Relazione Marco Morelli ARPA Emilia Romagna - Agenzia ...

GRUPPO DI LAVORO
APAT - ARPA - APPA
FITOFARMACI
Metodi di riferimento
nazionale per la ricerca
dei residui di fitofarmaci
nei prodotti vegetali
Dr Marco Morelli - Arpa Emilia Romagna
Hanno collaborato:
Carioli Angela, Pesci Marco, Rossi Filippo – Arpa Emilia Romagna
Lorenzin Michele – Appa Trento

Mancanza di un metodo di prova
normato e/o ufficiale
Le agenzie preposte al controllo
dei residui di fitofarmaci nei
prodotti ortofrutticoli, , da sempre
avvertono l’esigenza di un
metodo analitico ufficiale.

Cos’è un metodo di prova
Un metodo analitico deve essere
considerato un insieme di istruzioni
scritte atte a descrivere
in modo completo il il procedimento adottato
dall’analista per ottenere i risultati
analitici richiesti
(A.L.Wilson, Talanta, , 1970,17,21)

Si parte da lontano...
Nel decreto 23/12/1992 art. 2 comma 2:
.. metodi di analisi determinati con
decreti del Ministero della Sanità…
• In attesa dell’emanazione dei decreti
per i metodi di analisi, si applicano
metodi validati e sperimentati
(decreto 23/12/1992 art. 2 comma 3)

Cosa dice il D.Lgs 194/95
‣ Art. 18 - Fitofarmacopea ufficiale
‣ 1. E' istituita presso il Ministero della Sanità la
Fitofarmacopea ufficiale, , la cui pubblicazione è
curata dal Servizio Informativo Sanitario; ; essa
comprende:
a. le monografie relative alle s.a. contenute nei PF
autorizzati, corredate di tutti quei dati non soggetti
alla tutela della riservatezza, , ai sensi degli articoli
13 e 14;
b. il prontuario dei PF autorizzati, con i relativi dati
tossicologici, ambientali ed agronomici;
c. i metodi di analisi di cui all'articolo 4, comma 1,
lettere c) e d), e all'articolo 6, comma 2, lettera a).

Schede di Fitofarmacopea Ufficiale
‣ Le schede sono tratte dai verbali delle riunioni
della Commissione Consultiva PF che opera
all’interno del Ministero della salute e che svolge
i compiti definiti dall’art. 20 del D.Lgs. . n. 194/95.
‣ Ogni scheda contiene una sintesi delle proprietà
chimico-fisiche, tossicologiche, ambientali,
ecotossicologiche, , agronomiche e residuali
delle s.a. e raccoglie dati non soggetti a
riservatezza ai sensi dell’art. 14 del D.Lgs.
194/95
Fonte: sito internet Ministero della Salute

Esempio di dati su Fitofarmacopea
‣ Denominazione (ISO): ACETAMIPRID
‣ Nome chimico (IUPAC): (E)-N1
N1-[(6-chloro-3-pyridyl)
pyridyl)methyl]-
N2-cyano
cyano-N1-methylacetamidine
‣ Sinonimi: --
‣ n. CAS: 135410-20
20-7
‣ Produttore: Nisso Chemical Europe GMBH
‣ Attività: insetticida
‣ Famiglia chimica: nicotinoide
‣ Purezza minima della sostanza attiva tecnica: 99%
‣ Log ko/w: 0.80
‣ Costante di Henry: 5.3 × 10 -8 Pa m 3 /mol
‣ Metodi di analisi per la determinazione dei residui: GC/ECD
‣ limite di quantificazione (LdQ(
LdQ):
0.01-0.05mg/kg
0.05mg/kg

D.Lgs. . 194/95 art 4 comma 1 lettera c) e d)
‣ Art. 4 - Condizioni per l'autorizzazione dei
PF e riconoscimento degli enti e degli
organismi abilitati alle prove e alle analisi
c. è possibile determinare la natura e la quantità delle
s.a. in esso contenute e, ove occorra, delle sue
impurezze e degli altri componenti significativi dal
punto di vista tossicologico ed ecotossicologico, , con
adeguati metodi stabiliti in sede comunitaria o,
in mancanza, riconosciuti dal Ministero della
Sanità;
d. è possibile, con adeguati metodi di uso corrente,
determinarne i residui di rilevanza tossicologica
ed ambientale, derivanti da un impiego autorizzato;

