病 毒 流<br />
感 病 毒 中 也 可 以 协 同 作 用 。<br />
可 以 调 整 给 药 方 案 以 提 供 最 佳 的 所 需 应 答 ( 例 如 治 疗 应 答 )。 合 适 的 剂 量 范<br />
围 可 例 如 是 0.1-100mg/kg 体 重 , 优 选 0.5-15mg/kg 体 重 。 此 外 , 例 如 可 以 给 予<br />
-12-
5<br />
一 次 推 注 、 随 时 间 给 予 多 次 分 开 剂 量 或 者 根 据 治 疗 情 况 的 紧 急 性 而 可 以 按 比 例<br />
降 低 或 增 加 剂 量 。 本 发 明 的 分 子 和 组 合 物 优 选 是 无 菌 的 。 使 得 这 些 分 子 和 组 合<br />
物 无 菌 的 方 法 为 本 领 域 所 熟 知 。 用 于 诊 断 、 预 防 和 / 或 治 疗 的 其 它 分 子 可 以 以 与<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 相 似 的 给 药 方 案 给 予 。 如 果 单 独 给 予 其 它 分 子 , 则 可 以 在 给<br />
予 本 发 明 的 一 或 多 种 人 结 合 分 子 或 药 物 组 合 物 之 前 、 同 时 或 者 之 后 给 予 患 者 。<br />
对 于 人 患 者 的 精 确 给 药 方 案 通 常 在 临 床 实 验 期 间 挑 选 出 。<br />
10<br />
15<br />
20<br />
25<br />
30<br />
检 测 试 剂 和 试 剂 盒<br />
本 发 明 的 结 合 分 子 可 用 于 制 备 检 测 流 感 病 毒 的 试 剂 或 试 剂 盒 。<br />
如 本 文 所 用 , 术 语 “ 待 测 样 品 ” 涵 盖 了 多 种 样 品 类 型 , 包 括 生 物 学 来 源 的<br />
血 液 及 其 它 体 液 样 品 , 实 体 组 织 样 品 如 活 检 组 织 样 品 或 者 组 织 培 养 物 , 或 者 衍<br />
生 自 其 中 的 细 胞 或 者 其 后 代 。 该 术 语 还 包 括 在 获 得 后 已 经 通 过 任 何 方 式 处 理 的<br />
样 品 , 例 如 用 试 剂 处 理 、 溶 解 、 或 者 富 集 某 些 成 分 如 蛋 白 质 或 者 多 核 苷 酸 。 该<br />
术 语 涵 盖 了 得 自 任 何 物 种 的 各 种 临 床 样 品 , 也 包 括 培 养 的 细 胞 、 细 胞 上 清 和 细<br />
胞 溶 解 产 物 。<br />
以 所 述 的 结 合 分 子 为 基 础 , 可 制 备 方 便 、 快 速 且 准 确 地 检 测 流 感 病 毒 ( 如 甲<br />
型 流 感 病 毒 ; 更 特 别 地 如 甲 型 H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H9N2 病 毒 ) 的 试<br />
剂 盒 。<br />
因 此 , 本 发 明 提 供 了 一 种 用 于 检 测 样 品 中 是 否 存 在 流 感 病 毒 的 检 测 试 剂<br />
盒 , 该 试 剂 盒 中 含 有 本 发 明 的 抗 流 感 病 毒 的 结 合 分 子 。<br />
在 获 得 了 本 发 明 提 供 的 结 合 分 子 后 , 可 以 方 便 地 制 备 出 用 于 特 异 性 检 测 流<br />
感 病 毒 的 检 测 试 剂 盒 。<br />
作 为 本 发 明 的 一 种 检 测 方 式 , 采 用 间 接 ELISA 法 , 将 待 测 的 抗 原 包 被 于 固<br />
相 载 体 上 , 利 用 本 发 明 的 结 合 分 子 进 行 检 测 。<br />
作 为 本 发 明 的 一 种 优 选 方 式 , 所 述 的 结 合 分 子 是 抗 体 , 可 根 据 双 抗 夹 心 法<br />
的 原 理 来 检 测 。 双 抗 夹 心 法 常 规 的 做 法 是 将 一 抗 ( 如 本 发 明 的 单 克 隆 抗 体 ) 固 定<br />
于 载 体 , 然 后 使 一 抗 与 抗 原 反 应 , 洗 涤 后 再 与 二 抗 反 应 ( 所 述 的 二 抗 携 带 可 检 测<br />
信 号 , 或 可 与 携 带 可 检 测 信 号 的 物 质 结 合 ), 最 后 进 行 化 学 发 光 或 酶 联 显 色 反 应<br />
检 测 信 号 。 双 抗 夹 心 法 特 别 适 用 于 具 有 两 个 或 两 个 以 上 表 位 的 抗 原 的 检 测 。<br />
为 了 在 检 测 时 更 方 便 , 所 述 试 剂 盒 中 除 了 含 有 本 发 明 的 结 合 分 子 以 外 , 还<br />
可 以 包 含 其 它 检 测 试 剂 或 辅 助 试 剂 , 所 述 的 辅 助 试 剂 例 如 是 ELISA 试 剂 盒 中 常<br />
-13-
5<br />
10<br />
15<br />
20<br />
规 使 用 的 一 些 试 剂 , 这 些 试 剂 的 特 性 以 及 它 们 的 配 制 方 法 均 是 本 领 域 技 术 人 员<br />
所 熟 知 的 , 如 显 色 剂 、 标 记 物 、 二 抗 、 抗 抗 体 、 增 敏 剂 等 。 本 领 域 人 员 应 理 解 ,<br />
各 种 变 化 形 式 的 检 测 试 剂 盒 均 是 包 含 在 本 发 明 中 的 , 只 要 在 其 中 利 用 了 本 发 明<br />
的 结 合 分 子 作 为 识 别 流 感 病 毒 的 试 剂 。<br />
此 外 , 在 所 述 试 剂 盒 中 还 可 包 含 使 用 说 明 书 , 用 于 说 明 其 中 装 载 的 试 剂 的<br />
使 用 方 法 。<br />
在 获 得 了 本 发 明 提 供 的 结 合 分 子 和 / 或 试 剂 盒 后 , 可 以 利 用 多 种 免 疫 学 相 关<br />
方 法 来 检 测 样 品 中 HA 蛋 白 或 其 含 量 , 从 而 得 知 待 测 样 品 的 供 体 是 否 感 染 流 感 病<br />
毒 , 这 些 方 法 均 被 包 含 在 本 发 明 中 。 较 佳 地 , 所 述 的 方 法 是 以 非 疾 病 诊 断 为 目<br />
的 的 。<br />
作 为 一 种 优 选 方 式 , 本 发 明 提 供 一 种 体 外 ( 非 诊 断 或 治 疗 性 地 ) 检 测 流 感 病<br />
毒 的 方 法 , 包 括 以 下 步 骤 :<br />
(a1) 将 待 测 样 品 包 被 于 固 相 载 体 ;<br />
(a2) 将 本 发 明 的 结 合 分 子 加 样 于 (a1) 的 固 相 载 体 , 从 而 使 待 测 样 品 中 的 流<br />
感 病 毒 与 结 合 分 子 结 合 , 形 成 带 有 “ 流 感 病 毒 - 本 发 明 的 结 合 分 子 ” 二 元 复 合 物<br />
的 固 相 载 体 ;<br />
(a3) 将 特 异 性 结 合 本 发 明 的 结 合 分 子 的 检 测 物 加 样 于 (a2) 的 固 相 载 体 , 形<br />
成 带 有 “ 流 感 病 毒 - 本 发 明 的 结 合 分 子 - 检 测 物 ” 三 元 复 合 物 的 固 相 载 体 ; 所 述<br />
的 检 测 物 上 携 带 一 标 记 物 ;<br />
(a4) 检 测 三 元 复 合 物 中 的 标 记 物 , 确 定 待 检 测 样 品 中 流 感 病 毒 的 存 在 与 否<br />
以 或 存 在 的 量 。<br />
按 照 上 述 方 法 , 只 要 设 置 已 知 浓 度 的 抗 原 对 照 , 制 作 浓 度 标 准 曲 线 , 通 过<br />
比 照 浓 度 标 准 曲 线 就 可 以 得 出 待 测 样 品 中 的 流 感 病 毒 含 量 。<br />
25<br />
30<br />
本 发 明 的 主 要 优 点 在 于 :<br />
(1) 提 供 了 一 种 具 有 全 新 的 结 合 分 子 , 其 是 全 人 源 的 , 与 其 它 动 物 源 性 ( 如<br />
鼠 源 性 ) 抗 流 感 病 毒 的 分 子 相 比 , 免 疫 原 性 大 大 减 少 , 且 亲 和 性 良 好 。 不 仅 治 疗<br />
效 果 好 , 而 且 副 作 用 低 。<br />
