Valutazione dell'attivita antimicrobica e del meccanismo di azione di ...

Valutazione dell'attivita antimicrobica e del meccanismo di azione di
peptidi naturali al fine di un potenziale impiego terapeutico
Responsabile/i di progetto:
Petruzzelli Raffaele
Abstract
Le istatine possono essere considerate una famiglia di antibiotici naturali e potrebbero rappresentare un nuovo
agente terapeutico per la cura della candidosi, il cui agente infettivo è rappresentato principalmente da specie
della Candida albicans, che nell'uomo è infezione superficiale indotta da fattori traumatici o meccanici o da
immunodeficienza da infezione da HIV. Pochi farmaci sono disponibili per il trattamento della candidosi orale
o sistemica e l'uso intenso di questi agenti antifungini ha avuto come risultato un aumento della resistenza di
questa specie al trattamento con tali farmaci, soprattutto quelli a base di azolo. Al contrario, è stato dimostrato
che le istatíne sono efficaci nella terapia contro specie di Candida azolo-resistenti e ciò implica un
meccanismo d'azione differente rispetto ai farmaci antifungini azolo-derivati. L'assenza di tossicità delle
istatine verso le cellule umane e la loro efficacia nell'inibire la crescita di ceppi di lievito resistenti ai farmaci a
base di azolo sottolineano l'importanza della conoscenza dettagliata del loro meccanismo d'azione. Questi
studi potranno essere utili per la progettazione e la sintesi su base razionale di nuove molecole a basso peso
molecolare capaci di interagire selettivamente con bersagli molecolari indispensabili alla crescita batterica.
Sulla base di quanto esposto e considerata la forte potenzialità che le istatine hanno nel legare i metalli come
zinco, rame e nichel, la nostra unità di ricerca intende studiare tale interazioni e valutare se è correlabile con il
meccanismo d'azione antimicrobico o se è importante proprietà strutturale. Inoltre vogliamo studiare quali
sono i determinanti strutturali che sono alla base dell'attività inibitoria, già dimostrata per l'istatina-5, verso
cisteino-proteasi di origine batterica e se tale attività può essere correlata con le proprietà chelanti di tale
peptide. Sulla base dei risultati ottenuti ed in considerazione del fatto che le istatine non sono i soli peptidi
antimicrobici presenti nella saliva, cercheremo di valutare, in collaborazione con le unità di Pisa e Roma, se le
Istatine stesse o peptidi contenenti epitopi leganti metalli derivati dalla sequenza delle Istatine in associazione
con altre molecole peptidiche presenti nella saliva o no, hanno azione sinergica nei riguardi della attività
antimicrobica.
Recentemente la nostra unità ha messo in evidenza che un altro peptide ad attività antimicrobica,
l'epcidina-25, ha la capacità di interagire con i metalli per la presenza di un motivo strutturale (ATCUN
motif), simile a quello presente nella istatina-5. Siccome l'epcidina-25 presenta complessivamente
caratteristiche strutturali completamente diverse da quelle della istatina-5, e poichè per entrambi i peptidi non
si è ancora indagato come si esplica la attivita antibatterica, avvalendoci delle competenze della Unità di
Cagliari, intendiamo valutare se la loro attivita battericida o quella di peptidi derivati dalla loro sequenza
amminoacidica è il risultato di uno dei seguenti processi: i) variazioni della permeabilità di membrana
attraverso la formazione di pori o disintegrazione della membrana stessa; ii) interazione dei peptidi con gli
acidi nucleici ed interferenza con la sintesi del DNA o con la sintesi proteica; iii) legame dei peptidi ad altri
bersagli intracellulari con inibizione di funzioni vitali.
La ricerca si artícolerà nelle seguenti fasi:
I) progettazione e sintesi di peptidi a lunghezza variabile, derivati dalla sequenza amínoacidica delle principali
istatine e dalla epcidina, contenenti domini capaci di legare metalli o no;
2) studio della capacità di tali peptidi di legare i metalli (Cu, Ni, Zn) e caratterizzazione strutturale di tali
complessi;
3) valutazione della capacità dei peptidi e dei complessi peptide-metallo di interagire in vitro con
macromolecole biologiche quali proteine ed acidi nucleici;
4) valutazione della capacità che i peptidi ed i complessi peptide-metallo hanno di inibire la crescita microbica
ed eventuale loro interazione con specifici bersagli molecolari.
Le fasi del programma saranno le seguenti:
I) Sintesi di peptidi e studio del legame con i metalli.
