FRET intramolecolare - UniversitÃ degli Studi di Brescia

Università degli Studi di Brescia  

Corso di Oncologia Sperimentale  

PRINCIPI DI FLUORESCENZA E DI FRET  

Cose%a Ravelli  

19/10/10 

FLUORESCENZA  

energia 


• Fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa  ad una certa lunghezza  

d’onda (frequenza di eccitazione) ne emeJe un’altra a lunghezza d’onda superiore (frequenza  

di emissione)  

• In seguito all’assorbimento di energia gli eleJroni degli orbitali esterni si spostano ad un  

livello energeLco superiore (ECCITAZIONE) e tornano al livello energeLco originario liberando  

l’energia assorbita come radiazioni eleJromagneLche (EMISSIONE DI FOTONI)      

ECCITAZIONE A λ MINORE  

> ENERGIA  

EMISSIONE A λ MAGGIORE  

DECADIMENTO DI ENERGIA CON LIBERAZIONE  

DI FOTONI  


Luminescenza che decade subito dopo  

aver eliminato la radiazione eccitante  

10 ‐11  10 ‐9  sec  

FOSFORESCENZA  

Radiazione che conLnua ad essere  

emessa anche dopo aver eliminato  

la sorgente eccitante  

10 ‐3  10 ‐1  sec 

FLUOROCROMO  

molecola che possiede uno specifico speJro di emissione e che, una volta eccitata è  

in grado di emeJere luce in modo parLcolarmente efficiente  

RAGGIO  DI  STOKE:  differenza  tra  λ  della  luce  emessa  e  λ  della  luce  assorbita  

(solitamente poche decine di nm)   

FLUOROFORO  

gruppo  atomico  di  un  fluorocromo  che  può  essere  eccitato  ed  emeJere  luce  

aJraverso il fenomeno della fluorescenza 

DIAGRAMMA DI JABLONSKI  

1. ECCITAZIONE: un fotone di energia hνEX (di eccitazione) viene assorbito dal  

fluorocromo con la formazione di uno stato eccitato S1’ (singoleJo)  

2. STATO TEMPORANEAMENTE ECCITATO: tale stato si manLene per circa 10 ‐9  sec  

3. EMISSIONE DI FLUORESCENZA: si ha emissione di un fotone con energia hνEM (di  

emissione) ed il fluoroforo torna allo stato iniziale     

N.B. parte dell’energia viene dissipata durante lo stato temporaneamente eccitato per  

via di diversi fenomeni tra cui il QUENCHING 

FLUOROCROMI 

PARAMETRI CRITICI PER LA SCELTA DI UN FLUOROCROMO  

• Coefficiente di esLnzione: indica la densità ohca di una mole di fluorocromo in  

soluzione   

5‐Fluorescein (FITC) 73000   

Texas Red 116000   

Alexa Fluor 647 239000  

•  Efficienza  QuanLca  (in  parLcolare  dopo  coniugazione):  è  espressione  della  

probabilità di conversione dell’energia di eccitazione in emissione di fluorescenza  

Q= quan5 emessi/quan5 assorbi5 = N° fotoni emessi/N° fotoni assorbi5  

• Lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione; frequenze di eccitazione più corte  

di 250nm sono troppo energeLche  

• Stabilità ai fenomeni di FADING  

L’intensità della fluorescenza è direJamente proporzionale al  

coefficiente di esLnzione e all’efficienza quanLca 

FLUOROCROMI 

Marcatura di nucleo, mitocondri e citoscheletro 

Marcatura di nucleo, mitocondri e Golgi  

Marcatura di mitocondri e lisosomi 

FADING  

•Per FADING si intende un fenomeno di perdita di intensità di fluorescenza; esistono due  

principali fenomeni che portano a FADING:   

 QUENCHING (spegnimento):   

•    Dinamico:  per  collisione  molecolare  (principalmente  con  O2,  gruppi  alifaLci  ed  

aromaLci)   

•    StaLco:  per  formazione  di  un  complesso  non  ahvabile  con  un’altra  molecola  non  

fluorescente   

N.B.  Ai  fenomeni  di  quenching  apparLene  anche  il  FRET  (FLUORESCENCE  RESONANCE  

ENERGY TRANSFER)  

PHOTOBLEACHING (fotodecadimento): scomparsa irreversibile della fluorescenza dovuta  

ad un’eccessiva intensità della luce di sLmolazione  

AUTOFLUORESCENZA  

Nell’analisi di campioni biologici la fluorescenza può essere disLnta in:  

• FLUORESCENZA  PRIMARIA  (AUTOFLUORESCENZA)  che  è  dovuta  alla  natura  del  

campione  

• FLUORESCENZA SECONDARIA che è dovuta all’introduzione di fluorocromo nel sistema    