(2) 本 发 明 的 结 合 分 子 能 够 结 合 具 有 天 然 构 象 的 流 感 病 毒 血 凝 素 蛋 白 (HA)<br />
的 HA2 亚 基 , 能 够 阻 止 多 种 亚 型 流 感 病 毒 侵 染 易 感 细 胞 。<br />
-14-
5<br />
下 面 结 合 具 体 实 施 例 , 进 一 步 阐 述 本 发 明 。 应 理 解 , 这 些 实 施 例 仅 用 于 说<br />
明 本 发 明 而 不 用 于 限 制 本 发 明 的 范 围 。 下 列 实 施 例 中 未 注 明 具 体 条 件 的 实 验 方<br />
法 , 通 常 按 照 常 规 条 件 如 J. 萨 姆 布 鲁 克 等 编 著 , 分 子 克 隆 实 验 指 南 , 科 学 出 版<br />
社 ,2002 中 所 述 的 条 件 , 或 按 照 制 造 厂 商 所 建 议 的 条 件 。 除 非 另 外 说 明 , 否 则<br />
百 分 比 和 份 数 按 重 量 计 算 。<br />
除 非 另 行 定 义 , 文 中 所 使 用 的 所 有 专 业 与 科 学 用 语 与 本 领 域 熟 练 人 员 所 熟<br />
悉 的 意 义 相 同 。 此 外 , 任 何 与 所 记 载 内 容 相 似 或 均 等 的 方 法 及 材 料 皆 可 应 用 于<br />
本 发 明 中 。 文 中 所 述 的 较 佳 实 施 方 法 与 材 料 仅 作 示 范 之 用 。<br />
10<br />
15<br />
I. 材 料 和 方 法<br />
本 发 明 的 全 人 单 克 隆 抗 体 制 备 以 及 抗 体 特 性 分 析 过 程 分 为 两 部 分 : 单 细 胞<br />
RT-PCR 法 获 得 抗 体 基 因 以 及 抗 体 表 达 ; 以 及 抗 体 特 性 分 析 。<br />
具 体 过 程 如 下 :<br />
1、 外 周 血 单 核 细 胞 (PBMC) 的 获 得<br />
从 接 种 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 裂 解 疫 苗 (A/California/07/2009 (H1N1),<br />
简 称 2009/Cal) 志 愿 者 体 内 抽 取 外 周 血 , 采 用 常 规 Ficoll-Paque 密 度 梯 度 离 心 , 得<br />
到 10 7 以 上 个 外 周 血 单 核 细 胞 (PBMC)。<br />
20<br />
25<br />
30<br />
2、HA 特 异 性 记 忆 B 细 胞 分 选<br />
2.1、HA-His、HA1-Fc 载 体 构 建<br />
1. 取 得 目 的 基 因 模 板<br />
HA 的 GenBank 号 为 FJ966082.1( 由 TAKARA 公 司 全 基 因 合 成 该 目 的 基 因<br />
模 板 )。<br />
2. 引 物 的 设 计 与 合 成 , 加 入 酶 切 位 点 (EcoRI/XhoI);<br />
按 照 引 物 设 计 原 则 , 使 用 Primer premier5.0 软 件 设 计 引 物 , 引 物 由 上 海 生<br />
工 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成 。 序 列 分 别 为 :<br />
HA-SP:5’-CCGGAATTCTACTTCCGTTATGATCATC-3’<br />
HA-AS:5’-CCGCTCGAGTTAAATACATATTCTAC-3’<br />
HA1-SP:5’-CCGGAATTCGACACATTATGTATAGGTTATCA-3’<br />
HA1-AS:5’-CCGCTGGAGTCTAGATTGAATAGACGGGA-3’<br />
引 物 序 列 中 的 方 框 分 别 表 示 限 制 性 内 切 酶 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 位 点 。<br />
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5<br />
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15<br />
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25<br />
30<br />
3. 目 的 基 因 进 行 常 规 方 法 PCR 扩 增 ;<br />
按 照 以 下 50ul 体 系 加 入 各 反 应 物 并 混 合 均 匀<br />
2×Pfu Plus PCR Master Mix( 购 自 TIANGEN) 25µl<br />
引 物<br />
1+1ul<br />
模 板 1µl<br />
ddH 2 O 22µl<br />
将 加 好 的 反 应 体 系 按 下 列 反 应 条 件 进 行 PCR 扩 增 :94℃,5min;(94℃,<br />
45sec;55℃,45sec;72℃,2min;32 循 环 );72℃,5min;4℃, 终 止 。<br />
4. 扩 增 产 物 用 限 制 性 内 切 酶 EcoRⅠ(TAKARA) 和 XhoⅠ(TAKARA) 酶 切<br />
然 后 割 胶 回 收 ;<br />
5. pFastBac-HTb 质 粒 ( 购 自 Invitrogen) 使 用 限 制 性 内 切 酶 EcoR Ⅰ<br />
(TAKARA) 和 XhoⅠ(TAKARA) 酶 切 , 然 后 割 胶 回 收 ;<br />
6. 目 的 基 因 与 载 体 的 连 接 , 获 得 pFastBac-HA-His;<br />
7. 感 受 态 DH5α( 购 自 Transgen) 的 转 化 、 涂 板 、 挑 克 隆 、 摇 菌 ;<br />
8. 菌 液 PCR 验 证 ;<br />
9. 小 量 抽 提 质 粒 ( 试 剂 盒 购 自 TIANGEN);<br />
10. 测 序 , 经 BLAST 验 证 ,100% 匹 配 ;<br />
11. 感 受 态 DH10Bac 的 重 组 转 位 、 涂 板 、 挑 克 隆 、 摇 菌 ;<br />
12. 菌 液 PCR 验 证 , 采 用 M13 通 用 引 物 , 序 列 为 :<br />
M13-SP:5’- CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’<br />
M13-AS:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAAGG-3’<br />
13. 常 规 方 法 进 行 Bacmid 粘 粒 的 大 量 抽 提 与 纯 化 。<br />
1.2、HA-His、HA1-Fc 蛋 白 的 细 胞 表 达<br />
1.2.1 病 毒 包 装 , 脂 质 体 细 胞 转 染 (6 孔 板 )<br />
1.2.1.1 转 染 前 一 天 铺 板 ,3 孔 (9×10 5 个 / 孔 )。<br />
1.2.1.2 首 先 观 察 High Five 细 胞 , 细 胞 长 至 50-80% 可 以 转 染 。<br />
1.2.1.3 在 6 个 1.5 ml 离 心 管 中 各 加 入 100μl 的 Sf900 II SFM( 沿 管 壁 加 , 不 要<br />
有 气 泡 ),6 个 离 心 管 中 分 为 3 个 A 管 ,3 个 B 管 。<br />
1.2.1.4 在 B 管 中 加 入 10μl 的 脂 质 体 , 加 进 去 后 用 抢 轻 轻 吹 打 混 匀 。<br />
1.2.1.5 在 A 管 中 加 入 4μg 的 质 粒 (Bacmid 粘 粒 ), 同 样 用 移 液 枪 轻 轻 吹 打 混<br />
匀 。<br />
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5<br />
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15<br />
20<br />
25<br />
30<br />
1.2.1.6 待 前 面 两 步 全 部 加 完 后 , 在 用 手 指 轻 弹 一 下 , 保 证 充 分 混 匀 。<br />
1.2.1.7 用 微 量 移 液 器 将 A 管 中 的 液 体 全 部 转 移 至 B 管 中 , 吸 A 管 中 的 液 体<br />