La progettazione dei peptidi sarà effettuata sulla base della struttura primaria delle principali istatine e dei
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motivi strutturali potenzialmente capaci di interagire con i metalli. Potranno essere utilizzati peptidi
commerciali purificati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione su colonne a fase inversa C8 o C18
eluite con gradiente di acetonitrile. La purezza dei peptidi e la loro struttura primaria verrà confermata
attraverso microsequenziamento con la chimica di Edman e la spettrometria di massa.
La formazione dei complessi peptide-metalli ed in particolare la caratterizzazione strutturale dell' "ATCUN
motif" sarà effettuata utilizzando varie tecniche spettroscopiche. La spettroscopia nel visibile in un intervallo
di lunghezze d'onda tra 400 e 700 nm, sarà utilizzata per analizzare il legame con il Cu(II) ed il Ni(II). E' noto
infatti che le proteine che legano il rame sullo specifico motivo strutturale presentano un massimo di
assorbimento a 525 nm che è visibile a pH acido ed è mantenuto in un ampio spettro di pH. Proteine che
invece non posseggono il motivo presentano un massimo di assorbimento intorno a 600 nm che si sposta
intorno a 520 nm solo a pH> 10. Lo spettro di proteine che legano il nichel sul motivo strutturale presentano
invece un massimo di assorbimento a pH neutro intorno a 420 nm che è caratteristico della coordinazione
planare. Tali spettri di assorbimento verranno effettuati a concentrazione di peptide micromolare in presenza
di concentrazioni stechiometriche di metallo ed in funzione del pH. Si valuterà inoltre se l'interazione con i
metalli produce variazioni conformazionali dei peptidi attraverso l'analisi di spettri di dicroismo circolare
effettuati in funzione del pH e del solvente. Tali spettri saranno registrati in un intervallo di lunghezze d'onda
variabile tra 190 e 250 nm ed a concentrazione di peptide micromolare. La transizione tra strutture disordinate
e strutture ad alfa-elica sarà valutata dall'aumento in negativo dell'ellitticità a 207 nm e 222 nm. Si valuterà
anche se alcuni solventi organici come il trifluoroetanolo hanno influenza sulla stabilizzazione della struttura
secondaria.
II) Studio delle proprietà biologiche dei complessi peptide-metallo in relazione all'attività antimicrobica.
E' stato dimostrato da Pauling e collaboratori che i complessi tra il Cu(II) e peptidi corrispondenti a motivi
ATCUN, derivati dalla sequenza N-terminale della albumina di varie specie animali in presenza di ascorbato
hanno la capacità di uccidere cellule tumorali dell'ascite di Erlich. Inoltre è stato dimostrato che tali complessi
hanno la capacità di idrolizzare sia gli acidi nucleici che le proteine in presenza di ascorbato. Tale proprietà è
stata messa in relazione con la capacità che tali complessi hanno di produrre specie reattive dell'ossigeno
(ROS) come i radicali idrossilici. Anche i complessi peptide-nichel hanno la proprietà di scindere gli acidi
nucleici attraverso la produzione di radicali idrossilici in presenza di H2O2. Tali complessi causano anche
cross-linking delle proteine attraverso reazioni mediate dagli amminoacidi aromatici.
Poiché recentemente è stato dimostrato che il target intracellulare dell'Istatina-5 è il mitocondrio della cellula
fungina ed è stato anche dimostrato che i seguito a tale ingresso la concentrazione delle specie reattive
dell'ossigeno aumenta in maniera significativa, vogliamo studiare se in vitro complessi metallo-peptide
istatina-derivati o epcidina-derivati, hanno la capacita di produrre danno ossidativi, modificando
covalentemente le proteine o idrolizzando le proteine stesse e gli acidi nucleici.
Il sistema sperimentale in vitro sarà costituito da miscele di incubazione in tampone fosfato di peptide, Cu(II)
ed ascorbato a concentrazioni micromolari e le proprietà ossidative nei riguardi di peptidi e proteine saranno
evidenziate mediante la spettrometria di massa ed in particolare la ESI-MS. Ossidazioni a carico di specifici
aminoacidi saranno rivelate attraverso esperimenti di MS/MS.
Inoltre, in collaborazione con l'unità di Roma, sarà saggiata la capacità che i complessi istatina-nickel hanno
di interagire con gli acidi nucleici. Mack e Dervan [3,4] hanno per primi ingegnerizzato una proteina con un
motivo strutturale ATCUN e dimostrato la sua capacità di scindere il DNA.