D.Lgs. . 194/95 art 6 comma 2 lettera a)
‣ Art. 6 - Iscrizione delle s.a. nell'allegato I
‣ assenza di effetti nocivi sulla salute dell'uomo e
degli animali, nonché sulle acque sotterranee, e
di effetti inaccettabili sull'ambiente, correlati ai
residui derivanti da un'applicazione del
preparato in conformità alle buone pratiche
fitosanitarie, , nonché la possibilità di
determinare detti residui, , se significativi dal
punto di vista tossicologico o ambientale, con
metodi analitici di applicazione corrente;

D.Lgs. . 194/95 art 14 comma 2 lettera h)
‣ Art. 14 - Riservatezza dei dati
‣ 2. La riservatezza non si applica:
• h) ai metodi di analisi di cui all' articolo 4,
comma 1, lettere c) e d), e all'articolo 6,
comma 2, lettera a);

Quale riferimento per i laboratori
Rapporti Istisan 97/23 - Istituto Superiore di di Sanità
Gruppo di di lavoro per i i residui di di antiparassitari
della Commissione permanente di di coordinamento
interregionale per i i problemi relativi al al controllo
ufficiale dei prodotti alimentari
metodi multiresiduo per l’analisi di di residui di
di
antiparassitari in in prodotti vegetali

Quali proposte di metodi
‣ B1: Estrazione con acetone, ripartizione in
diclorometano in imbuto separatore,
purificazione su cartuccia di gel di silice
‣ B2: Estrazione con acetone + metanolo
(1+1,v+v), purificazione su C18.
‣ B3: Estrazione con etile acetato, purificazione
mediante GPC mini.
‣ B4: Estrazione per dispersione su terra di
diatomee, purificazione mediante GPC mini.
‣ B5: Estrazione con acetone, purificazione
mediante acetone + H 2 O/CH 2 Cl 2 su Extrelut 20
Fonte: Rapporto Istisan 97/23

Rapporto Istisan 97/23
‣ Punto B.4B
Principio del metodo
• Il metodo consiste di estrarre residui di antiparassitari,
con ampio spettro di polarità, da vegetali senza
apprezzabile trascinamento di acqua nel solvente di
estrazione
• Una porzione del campione vegetale viene impastato
insieme a terra di diatomee speciale.
• La miscela è trasferita in colonna di vetro ed eluita
con solvente.
• La successiva purificazione, mediante cromatografia
di gel permeazione (GPC), permette la separazione
delle molecole a basso peso molecolare di coestrattivi
(lipidi, pigmenti vegetali etc.) che hanno per la
maggior parte pesi molecolari più elevati.

Particolarità….
Questo comporta che i i metodi di di prova tratti da da
queste pubblicazioni non sempre sono accettati
dagli Enti preposti alla valutazione di di conformità
alla UNI EN 17025 come metodi ufficiali e/o
normati
Fonte: SINAL DG0007 rev. 5

Atteggiamento propositivo…
Il gruppo di lavoro AAAF, , a cui fanno
riferimento la maggior parte delle agenzie,
consapevole dell’esigenza, si è fatto
promotore di uno studio con la
collaborazione di molti laboratori del
sistema agenziale che, da tempo, si
occupano dell’analisi dei residui dei
fitofarmaci nei vegetali

Perché questa esigenza
‣ Dotare il sistema delle Agenzie di un metodo di
prova comune per l’analisi dei residui di PF
nell’ortofrutta
‣ Disporre di un metodo di prova contenente
parametri utili alla validazione (ripetibilità,
riproducibilità, ecc.)
‣ Allineare i LdQ e di LdR fra laboratori preposti al
controllo ufficiale
Nota:
Nota:
LdR = limite di rilevabilità: minima concentrazione di analita rilevabile con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica
LdR = limite di rilevabilità: minima concentrazione di analita rilevabile con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica
LdQ = limite di quantificazione: minima concentrazione di analita che può essere analizzata con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica
LdQ = limite di quantificazione: minima concentrazione di analita che può essere analizzata con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica
Fonte: Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura – I manuali ARPA
Fonte: Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura – I manuali ARPA