时 , 注 意 用 抢 混 匀 , 吹 时 沿 着 管 壁 减 少 气 泡 的 产 生 , 转 移 至 B 管 中 后 在 用 微 量<br />
移 液 器 上 下 吹 打 几 次 , 保 证 混 匀 。<br />
1.2.1.8 静 置 15 分 钟 。<br />
1.2.1.9 取 1000ml 微 量 移 液 器 在 1.5ml 离 心 管 中 补 加 入 800μl Sf900 II SFM,<br />
共 约 1ml 左 右 。<br />
1.2.1.10 用 吸 管 吸 去 六 孔 板 之 前 的 培 液 , 用 微 量 移 液 器 沿 孔 壁 慢 慢 加 入 1ml<br />
的 混 合 物 ( 加 液 体 的 时 候 速 度 要 慢 ), 盖 上 盖 子 , 做 好 标 记 。<br />
1.2.1.11 放 入 37℃ 培 养 箱 继 续 培 养 。<br />
1.2.1.12 培 养 6-8 小 时 后 , 将 转 染 液 吸 去 , 重 新 换 新 鲜 的 培 养 液 (Sf900 II<br />
SFM)3ml。<br />
1.2.1.13 继 续 培 养 72 小 时 。<br />
1.2.1.14 72 小 时 后 , 开 始 收 细 胞 上 清 ( 第 一 代 重 组 杆 状 病 毒 ) 和 细 胞 裂 解 液 。<br />
3000rpm 离 心 5min, 将 细 胞 上 清 , 即 第 一 代 病 毒 冻 存 于 -70℃; 将 离 下 的 细 胞 加<br />
入 细 胞 裂 解 液 , 充 分 振 荡 使 细 胞 裂 解 , 或 超 声 若 干 次 (5 秒 一 次 ),100℃ 反 应 五<br />
分 钟 , 冻 存 于 -20℃。<br />
1.3、HA-His、HA1-Fc 蛋 白 的 纯 化<br />
1 前 期 预 处 理 :20mM PB(pH 5.89) 透 析 过 夜 ,0.45mm 孔 径 膜 抽 滤 ;<br />
2 纯 化 方 法 : 先 后 以 Q-FF 柱 和 SP 柱 ( 购 自 GE Healthcare) 串 联 纯 化 利 用 羟<br />
基 磷 灰 石 填 料 柱 ( 购 自 Bio-rad) 进 行 精 细 纯 化 ;<br />
3 Q-FF 与 SP 串 联 纯 化 后 , 用 SDS-PAGE 检 测 纯 化 效 果 , 如 图<br />
1A(SDS-PAGE) 和 B(Western Blot)。<br />
Q-FF 柱 和 SP 柱 串 联 纯 化 方 法 ( 吸 光 值 图 谱 见 下 图 ):<br />
1 平 衡 柱 子 , 使 用 Buffer A (Buffer A:20mM 磷 酸 钠 ,1.0mM EDTA,0.01%<br />
表 面 活 性 剂 -NP9,5% 丙 三 醇 ,pH 5.89) 进 行 平 衡 ,3ml/min 流 速 , 直 至<br />
吸 光 值 平 稳 , 约 10 个 柱 体 积 ;<br />
2 上 样 , 暂 停 纯 化 仪 , 将 进 液 管 从 Buffer A 中 取 出 , 插 入 预 处 理 好 的 样 本<br />
中 ,2ml/min 流 速 进 行 上 样 , 并 收 集 穿 透 ;<br />
3 再 平 衡 , 当 样 品 上 样 完 毕 时 , 将 进 液 管 取 出 , 放 入 Buffer A 中 ,2ml/min<br />
流 速 直 至 吸 光 值 再 次 平 稳 ;<br />
-17-
5<br />
10<br />
15<br />
20<br />
4 使 用 Buffer B(20mM 磷 酸 钠 ,0.03 % Tergitol( 表 面 活 性 剂 ),5% 丙 三 醇 ,<br />
pH 7.02) 洗 脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;<br />
5 使 用 Buffer C(20mM 磷 酸 钠 ,150mM NaCl,0.03% Tergitol,5% 丙 三 醇 ,<br />
pH 7.02) 洗 脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;<br />
6 最 后 用 0.5M 氢 氧 化 钠 清 洗 柱 子 上 的 所 有 杂 蛋 白 , 不 收 集 。<br />
羟 基 磷 灰 石 填 料 柱 纯 化 方 法 ( 吸 光 值 图 谱 见 下 图 ):<br />
7 平 衡 柱 子 , 使 用 buffer B 进 行 平 衡 ,3ml/min 流 速 , 直 至 吸 光 值 平 稳 , 约<br />
10 个 柱 体 积 ;<br />
8 上 样 , 暂 停 纯 化 仪 , 将 进 液 管 从 buffer B 中 取 出 , 插 入 预 处 理 好 的 样 本 中 ,<br />
2ml/min 流 速 进 行 上 样 , 并 收 集 穿 透 ;<br />
9 再 平 衡 , 当 样 品 上 样 完 毕 时 , 将 进 液 管 取 出 , 放 入 buffer B 中 ,2ml/min<br />
流 速 直 至 吸 光 值 再 次 平 稳 ;<br />
10 使 用 buffer D(40mM 磷 酸 钠 ,0.05% Tween-20,5% 丙 三 醇 ,pH 7.20) 洗 脱 ,<br />
并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;<br />
⑾ 使 用 buffer E(100mM 磷 酸 钠 ,0.05% Tween-20,5% 丙 三 醇 ,pH 7.20) 洗<br />
脱 , 并 收 集 洗 脱 样 本 , 直 至 吸 光 值 平 稳 ;<br />
⑿ 最 后 用 0.5M 氢 氧 化 钠 清 洗 柱 子 上 的 所 有 杂 蛋 白 , 不 收 集 。<br />
2.2 HA-His 生 物 素 化 标 记<br />
参 照 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin kit(Pierce) 试 剂 盒 操 作 手 册 , 将 HA-His 生 物<br />
素 标 记 。<br />
2.3 使 用 FITC-CD19/APC-IgG/Cy3-streptavidin-biotin-HA(FITC-CD19/APC-IgG<br />
购 自 BD,Cy3-streptavidin 购 自 Sigma) 为 标 志 物 , 经 流 式 细 胞 仪 获 得 特 异 性 B 细 胞<br />
至 96 孔 RT-PCR 板 , 每 孔 一 个 细 胞 , 获 得 HA 特 异 性 记 忆 B 细 胞 。<br />
25<br />
30<br />
3、 抗 体 基 因<br />
使 用 RT-PCR 和 Nested-PCR 技 术 (Nat Protoc. 2009;4(3):372-84), 获 得 抗 体 基<br />
因 。 连 接 p GEM-T Easy (Promega), 进 行 测 序 , 验 证 抗 体 基 因 。<br />
IgH、IgL 载 体 的 序 列 分 别 见 GenBank:FJ475055.1 和 GenBank:FJ475056.1。<br />
其 中 ,IgH 中 的 重 链 恒 定 区 核 苷 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 17):<br />
cggtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaagga<br />
ctacttccccgaacctgtgacggtctcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggac<br />
tctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacc<br />
-18-
5<br />
aaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagt<br />
cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc<br />
ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt<br />
gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccat<br />
cgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccagg<br />
tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc<br />
acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc<br />
atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga<br />
10<br />
重 链 恒 定 区 氨 基 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 18):<br />
RSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT<br />
KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR<br />
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEQKSLSLSPGK<br />
15<br />
其 中 ,IgL 中 的 轻 链 (Kappa 链 ) 恒 定 区 核 苷 酸 序 列 为 (SEQ ID NO: 19):<br />
Cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataa<br />
cttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca<br />
aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag<br />
ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag<br />
20<br />
Kappa 链 恒 定 区 氨 基 酸 序 列 (SEQ ID NO: 20):<br />
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ<br />
GLSSPVTKSFNRGEC<br />
25<br />
然 后 将 重 、 轻 链 基 因 分 别 连 接 表 达 载 体 IgH( 插 入 位 点 为 AgeI 和 SalI) 和<br />
IgL( 插 入 位 点 为 AgeI 和 BsiwI), 获 得 IgH-3E1H 和 IgL-3E1L。<br />
4、 抗 体 的 重 组 表 达<br />
脂 质 体 法 瞬 时 转 染 293T 细 胞 (ATCC), 进 行 全 人 抗 体 表 达 。<br />
30<br />
1) 在 转 染 前 一 天 将 1.0×10 6 细 胞 接 种 到 6 孔 细 胞 培 养 板 中 ;<br />
2) A 管 :500µl Opti-MEM + 4µg 带 有 重 链 基 因 的 IgH(IgH-3E1H) +4µg 带<br />
有 轻 链 基 因 的 IgL(IgL-3E1L);<br />
3) B 管 :500µl Opti-MEM + 20µl Lipofectamine Reagent;<br />
4) 静 置 5 分 钟 后 , 将 A 管 与 B 管 混 合 , 在 室 温 静 置 20 min;<br />
35<br />
5) A、B 管 混 合 物 加 入 细 胞 培 养 盘 中 ,37℃ 孵 育 6 h;<br />
6) 6 h 后 , 吸 除 含 有 Lipofectamine Reagent DNA 的 培 养 液 , 每 孔 加 入 2ml<br />
FreeStyle 293 Expression Medium;<br />
-19-
7) 72h 后 , 收 集 细 胞 上 清 ,4℃,3000rpm,5min。<br />
获 得 的 细 胞 上 清 用 于 进 行 后 续 细 胞 试 验 。<br />
5<br />
10<br />
15<br />
20<br />
5、 抗 体 浓 度 测 定<br />
ELISA 方 法 测 定 全 人 抗 体 浓 度 。<br />
1) 包 被 Goat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody( 购 自 Sigma) 于 ELISA 板 ,<br />
10µg/ml, 每 孔 100µl,4℃ 过 夜 ;<br />
2) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
3) 封 闭 :1% BSA, 每 孔 200µl,37℃,2h;<br />
4) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
5) 使 用 倍 比 稀 释 的 human IgG( 购 自 Sigma) 做 标 准 曲 线 , 浓 度 400 ng/ml、200<br />
ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml、6.25 ng/ml、0 ng/ml,100µl/<br />
孔 ; 全 人 抗 体 细 胞 上 清 稀 释 5000 倍 , 每 孔 100µl,37℃,2h;<br />
6) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific)-Peroxidase antibody( 购 自 Sigma),1:10000<br />
稀 释 , 每 孔 100µl,37℃,1h;<br />
8) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
9) 加 入 底 物 TMB(Sigma), 每 孔 100µl,37℃,15min, 避 光 反 应 ;<br />
10) 加 入 2M H 2 SO 4 , 每 孔 50µl;<br />
11) 测 定 OD450, 并 进 行 数 据 处 理 。<br />
25<br />
30<br />
6、 抗 原 特 异 性 检 测<br />
检 测 表 达 的 全 人 抗 体 是 否 识 别 HA 蛋 白 、HA1 蛋 白 、2009 甲 型 H1N1 流 感 病<br />
毒 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal) 和 2008-2009 季 节 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液<br />
(A/Brisbane/59/2007 (H1N1))。ELISA 进 行 检 测 , 分 别 包 被 HA-His、100℃5 分 钟<br />
热 变 性 HA-His、HA1-Fc、2009 甲 型 H1N1 流 感 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal) 和 2008-2009<br />
季 节 流 感 疫 苗 裂 解 液 (A/Brisbane/59/2007(H1N1))。<br />
1) 分 别 包 被 HA-His、 热 变 性 HA-His(100℃, 处 理 5min)、HA1-Fc、2009 甲<br />
型 H1N1 流 感 疫 苗 裂 解 液 (2009/Cal)( 购 自 华 兰 生 物 ) 和 2008-2009 季 节 流 感 疫 苗 裂 解<br />
液 A/Brisbane/59/2007(H1N1) ( 购 自 华 兰 生 物 ) 于 ELISA 板 ,10µg/ml, 每 个 样 品 两<br />
个 复 孔 , 每 孔 100µl,4℃ 过 夜 ;<br />
-20-
5<br />
10<br />
15<br />
2) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
3) 封 闭 :1% BSA, 每 孔 200µl,37℃,2h;<br />
4) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
5) 根 据 测 定 浓 度 , 调 整 全 人 抗 体 细 胞 至 相 同 浓 度 , 每 孔 100µl, 鼠 源 单 克 隆 抗<br />