QUALSIASI OGGETTO BIOLOGICO COLPITO DA LUCE INCIDENTE  

EMETTE UN SEGNALE DI FLUORESCENZA MISURABILE A  

QUALSIASI LUNGHEZZA D’ONDA  

•  Dipende dal campione; varia a seconda del Lpo di cellula  

•  Generalmente prodoJa dalla fotoluminescenza di alcuni aminoacidi  

•  Minore è la lunghezza d’onda del raggio incidente maggiore sarà l’autofluorescenza  

•  Può essere ridoJa ma è INELIMINABILE (importanza del controllo negaLvo)   

GFP (Green Fluorescent Protein)  

•  Isolata dalla medusa Aequorea victoria nel 1955 da Osamu Shimomura  

•  Si eccita nell’UV o nel blu (470‐480 nm) ed emeJe nel verde (510 nm)  

•  Scoperta in seguito alla proteina equorina (proteina bioluminescente che emeJe nel blu)  

•  piccola proteina composta da 238 aa    

•  Il fluoroforo è composto dagli aa 65‐67 (Ser‐Tyr‐Gly) e si trova al centro della proteina  

•  Non è un enzima e non necessita di altre proteine per emeJere fluorescenza   

flouroforo 

GFPs  

• ULlizzata  per  la  prima  volta  come  reporter  cellulare in  vivo  da  Mar5n  Chalfie  in  neuroni  

meccanoceJori di C. elegans   

• Modificata in numerose varianL per oJenere diversi colori, più stabilità e più brillantezza  

(Roger Tsien) 

APPLICAZIONI DELLE GFP  

TAG  

INDICATORI di fenomeni  

biologici  

BRAINBOW 

GFP come TAG (1)  

ULlizzata al fine di marcare un parLcolare tessuto o linea cellulare  

PermeJe di seguire l’espressione genica in vivo  

• Neuroni meccanoceJori di C. elegans (Mar5n Chalfie) (promotore mec‐7)  

• Espressione ubiquitaria aJraverso l’uLlizzo di promotori forL come cmv o acLna  

• Espressione soJo controllo di promotori tessuto‐specifici  

N.B. GFP non è un enzima, non amplifica segnale. 

GFP come TAG (2)  

ULlizzata al fine di seguire l’espressione, la localizzazione e il desLno di una parLcolare proteina  

ULlizzata sia in vivo che in vitro  

• Creazione di una proteina di fusione in cui GFP è in frame con la sequenza della proteina  

di interesse  

• Espressione ubiquitaria aJraverso l’uLlizzo di promotori forL come cmv  

• Espressione soJo controllo del promotore specifico del gene 

MEMBRANA NUCLEARE  

YFPal C‐terminale di un receJore  

espresso sulla membrana nucleare  

MEMBRANA PLASMATICA  

YFP al N‐terminale di una proteina  

contenente un segnale per la  

membrana plasmaLca  

RETICOLO ENDOPLASMICO  

YFP fuso con sequenza di ritenzione  

nel RE 

GFP come INDICATORE di un fenomeno biologico   

• Analisi  dei  cambiamenL  di  pH  all’interno  di  organelli  cellulari  (lisosomi,  endosomi  e  

Golgi) aJraverso il fenomeno di quenching  

• Analisi  dei  cambiamenL  di  potenziale  di  membrana  aJraverso  la  fusione  di  GFP  con  

canali del potassio  

• FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 

FRET  

• PermeJe l’osservazione di interazioni molecola‐molecola nel range di nm  

• Trasferimento  di  energia  non  radiaLvo  da  un  fluorocromo  (donatore)  ad  un  altro  

(acce%ore) quando essi si trovano vicini tra loro (quenching)  

• Definito anche Förster Resonance Energy Transfer   

• Osservato per la prima volta proprio in Aequorea victoria tra aequorina e GFP 


• Quando  avviene  FRET  l’eccitazione  del  donatore  non  porta  solo  all’emissione  del  

donatore stesso ma anche all’eccitazione dell’acceJore  

• L’efficienza di FRET dipende sia dalla distanza tra donatore e acceJore (Raggio di Förster:  

distanza  alla  quale  metà  dell’energia  emessa  dal  donatore  si  trasferisce  all’acceJore  (di  

solito 3‐6 nm)) , sia dalla sovrapposizione dello speJro di emissione del donatore con lo  

speJro di eccitazione dell’acceJore  

DIAGRAMMA DI JABLONSKI 

REQUISITI OTTIMALI DEI FLUOROCROMI PER IL FRET  

• Massima separazione degli speJri di eccitazione  

• Sovrapposizione >30% tra lo speJro di emissione del donatore e lo speJro di eccitazione  

dell’acceJore  

• Separazione “ragionevole” degli speJri di emissione  

Fluorocromi più uLlizzaL per gli studi di FRET sono le GFP  

CFP/YFP 

Il fenomeno del CROSS‐TALK 


• Il  FRET  intramolecolare  avviene  quando  sia  

donatore che acceJore sono fusi con la stessa  

molecola  che  subisce  una  transizione  

(cambiamento di conformazione)  