Il metodo deve essere validato…
‣ UNI CEI ISO 17025 punto 5.4.5.1
Validazione
• “La validazione è la conferma attraverso
esame e l’apporto di evidenza oggettiva
che i requisiti particolari per
l’utilizzazione siano soddisfatti”
• E’ un processo di verifica con il quale si
controlla se il metodo soddisfa
convenientemente i requisiti prefissati

p.to 5.4.5.2 Cosa validare
‣ I metodi non normalizzati
‣ I metodi sviluppati/progettati
dal laboratorio
‣ I metodi normalizzati
utilizzati al di fuori del
campo di applicazione
prefissato
‣ Estensione e modifiche di
metodi normalizzati
Ma però ….!!!
Ma però ….!!!

Verifica di compatibilità
‣ Il laboratorio deve confermare che può
correttamente eseguire i metodi
normalizzati prima di metterli in opera
• 17025 punto 5.4.2 scelta dei metodi
‣ Va almeno verificata la capacità di
eseguire la prova con una precisione
(scarto tipo di ripetibilità) compatibile con
quella del metodo normalizzato

Compatibilità statistica

Considerazioni aggiuntive

Quali parametri della validazione servono
A seconda del del tipo tipo di di procedura analitica, può può essere essere sufficiente che che solo solo alcuni
alcuni
dei dei suddetti parametri siano siano presi presi in in considerazione nella nella validazione. Un Un
esempio per per alcuni alcuni tipi tipi di di procedure analitiche è riportato nella nella Tabella Tabella 1. 1.
Naturalmente, maggiore è l’attenzione dedicata alla alla validazione inizialmente
e minore minore sarà sarà la la difficoltà nel nel tenere tenere il il metodo sotto sotto controllo nel nel tempo.
tempo.
Fonte: rapporto Istisan 06/6 Linee guida per l’attuazione di un sistema di
assicurazione della qualità in un laboratorio di prova

Validazione con metodo normato e
non: quali differenze
Parametri Parametri di di validazione validazione mn mn c dp dp mn mn s dp dp mn mn mod. mod. mi mi
Accuratezza Accuratezza xx xx xx
Campo Campo di di applicazione
applicazione
xx
Esattezza Esattezza xx xx xx
Incertezza Incertezza di di misura misura xx xx xx xx
Intervallo Intervallo di di linearità linearità xx xx xx xx
Limite Limite di di quantificazione quantificazione xx xx xx xx
Limite Limite di di rilevabilità rilevabilità xx xx xx xx
Limite Limite di di ripetibilità ripetibilità xx xx xx xx
Precisione Precisione xx xx xx xx
Recupero Recupero xx xx xx xx
Robustezza Robustezza
xx
Selettività Selettività
xx
Sensibilità Sensibilità
xx
legenda: legenda:
mn
mn
c
c
dp:
dp:
metodo
metodo
normalizzato
normalizzato
che
che
contiene
contiene
dati
dati
di
di
precisione
precisione
(ripetibilità
(ripetibilità
e/o
e/o
riproducibilità)
riproducibilità)
mn
mn
s
s
dp:
dp:
metodo
metodo
normalizzazto
normalizzazto
senza
senza
dati
dati
di
di
precisione
precisione
mn
mn
mod:
mod:
metodo
metodo
normalizzato
normalizzato
modificato
modificato
mi:
mi:
metodo
metodo
interno
interno
Fonte: I50451 validazione dei metodi chimici – SGQ ARPA

Come fare
‣ Eseguire uno studio collaborativo fra il
sistema delle agenzie analogamente a
quanto effettuato nell’ambito della Legge
93/2001 linea 4b
‣ Obiettivo: disporre di un metodo di prova
comune (ufficiale) per l’analisi dei residui
di PF nei prodotti ortofrutticoli
‣ Svantaggio: percorso lungo e dispendioso
Oppure

Valorizzare
l’attività svolta in questi anni dai
laboratori delle ARPA-APPA APPA e
valutare se vi sono dati e condizioni
per proporre e redigere un
metodo di prova per l’analisi dei
residui dei PF su matrici ortofrutticole

Su quali matrici
‣ Puntiamo ad un metodo di prova per l’analisi dei
residui dei PF sulle matrici ortofrutticole di
maggiore interesse commerciale e, quindi, per i
consumatori
‣ Il SINAL nel documento Documento SINAL PT-
0002 rev. 0 da precise indicazioni al riguardo