体 S-95-7( 识 别 位 于 HA1 上 的 构 象 依 赖 表 位 , 其 保 藏 于 中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 ,<br />
保 藏 号 CCTCC NO:C201024) 为 阳 性 对 照 ,37℃,2h;<br />
6) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
7) Goat Anti-Human IgG (Fc specific) − Peroxidase antibody,1:10000 稀 释 , 每<br />
孔 100µl, 加 到 HA-His、 热 变 性 HA-His、2009 甲 型 H1N1 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液 和<br />
2008-2009 季 节 流 感 病 毒 疫 苗 裂 解 液 ELISA 板 ;Goat Anti-Human IgG (Fab specific)<br />
− Peroxidase antibody,1:10000 稀 释 , 每 孔 100µl, 加 到 HA1-Fc ELISA 板 ,37℃,<br />
1h;<br />
8) PBST 洗 板 ,3 次 ;<br />
9) 底 物 A 液 :B 液 =1:1, 每 孔 100µl, 37℃,15min, 避 光 反 应 ;<br />
10) 加 入 2M H 2 SO 4 , 每 孔 50µl;<br />
11) 测 定 OD450, 并 进 行 数 据 处 理 。<br />
20<br />
25<br />
30<br />
7、 抗 体 中 和 活 性 测 定<br />
1.1 微 中 和 试 验<br />
1) MDCK 细 胞 ( 购 自 ATCC) 铺 至 96 孔 板 (1-11 列 ,A-H 行 ),DMEM+10%FBS 培<br />
液 培 养 ,12h 后 生 长 至 90%, 备 用 。<br />
2) 血 清 处 理<br />
a) 56℃ 灭 活 30min。<br />
b) 加 9 份 PBS 至 终 浓 度 为 10 -1 稀 释 度 。<br />
3) 96 孔 板 , 处 理 好 的 血 清 用 DMEM+0.2%BSA 2× 梯 度 稀 释 (1-10 列 2 0 至 2 -9<br />
稀 释 ), 终 体 积 50µl/ 孔 。<br />
4) 每 孔 加 入 50µl 含 100 个 TCID50 病 毒 ( 病 毒 种 类 :A/California/7/2009 (H1N1),<br />
NYMCX-179A (H1N1),A/Brisbane/59/2007(H1N1),A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),<br />
A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2) , A/Anhui/1/2005 (H5N1) ,<br />
A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1),A/Guangzhou/333/1999 (H9N2))( 购 自 ATCC)( 预 先<br />
用 DMEM+0.2%BSA 稀 释 至 100TCID50/50µl。<br />
-21-
5<br />
10<br />
15<br />
20<br />
5) 每 块 板 包 括 对 照 : 病 毒 对 照 (PC):50µl DMEM 0.2%BSA + 50µl 病 毒 (11 列<br />
A-D); 细 胞 对 照 (NC):100µl DMEM 0.2%BSA(11 列 E-H); 阳 性 血 清 对 照 ; 阴 性 血<br />
清 对 照 。 每 份 血 清 至 少 重 复 两 组 。<br />
6) 37℃、5% CO 2 、1h, 使 血 清 与 病 毒 充 分 作 用 。<br />
7) MDCK 单 层 细 胞 吸 去 培 液 ,PBS 洗 两 遍 , 加 100µl DMEM+0.2%BSA+2µg/ml<br />
TPCK-trypsin( 购 自 Sigma)。<br />
8) 将 血 清 - 病 毒 孵 育 混 合 物 100µl 全 部 对 应 移 至 MDCK 细 胞 平 板 中 。<br />
9) 37℃,5%CO 2 ,20h;<br />
10) PBS 洗 一 遍 。 预 冷 的 80% 丙 酮 -PBS 溶 液 固 定 10min;<br />
11) anti-NP ELISA;<br />
1.2 ELISA<br />
1) 固 定 好 的 细 胞 板 PBS + 0.05% Tween 20 ( 漂 洗 液 ) 洗 3 遍 。<br />
2) 用 PBS + 1% BSA 0.1% Tween 20( 稀 释 液 ) 1:10000 稀 释 anti-NP(HRP) 抗<br />
体 ,50µl/ 孔 , 室 温 1 小 时 。<br />
3) 漂 洗 液 洗 6 遍 。<br />
4) 新 配 制 的 底 物 2 mg OPD(o-phenylenediamine, 邻 苯 二 胺 ) 加 入 到 4 ml 0.05 M<br />
柠 檬 酸 缓 冲 液 含 0.03% 过 硼 酸 钠 (0.05M phosphate citrate buffer,pH 5.0,containing<br />
0.03% sodium perborate, 现 用 现 配 ) 中 ,50µl/ 孔 , 室 温 5min。<br />
5) 2N H 2 SO 4 终 止 反 应 ,50µl/ 孔 。<br />
6) 分 光 光 度 计 490nm 读 板 。<br />
7) 计 算 :X = [(A490 PC 孔 的 平 均 ) +(A490 NC 孔 的 平 均 )]/2。 终 点 判 定 :A490
5<br />
10<br />
15<br />
20<br />
25<br />
30<br />
载 体 构 建 。<br />
3E1 重 链 可 变 区 基 因 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 1):<br />
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG<br />
AGACCCTGTCCCTCACGTGCAGTGTCTCTGGTGCTTCCATCAGTAGTTACT<br />
AC(CDR1)TGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAGTGG<br />
ATTGGGCGTTTCTATACCAGTGGGAGCCCC(CDR2)AACTACAACCCCTCC<br />
CTCAGGAGTCGAGTCACCATGTCGGTGGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC<br />
CCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTG<br />
CGAGAGAGGAGCACATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTACGTTAC(CDR3)T<br />
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA<br />
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 重 链 基 因 CDR1(SEQ<br />
ID NO: 5),CDR2(SEQ ID NO: 6),CDR3(SEQ ID NO: 7) 序 列 。<br />
3E1 重 链 可 变 区 氨 基 酸 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 2):<br />
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISSYY(CDR1)WIWIRQPAGKGL<br />
EWIGRFYTSGSP(CDR2)NYNPSLRSRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAV<br />
YYCAREEHITFGGVIVRY(CDR3)WGQGTLVTVSS<br />