L’efficienza  di  FRET  dipende  dall’orientamento  

relaLvo e dalla distanza tra donatore e acceJore  

• Il  FRET  intermolecolare  avviene  tra  una  

molecola  (Protein  A)  fusa  con  il  donatore  e  

un’altra  molecola  (Protein  B)  fusa  con  

l’acceJore.  Quando  le  due  proteine  

interagiscono si osserva il fenomeno di FRET   


• Alle  cellule  vengono  faJe  esprimere  le  

proteine  di  interesse  aJraverso  una  singola  

trasfezione  (intramolecolare)  o  una  cotrasfezione (intermolecolare)  

• Per osservare il fenomeno di FRET il campione  

viene  eccitato  nella  λ  di  eccitazione  del  

donatore   

• Si registra il segnale emesso dal campione sia  

nella  λ  di  emissione  del  donatore  che  

dell’acceJore  

Se  vi  sono  le  condizioni  ideali  si  osserva  una  

diminuzione  del  segnale  relaLvo  al  donatore  

ed un aumento di quello relaLvo all’acceJore  

APPLICAZIONI del FRET:  

• Interazioni proteina‐proteina  

• CambiamenL struJurali di una molecola  

• CambiamenL di concentrazione di ioni intracellulari (CaMeleons)  

• InvesLgare evenL downstream a signalling di secondi messaggeri  

• Studio della struJura, della conformazione e dell’ibridazione di acidi nucleici (anche Real  

Time PCR) 

CaMeleon: valutazione del Calcio intracellulare (INTERMOLECOLARE)  

• Calmodulina‐CFP (proteina che lega il Ca ++ )  

• M13‐YFP (dominio che lega CaM isolato da “smooth muscle light chain kinase”)  

• In presenza di alL livelli di Ca (pannello a destra), le due proteine interagiscono e si osserva un  

aumento di FRET (SCALA COLORE).  

• Fenomeno reversibile  

CFP ‐ N term CaM  

+  

M13 C term ‐ YFP  

EFFICIENZA DI FRET  

Tsien et Miyawaki, 1998 

CaMeleon: valutazione del Calcio intracellulare (INTRAMOLECOLARE)  

CFP‐ N term Calmodulina‐ 2 Gly‐ C term M13‐ YFP  

• Singolo  costruJo  con  CaM  ed  M13  

separaL da un linker di Glicine  

• Glicina ha minore ingombro sterico e  

permeJe maggiore ripiegamento  

• Rapporto stechiometrico 1:1  

• Fenomeno reversibile  

EFFICIENZA DI FRET:  

rapporto tra emissione  

acceJore e donatore  

Pollock and Heim, 1997 

Biosensori per l’ahvità di proteasi  

• Creazione di un costruJo contenente le due proteine fluorescenL distanziate dal sito di  

taglio per una parLcolare proteasi ( per es. Caspasi 3)  

• In  assenza  di  ahvità  proteasica  il  sensore  mostra  alta  efficienza  di  FRET  dovuta  alla  

breve distanza tra le due proteine  

• L’ahvazione  dell’enzima  porta  all’allontanamento  delle  due  proteine  ed  a  una  

diminuzione del FRET  

• Possono essere creaL diversi sensori a seconda dell’ahvità proteasica di interesse  

• Fenomeno irreversibile 

PHOCUS: sensori per la fosforilazione proteica  

• Creazione di un costruJo contenente le  

due  proteine  fluorescenL  distanziate  dal  

sito  di  fosforilazione  di  interesse  ed  il  

dominio  che  riconosce  tale  sito  

fosforilato  

• In  assenza  di  fosforilazione  il  sensore  

mostra bassa efficienza di FRET  

• In seguito a fosforilazione la proteina si  

ripiega e l’efficienza di FRET aumenta  

• Possono  essere  creaL  diversi  sensori  a  

seconda della fenomeno di fosforilazione  

di interesse (ReceJore insulina, Akt/PKB,  

Src..)  