Quali Azioni intraprese con la
collaborazione delle ARPA-APPA
APPA
Recensione di tutte le informazioni
necessarie per dare evidenza oggettiva
delle caratteristiche dei metodi di prova
adottati dai laboratori
Raccolta dei dati delle validazioni
interne effettuate dai laboratori
Raccolta dei risultati dei profinciency
test, nazionali e/o internazionali, a cui
hanno partecipato le agenzie

Laboratori partecipanti
Hanno collaborato in maniera fattiva le seguenti agenzie
ARPA Val d’Aosta
ARPA Torino
APPA Trento
ARPAV Verona
ARPA Ferrara
ARPA Firenze
ARPA Macerata
ARPA Arezzo
ARPA Perugia
ARPA Bari
ARPAC Napoli
DAP Palermo
DAP Ragusa

Fasi salienti metodi utilizzati dai laboratori ARPA
Quantità di
campione
Utilizzo di
Terra diatomee
Solvente/Mix
estrazione
Utilizzo sistemi
di Automazione
Purificazione
campione
Lab. Quant. (g) Si/No Tipo Tipo ml Si/No
Si/No Tipo
1 25 No (1) 50 + 50 No
Si
SPE
2 10 Si A CH 2
Cl 2
4 x 35
No
Si
GPC
3 10 Si D CH 2
Cl 2
100
No
No
4 10 Si G EtAc 25
Si
Si
GPC
5 10 Si CH 2
Cl 2
100
Si
silica gel
6 10 Si M CH 2
Cl 2
100
No
No
7 15 Si Z CH 2
Cl 2
150
Si
Si
GPC
8 5 Si Z EtAc 40
Si
Si
GPC
9 50 No Acetone 200
10 15 Si J CH 2
Cl 2
150
11 10 Si EtAc 80
12 15 Si A CH 2
Cl 2
100
13 10 Si Z CH 2
Cl 2
100
(1): miscela acetone/metanolo 1:1
Legenda
A: Merck - Extrelut bustine
D: Merck
G: Bulk isolute sorbent
No
Si
No
No
Lab. con numero con colore rosso: utilizzo di terre di diatomee
J: Extrelut NT Refil Pak WWR International
M: chemtek analitica
Z: hidromatrix Varian
Si
Si
Si
SPE
GPC
GPC
GPC
Pag. 1 di 3

Fasi salienti metodi utilizzati dai laboratori ARPA
Quantificazione
standard in solvente
o in matrice
Quantificazione
Multilivello o singolo livello
Quantificazione
Utilizzo di standard
di processo
Lab. Solvente/matrice Tipo Numero Si/No
1 Solvente Multi livello 3
2 Solvente Multi livello 3
3 Solvente Multi livello 3
4 Solvente Singolo 1
5 Solvente Singolo 1
6 Solvente Singolo 1
7 Solvente Singolo 1
8 matrice Singolo 1
9 Solvente Multi livello 4
10 Solvente Multi livello > 6
11 Solvente Multi livello 6
12 Solvente Multi livello 4
13 Solvente Multi livello 4
No
Si
No
Si
No
No
No
Si
Si
Si
Si
No
No
Lab. con numero con colore rosso: utilizzo di terre di diatomee
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Fasi salienti metodi utilizzati dai laboratori ARPA
Codice
Laboratorio
Rivelatori utilizzati dai laboratori
GC NPD GC FPD GC ECD GCMS
1 Si Si Si Si
2 Si Si Si
3 Si No Si Si
4 Si No Si No
5 Si Si Si
6 Si Si Si
7 Si Si Si Si
8 Si Si Si Si
9 Si Si Si
10 Si No Si Si
11 Si No Si Si
12 Si No Si Si
13 Si No Si Si
Lab. con numero con colore rosso: utilizzo di terre di diatomee
Pag. 3 di 3

Partecipazione dei laboratori ai
Profinciecy Test
La partecipazione a prove
interlaboratorio è molto importante
per la verifica della riferibilità esterna
delle prestazioni del metodo utilizzato
dal Laboratorio