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 重 链 氨 基 酸<br />
CDR1(SEQ ID NO: 8),CDR2(SEQ ID NO: 9),CDR3(SEQ ID NO: 10) 序 列 。<br />
3E1 轻 链 可 变 区 基 因 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 3):<br />
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGCATCTGTAGG<br />
AGACAGAGTCAGCATCACTTG(CDR1)CCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAG<br />
TTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGA<br />
TCTATAAGGCATCT(CDR2)AGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCA<br />
GCGGCAGTGGATCTGGGTCAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAG<br />
CCTGATGATTTTGCAATTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATCCGTGG<br />
ACG(CDR3)TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA<br />
其 中 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 轻 链 基 因 CDR1(SEQ ID NO: 11),CDR2(SEQ<br />
ID NO: 12),CDR3(SEQ ID NO: 13) 序 列 。<br />
3E11 轻 链 可 变 区 氨 基 酸 序 列 如 下 (SEQ ID NO: 4):<br />
DIQMTQSPATLSASVGDRVSITCRASQSISSW(CDR1)LAWYQQKPGKAP<br />
KLLIYKAS(CDR2)SLESGVPSRFSGSGSGSEFTLTISSLQPDDFAIYYCQQYNS<br />
-23-
YPWT(CDR3)FGQGTKVEIKR<br />
备 注 : 其 中 红 色 字 体 并 且 使 用 双 下 划 线 标 注 的 依 次 为 轻 链 氨 基 酸<br />
CDR1(SEQ ID NO: 14),CDR2(SEQ ID NO: 15),CDR3(SEQ ID NO: 16) 序 列 。<br />
5<br />
ELISA 结 果 表 明 成 功 表 达 了 全 人 抗 体 , 并 且 其 浓 度 为 200-300µg/ml。 因 表<br />
达 载 体 中 含 有 重 轻 链 的 恒 定 区 , 因 此 空 载 体 也 能 表 达 不 完 整 的 抗 体 , 见 图 5。<br />
10<br />
15<br />
20<br />
实 施 例 2、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 的 表 位 分 析<br />
ELISA 表 明 ,3E1 能 够 识 别 HA 蛋 白 , 不 识 别 热 变 性 HA 蛋 白 , 表 明 3E1 识 别<br />
的 表 位 为 空 间 构 象 , 但 是 3E1 不 识 别 HA1 蛋 白 ( 图 6), 而 HA 蛋 白 仅 由 HA1 和 HA2<br />
两 部 分 组 成 , 说 明 这 此 株 抗 体 结 合 位 点 位 于 HA2。 现 有 技 术 公 知 HA2 在 不 同 流<br />
感 病 毒 株 中 具 有 很 高 的 保 守 性 , 因 此 , 提 示 这 两 株 抗 体 具 有 识 别 流 感 病 毒 的 广<br />
谱 性 。S-95-7 为 鼠 源 特 异 性 识 别 2009 年 甲 型 流 感 病 毒 HA1 构 象 表 位 单 克 隆 抗 体 ,<br />
作 为 阳 性 对 照 ,Vector 为 阴 性 对 照 。<br />
实 施 例 3、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 识 别 流 感 病 毒 广 谱 性<br />
ELISA 结 果 表 明 ( 图 7),3E1 对 2009 年 甲 型 流 感 病 毒 (A/California/07/2009<br />
(H1N1) , Cal/07) 具 有 很 高 的 识 别 性 , 同 时 对 2008-2009 年 季 节 流 感 病 毒<br />
(A/Brisbane/59/2007 (H1N1),Bri/59) 也 具 有 很 强 的 结 合 特 性 。 表 明 这 株 全 人 单<br />
克 隆 抗 体 具 有 识 别 广 谱 性 。S-95-7 为 鼠 源 特 异 性 识 别 2009 年 甲 型 H1N1 流 感 病 毒<br />
HA1 构 象 表 位 单 克 隆 抗 体 , 作 为 阳 性 对 照 ,Vector 为 阴 性 对 照 。<br />
25<br />
30<br />
实 施 例 4、 重 组 表 达 获 得 的 抗 体 3E1 具 有 广 谱 中 和 性<br />
全 人 单 克 隆 抗 体 (3E1) 使 用 293T 细 胞 进 行 表 达 , 将 其 浓 度 调 整 为 1000µg/ml,<br />
进 行 对 比 稀 释 。 使 用 微 中 和 试 验 测 定 其 对 A/California/7/2009 (H1N1),<br />
NYMCX-179A (H1N1), A/Brisbane/59/2007(H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1),<br />
A/Jiangxi-Donghu/312/2006 (H3N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1),<br />
A/Turkey/Italy/1265/1999 (H7N1), A/Guangzhou/333/1999 (H9N2) 流 感 病 毒 的<br />
中 和 活 性 。<br />
实 验 表 明 ,3E1 不 仅 能 够 中 和 H1 家 族 流 感 病 毒 ( 图 8), 并 且 对 H3,H5,H7,<br />
H9 亚 型 流 感 病 毒 均 具 有 中 和 活 性 ( 图 9), 说 明 了 此 株 抗 体 的 广 谱 中 和 活 性 。3E1<br />
-24-
对 这 些 病 毒 的 中 和 活 性 呈 现 出 浓 度 梯 度 依 赖 性 。<br />
5<br />
在 本 发 明 提 及 的 所 有 文 献 都 在 本 申 请 中 引 用 作 为 参 考 , 就 如 同 每 一 篇 文 献<br />
被 单 独 引 用 作 为 参 考 那 样 。 此 外 应 理 解 , 在 阅 读 了 本 发 明 的 上 述 讲 授 内 容 之 后 ,<br />
本 领 域 技 术 人 员 可 以 对 本 发 明 作 各 种 改 动 或 修 改 , 这 些 等 价 形 式 同 样 落 于 本 申<br />
请 所 附 权 利 要 求 书 所 限 定 的 范 围 。<br />
-25-
序 列 表<br />
中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院<br />
一 种 抗 流 感 病 毒 广 谱 中 和 性 的 结 合 分 子<br />
112148<br />
20<br />
PatentIn version 3.3<br />
1<br />
363<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
1<br />
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60<br />
acgtgcagtg tctctggtgc ttccatcagt agttactact ggatctggat ccggcagccc 120<br />
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt ttctatacca gtgggagccc caactacaac 180<br />