• Possibilità  di  osservare  una  parLcolare  

localizzazione del fenomeno  

• In  caso  di  ahvità  fosfatasica  i  livelli  di  

FRET diminuiscono: fenomeno reversibile  

• Possibilità  di  aggiungere  un  sito  di  

localizzazione sub‐cellulare  

Phocus2pp: IRS‐1 lega il receJore per l’insulina e viene  

fosforilato nei ruffles di membrana  

Sato et al., 2004 

Analisi della dimerizzazione di receJori di membrana  

• Analisi  della  omo‐dimerizzazione  del  VEGFR2;  receJore  Lrosino  chinasico  per  il  faJore  

angiogeneLco VEGF  

• Cotrasfezione con VEGFR2‐CFP e VEGFR2‐YFP  

• Quando il receJore dimerizza le due proteine fluorescenL si trovano vicine e l’efficienza di  

FRET aumenta  

• Problema delle dimerizzazioni donatore‐donatore e acceJore‐acceJore  

VANTAGGI E SVANTAGGI  

• RelaLvamente poco costoso  

• Molto efficiente nella valutazione dei cambiamenL di distanza tra molecole  

• Sono neccessarie poche molecole per osservare il fenomeno  

• Analisi relaLvamente veloce  

• AVVIENE  IN  CONDIZIONI  MOLTO  STRINGENTI  SIA  PER  DISTANZA  CHE  PER  

ORIENTAMENTO  

• Se si misura l’allontanamento tra due molecole non si può dire quale delle due si muove  

• Stechiometria 1:1 

COME FARE FRET  

• Esistono numerosi metodi sviluppaL per la valutazione del FRET  

• Per l’analisi del FRET tra proteine fluorescenL derivanL dalla GFP i metodi più uLlizzaL  

sono 4:  

SensiLzed emission  

Acceptor Photobleaching  

Fluorescence LifeTime Imaging (FLIM)  

Imaging speJrale 

SensiLzed Emission  

• Metodo più semplice per fare FRET  

• Si  eccita  nella  λ  del  donatore  e  si  registra  sia  donatore  che  acceJore  in  due  canali  

differenL  

• Esiste crosstalk tra i due canali (gli speJri si sovrappongono) quindi i valori di efficienza  

di FRET vanno aggiustaL sulla base di un algoritmo specifico per ogni coppia di FRET  

• Usato in FRET dinamici quando le variazioni sono notevoli come nel caso dei CaMeleon  

• ESEMPI: CaMeleon, omo‐dimerizzazione di VEGFR2  

Non è una vera immagine:  

codice colore che indica il  

valore calcolato di efficienza  

di FRET   

• Non molto sensibile, molL falsi negaLvi  

• Difficile  da  uLlizzare  quando  la  stechiometria  Don:Acc=1:1  come  nel  caso  di  FRET  

intramolecolare 

Acceptor Photobleaching o Donor Dequenching  

• Alla base del metodo c’è il conceJo che il donatore è soggeJo a quenching in caso di FRET  

• Distruggendo la fluorescenza dell’acceJore la fluorescenza del donatore aumenta  

• È importante assicurarsi che il bleaching dell’acceJore non danneggi anche il donatore  

• L’efficienza di FRET si calcola: E F = (I don  a€er – I don  before) / I don  a€er  

• Grande svantaggio: metodo distruhvo  

Fluorescence LifeTime Imaging (FLIM)  

• Metodo più sicuro per misurare il FRET in quanto si misura solo la fluorescenza relaLva al  

donatore  

• Si basa sulla misurazione del decadimento intrinseco di tuh i fluorocromi (nel range dei  

ns)  

• Si basa anch’esso sul conceJo che il donatore è soggeJo a quenching in caso di FRET  

• Il  quenching  (FRET)  viene  determinato  misurando  quanto  diminuisce  il  tempo  di  

decadimento del donatore. Quindi, in caso di FRET, il tempo di decadimento del donatore  

diminuisce.  

• Misure devono essere effeJuate nel range dei ns  

• La strumentazione è molto costosa  

La scala colore  

rappresenta il tempo 

Spectral Imaging  

• Simile  al  “sensiLzed  emission”  ma  al  posto  di  uLlizzare  canali  per  l’acquisizione  viene  

faJa la scansione di tuJo lo speJro di entrambi i fluorocromi  

• Si  basa  sul  conceJo  che  l’analisi  dell’intero  speJro  di  ciascun  fluorocromo  permeJe  la  

visualizzazione del cross‐talk e quindi la discriminazione degli speJri delle singole proteine  

• Dall’analisi degli speJri si può quindi dedurre la fluorescenza di ciascuno e quanLficare  

l’efficienza di FRET  

• Richiede specifica strumentazione  

• Richiede  analisi  degli  speJri  delle  singole  proteine  e  del  cross‐talk  (don  eccitato  con  λ  

dell’acceJore e viceversa)

FRET intramolecolare - UniversitÃ degli Studi di Brescia

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