Nel Regolamento (CE) n. 396/2005 …
concernente i livelli massimi di residui di
antiparassitari nei o sui prodotti alimentari e
mangimi di origine vegetale e animale e che
modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio
evidenzia, tra le misure relativi ai Metodi di analisi:
Articolo 28 comma 3: Tutti i laboratori
incaricati dell'analisi dei campioni ai fini
dei controlli ufficiali sui residui di
antiparassitari partecipano alle prove
interlaboratorio comunitarie per i residui
di antiparassitari organizzate dalla
Commissione

Sanco/10232/2006
p.to 67
‣ The laboratory must participate regularly
in relevant proficiency tests.
• Where the accuracy achieved in any of the
tests is questionable or unacceptable, the
problem(s) should be investigated and,
particularly for unacceptable performance,
rectified before proceeding with further
determinations of the analyte/matrices
combinations involved.

A cosa servono le prove
interlaboratorio
‣ Possono essere usate per:
• documentare la riferibilità delle misure, quando non siano
disponibili campioni di prima linea o materiali certificati;
• validare i metodi di prova, con riferimento alla ISO 5725;
• certificare materiali di riferimento (Guide ISO 30-305)
305)
• valutare la competenza tecnica dei laboratori (Proficiency(
tests o
prove valutative, con riferimento alla Guida ISO 43).
‣ Le prove valutative sono indicate dalla UNI CEI EN
ISO/IEC 17025 come strumento per l'assicurazione della
qualità dei laboratori, e la UNI CEI EN ISO/IEC 17011
richiede che gli organismi di accreditamento verifichino
la competenza tecnica dei laboratori anche mediante i
risultati dei proficiency tests.
Fonte: Sito internet del sinal (www.sinal.it)

Partecipazione e frequenza
dei laboratori ai test
N° Si/No anni Enti
1 Si 10 EUPT
2 No
3 Si 4 EUPT FAPAS ARPAV
4 Si 4 EUPT
5
6 Si 9 EUPT AAAF
7 Si 10 EUPT I.S.S. AAAF Is.Pa.Ve.
8 Si 7 EUPT I.S.S. C.O.O. AAAF
9 Si AAAF FAPAS
10 Si 8 EUPT I.S.S.
11 Si 6 EUPT I.S.S. C.O.O.
12 Si EUPT AAAF FAPAS
13 No
Legenda
I.S.S. = Istituto Superiore di Sanità
EUPT = European Commission's PT
AAAF – ARPA = gruppo di lavoro AAAF
C.O.O. = Centro Operativo Ortofrutticolo - Coop Italia
9: laboratori hanno partecipato
all’European
Commission’s PT

Matrici e Proficiency Test
Gruppo
Matrici
III
I
I
I
II
II
II
II
II
Arance
Lattuga
Cetriolo
Zucchino
Peperone
Pomodoro
Uva
Mela
Actinidia

Matrici e principi attivi (p.a.) impiegati nei vari test
Matrici n° p.a. p.a. lab/p.a. p.a lab/p.a. Gruppo
Acefate 5 Metamidofos 5
Deltametrina 5 Permetrina 6
Cetriolo 11
Lattuga 12
Diazinone 6 Pirimifos metile 5
Endosulfan 3 Propoxur 6
Imazalil 4 Vinclozolin 6
Metalaxil 5
Acefate 7 Ometoato 8
Diazinone 8 Oxadixil 8
Fosmet 7 Paration 9
Lambda cialotrina 6 Propizamide 8
Malation 9 Quintozene 4
Mevinfos 6 Tolclofos metile 10
I
I
Zucchino 6
Deltametrina 2 Metalaxil 3
Difenilamina 3 Metossicloro 2 I
Dimetoato 3 vinclozolin 3
Arancia 14
Azinfos metile 7 Diazinone 6
Azoxistrobina 6 Imazalil 7
Bromopropilato 7 Mecarbam 5
Carbofuran 3 Metamidofos 5
Cipermetrina 7 Metidation 7
Clorpirifos 6 Ometoato 6
Clorpifos metile 7 Paration 7
III
Pag. 1 di 2