ccctccctca ggagtcgagt caccatgtcg gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240<br />
aagctgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaggagcac 300<br />
attacgtttg ggggagttat cgtacgttac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360<br />
tca 363<br />
2<br />
121<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
2<br />
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu<br />
1 5 10 15<br />
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Tyr<br />
20 25 30<br />
Tyr Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile<br />
35 40 45<br />
Gly Arg Phe Tyr Thr Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg<br />
50 55 60<br />
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu<br />
65 70 75 80<br />
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala<br />
85 90 95<br />
Arg Glu Glu His Ile Thr Phe Gly Gly Val Ile Val Arg Tyr Trp Gly<br />
100 105 110<br />
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser<br />
115 120<br />
-1-
3<br />
324<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
3<br />
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcagc 60<br />
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agttggttgg cctggtatca gcagaaacca 120<br />
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180<br />
aggttcagcg gcagtggatc tgggtcagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240<br />
gatgattttg caatttatta ctgccaacag tataatagtt atccgtggac gttcggccaa 300<br />
gggaccaagg tggaaatcaa acga 324<br />
4<br />
108<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
4<br />
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly<br />
1 5 10 15<br />
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp<br />
20 25 30<br />
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile<br />
35 40 45<br />
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly<br />
50 55 60<br />
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro<br />
65 70 75 80<br />
Asp Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp<br />
85 90 95<br />
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg<br />
100 105<br />
5<br />
24<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
5<br />
ggtgcttcca tcagtagtta ctac 24<br />
6<br />
21<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
-2-
6<br />
ttctatacca gtgggagccc c 21<br />
7<br />
45<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
7<br />
gcgagagagg agcacattac gtttggggga gttatcgtac gttac 45<br />
8<br />
8<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
8<br />
Gly Ala Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr<br />
1 5<br />
9<br />
7<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
9<br />
Phe Tyr Thr Ser Gly Ser Pro<br />
1 5<br />
10<br />
15<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
10<br />
Ala Arg Glu Glu His Ile Thr Phe Gly Gly Val Ile Val Arg Tyr<br />
1 5 10 15<br />
11<br />
18<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
-3-
11<br />
cagagtcagc atcacttg 18<br />
12<br />
9<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
12<br />
aaggcatct 9<br />
13<br />
27<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
13<br />
caacagtata atagttatcc gtggacg 27<br />
14<br />
6<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
14<br />
Gln Ser Ile Ser Ser Trp<br />
1 5<br />
15<br />
3<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
15<br />
Lys Ala Ser<br />
1<br />
16<br />
9<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
16<br />
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr<br />
1 5<br />
-4-
17<br />
993<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
17<br />
cggtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60<br />