L'interazione tra i metallopepetidi e gli acidi nucleici sarà valutata attraverso esperimenti di "mobility shift" su
gel nativi di poliacrilammideo mediante gel-elettroforesi e gli esperimenti di sissione effetuati in presenza di
complessi peptide-Ni ed agenti ossidanti come l'acido monoperossiftalico o acido ascorbico/H2O2 saranno
analizzati mediante gel elettroforesi di poliacrilammide al 20% seguita da autoradiografia.
Nella fase successiva i peptidi con specifiche proprietà saranno utilizzati per verificare la loro attività
fungicida contro specie resistenti (o non) della Candida e la loro capacità antimicrobica. In particolare saranno
saggiati contro isolati clinici di patogeni del cavo orale resistenti (o non) come A. actinomycetemcomitans, S.
mutans e P. gingivalis.
Inoltre poiché è noto che nella saliva sono presenti altri peptidi ad attività antimicrobica e poiché l'unità di
Pisa vuole purificare e caratterizzare la presenza di beta defensina-3 (HBD-3) nella saliva stessa, ci
proponiamo in collaborazione con tale unità e con l'unità di Roma di verificare se miscele costituite dalle
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istatine o da peptidi istatino-derivati ed altre peptidi ad attività antimicrobica, hanno attività antibiotica
potenziata contro i patogeni sopra nominati.
III) Studio della interazione dei peptidi selezionati con membrane batteriche e componenti della parete
attraverso metodiche prettamente biofisiche. In una prima fase si studierà l'azione dei peptidi su membrane
modello o componenti della parete (LPS e/o acido lipoteicoico),dinamica dei peptidi in membrane modello
studiata attraverso la fluorimetria e in una seconda fase si potrà studiare l'effetto morfo-strutturale dei peptidi
sui batteri integri mediante studi di microscopia confocale ed elettronica.
IV) Studio dell'attività inibitoria di peptidi salivari nei riguardi di enzimi proteolitici di origine batterica.
E' noto che l'istatina-5 può avere azione antibatterica indiretta, poiché è stata dimostrata la sua azione
inibitoria nei riguardi di enzimi proteolitici implicati nella degradazione dei tessuti e favorenti l'infiltrazione di
batteri patogeni nel cavo orale. Gli enzimi proteolitici inibiti appartengono alla famiglia delle cisteino-proteasi
o sono metallo-proteasi Ca++ o Zn++ dipendenti.
In un recente studio abbiamo dimostrato che il danno esercitato dall'Istatina-5 sui mitocondri purificati da
cellule di mammifero, non si esplica attraverso la attivazione della cascata apoptotica, perché il peptide non
provoca rilascio di citocromo c, inoltre abbiamo dimostrato che in vitro l'istatina-5 è in grado di inibire la
caspasi-3 umana.
Tale attività inibitoria può rappresentare un importante proprietà biologica di questo peptide anche in
considerazione del fatto che in C. albicans esiste una attività proteasica caspasi-simile che regola l'apoptosi
nel lievito.
Tenendo presente che le caspasi appartengono ala famiglia delle cisteino-proteasi, ci proponiamo di indagare
sul meccanismo di inibizione esercitato dalla istatina-5 o da peptidi derivati utilizzando caspasi ricombinanti
commerciali. Cercheremo di caratterizzare i parametri cinetici, il tipo di inibizione e quali aminoacidi sono
essenziali per l'espletamento di tale attività. Inoltre valuteremo se tale attività inibitoria può essere messa in
relazione alla capacità di chelare metalli esplicata da tali peptidi.
I risultati conseguiti potranno essere utilizzati per sintetizzare peptidi o peptidomimetici in grado di inibire
selettivamente enzimi appartenenti alla famiglia delle cisteino-proteasi o metalloproteasi.
Classificazione MIUR Scientifico-Disciplinare
05 - Scienze Biologiche
Biochimica
Biologia Molecolare
Classificazione MIUR Scientifico-Disciplinare
06 - Scienze Mediche
CHIRURGIA MAXILLOFACCIALE
MALATTIE ODONTOSTOMATOLOGICHE
MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA
Classificazione WIPO-IPC
CHEMISTRY; METALLURGY
ORGANIC CHEMISTRY (such compounds as the oxides, sulfides, or oxysulfides of carbon, cyanogen,
phosgene, hydrocyanic acid or salts thereof C01; products obtained from layered base-exchange silicates by
ion-exchange with organic compounds such as ammoniu
Tipologia del progetto di ricerca: Modello B
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