Pag. 2 di 2
Matrici e principi attivi (p.a.) impiegati nei vari test
Matrici n° p.a. p.a. lab/p.a. p.a lab/p.a. Gruppo
Peperone 6
Actinidia 6
Mela 3
Uva 13
Pomodoro 10
Cipermetrina 2 Endosulfan 2
Clorpirifos 2 metamidofos 2
Diazinone 2 Procimidone 2
Azoxistrobina 6 Metalaxil 5
Clortalonil 7 Metidation 6
Diclofluanide 6 tolifluanide 5
diazinone 3 Nuarimol 3
Metidation 3
Carbaril 5 Kresoxim metile 5
Ciprodinil 5 Monocrotofos 4
Diazinone 5 Pirimetanil 5
Dimetoato 5 Procimidone 5
Fenexamide 5 Tetraconazolo 4
Fluodioxonil 5 tiabendazolo 3
Iprodione 5
Azoxistrobina 8 Endosulfan 8
Bromopropilato 8 Imazalil 8
Clortalonil 7 Metalaxil 5
Diazinone 7 Procimidone 9
Dimetoato 8 Tiabendazolo 5
II
II
II
II
II

Risultati PT
Totali e dei laboratori coinvolti
P.A.
Analizzati
Soddisfacenti Discutibili Non Soddisfacenti
n. % n. % n. %
549 475 86,5 44 8 30 5,5
Laboratori
Totale Soddisfacenti Discutibili Non Soddisfacenti
n. n. % n. % n. %
3 38 34 89,5 4 10,5 0 0
4 32 20 62,5 7 21,9 5 15,6
6 81 74 91,4 7 8,6 0 0
7 113 96 85 5 4,4 12 10,6
8 65 57 87,7 5 7,7 3 4,6
10 54 47 87 2 3,7 5 9,3
11 122 108 88,5 10 8,2 4 3,3
12 44 39 88,6 4 9,1 1 2,3

Risultati PT su diverse matrici
Matrici Gruppo Totale
n.
Soddisfacenti Discutibili Non Soddisfacenti
n. % n. % n. %
Arance III 86 81 94,2 5 5,8 0 0
Lattuga I 91 80 87,9 9 9,9 2 2,2
Cetriolo I 60 46 76,7 6 10 8 13,3
Zucchino I 18 12 66,7 4 22,2 2 11,1
Peperone II 12 7 58,3 1 8,3 4 33,3
Pomodoro II 85 75 88,2 5 5,9 5 5,9
Uva II 71 62 87,3 4 5,6 5 7
Mela II 37 33 89,2 4 10,8 0 0
Actinidia II 49 42 85,7 3 6,1 4 8,2
Gruppi di
matrici
Totale
n.
Soddisfacenti
%
Discutibili
%
Non Soddisfacenti
%
Gruppo II
31
86,2
7,3
6,5
Gruppo I
18
81,7
14
4,3
Gruppo III
7
94,2
5,8
0

Ragionevolezza…
I laboratori partecipando ai
proficiency test, utilizzando
lo stesso metodo di
prova, , è come se avessero
partecipato ad uno “Studio“
collaborativo”

Come valorizzare i dati dei
Profinciency test
Utilizzare le informazioni derivanti dai
profinciency test per sottolineare e
ribadire la validità del criterio:
delle matrici rappresentative
dei parametri rappresentativi

L’Unione Europea nelle linee guida
SANCO/10232/2006:”Quality
control procedures for
pesticide residues analysis” nel punto
57 Analytical methods and analytical
performance Method validation:

Viene ribadito…
Deve essere effettuata con molta
attenzione e cura la scelta:
le le matrici: vengono individuate e selezionate
sulla base of of their biological or or ‘‘analytical’’
similarity
(es.: occorre valutare il il contenuto di di acqua,
di di clorofilla, di di grassi, di di zuccheri e di di acidità)
degli analiti: occorre valutare le le caratteristiche
chimico-fisiche delle sostanze attive
(polarità, degradabilità, basicità, ecc.)