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtctcg 120<br />
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180<br />
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240<br />
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300<br />
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360<br />
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420<br />
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480<br />
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540<br />
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600<br />
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660<br />
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720<br />
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780<br />
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840<br />
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900<br />
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960<br />
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993<br />
18<br />
250<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
18<br />
Arg Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys<br />
1 5 10 15<br />
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr<br />
20 25 30<br />
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser<br />
35 40 45<br />
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser<br />
50 55 60<br />
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr<br />
65 70 75 80<br />
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys<br />
85 90 95<br />
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys<br />
100 105 110<br />
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro<br />
115 120 125<br />
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys<br />
130 135 140<br />
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp<br />
-5-
145 150 155 160<br />
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu<br />
165 170 175<br />
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu<br />
180 185 190<br />
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn<br />
195 200 205<br />
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly<br />
210 215 220<br />
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu<br />
225 230 235 240<br />
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys<br />
245 250<br />
19<br />
324<br />
DNA<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
19<br />
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60<br />
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120<br />
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180<br />
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240<br />
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300<br />
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324<br />
20<br />
107<br />
PRT<br />
智 人 (Homo Sapiens)<br />
20<br />
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu<br />
1 5 10 15<br />
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe<br />
20 25 30<br />
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln<br />
35 40 45<br />
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser<br />
50 55 60<br />
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu<br />
65 70 75 80<br />
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser<br />
85 90 95<br />
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys<br />
100 105<br />
-6-
说 明 书 附 图<br />
RNA 聚 合 酶<br />
病 毒 RNA<br />
图 1<br />
图 2 图 3<br />
浓 度<br />
图 4 图 5<br />
变 性 的<br />
图 6 图 7<br />
1
抑 制 率 (%)<br />
抑 制 率 (%)<br />
浓 度<br />
浓 度<br />
抑 制 率 (%)<br />
抑 制 率 (%)<br />
浓 度<br />
浓 度<br />
图 8<br />
抑 制 率 (%)<br />
抑 制 率 (%)<br />
浓 度<br />
浓 度<br />
抑 制 率 (%)<br />
浓 度<br />
浓 度<br />
浓 度<br />
图 9<br />
2