Tali posizioni sono condivise anche dal
documento FAO/IAEA “Guidelines for single
laboratory validation of analytical methods
for trace-level concentrations of organic
chemicals”.
In In particolare Annex 1 Method validation for
pesticide residues viene presentato lo lo schema
di di suddivisione delle matrici in in funzione del
contenuto in in acqua, della presenza di
di
clorofilla e di di acidi organici …

Le matrici proposte nei
proficiency test, in base alle loro
caratteristiche, possono essere così
raggruppate…
Gruppo Proprietà Matrice
I
II
Alto contenuto di acqua e
clorofilla
Alto contenuto di acqua e
basso contenuto di
clorofilla e/o caroteni
Lattuga, cetriolo, zucchino
Mele, actinidia, uva,
pomodoro, peperone
III Alto contenuto di acidità arance
Nei 3 gruppi di di matrici, , rientrano la la maggior parte dei prodotti
ortofrutticoli analizzati e portati sulla tavola dei consumatori

Nell’ Annex 3 Worked example of method
validation, as applied to a method for
pesticides residues sono riportati i
criteri per la scelta delle s.a.
rappresentative
Il Il documento considera le le seguenti
caratteristiche per valutare le le s.a.:
.:
solubilità in in acqua
Log Pow
tensione di di vapore
idrolisi in in acqua come DT 50 50 ..

Parametri oggetto di test,
classificati per solubilità in acqua
Principio attivo
Solubilità in
acqua (mg/l)
Principio attivo
Solubilità in
acqua (mg/l)
difenilammina 53
Solubilità in
acqua (mg/l)
mevinfos 1000000 azinfos metile 28 kresoxim m 2
monocrotofos 1000000 nuarimol 26 fludioxonil 1,8
metalaxil 8400 fosmet 25 clorpirifos 1,4
tolilfluanide 4000 dimetoato 23,8 diclofluanide 1,3
oxadixil 3400 fenexamide 20 tolclofos metile 1,1
pirimicarb 3000 quinalfos 17,8 clorotalonil 0,81
propoxur 1900 propizamide 15 bromopropilato 0,5
metidation 200 ciprodinil 13 endosulfan 0,32
imazalil 180 iprodione 13 metossicloro 0,1
tetraconazolo 156 paration 11 quintozene 0,1
malation 145 azoxistrobina 6 permetrina 0,006
miclobutanil 142 procimidone 4,5 lambda cialotrina 0,005
pirimetanil 121 tiabendazolo 3 cipermetrina 0,004
carbaril 120 clorpirifos metile 2,6 deltametrina 0,0002
diazinone 60 vinclozolin 2,6
Principio attivo
Gli intervalli di solubilità considerati sono rappresentativi della variabilità
delle s.a. da valutare per la validazione del metodo

Solubilità in acqua dei p.a.
I p.a. sono stati suddivisi
considerando la loro solubilità in
acqua.
Sono state costituite n. 5 classi di p.a. in
base al loro valore, in mg/l, di solubilità
in acqua alla temperatura di 20°C*.
* Fonte: The Pesticide Manual 13 edizione editor CDS Tomlin BCPC 2003

Classi di solubilità in acqua dei p.a.
Classe
Solubilità in
acqua
A x ≤ 1
Numero di
p.a.
B 1< x ≤ 10
10
C 10 < x ≤ 100 9
D 100 < x ≤ 1000 6
E x >1000
9
9
La colonna “numero dei p.a.” indica quante s.a. oggetto
di proficiency test rientrano nelle 5 classi di solubilità
predisposte.

CLASSE A – Solubilità in acqua
x ≤ 1
Sol.
(mg/l)
x ≤ 1
Sol.
(mg/l)
x ≤ 1
Sol.
(mg/l)
Acrinatrina 0,02 Clortal dimetile 0,5 Fenazaquin 0,22
Antrachinone 0,084 Deltametrina 0,0002 Fenpropatrin 0,014
Bifentrin 0,001 Dicofol 0,8 Fenvalerate 0,01
Bromopropilato 0,5 Diflubenzuron 0,08 Folpet 0,8
Buprofezin 0,9 Endosulfan alfa 0,32 Lambda-cialotrina 0,005
Carbofention 0,63 Endosulfan beta 0,33 Permetrina 0,006
Chinometionato 1 Endosulfan solfato 0,32 Quinoxifen 0,116
Ciflutrin 0,002 Esaclorobenzene 0,005 Teflubenzuron 0,019
Cipermetrina 0,004 Esfenvalerate 0,002 Tetradifon 0,078
Clorotalonil 0,81 Etofenprox 0,001 Trifloxistrobina 0,61
Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

CLASSE B
1 < x ≤ 10
Sol.
1 < x ≤ 10
Sol.
1 < x ≤ 10
Sol.
(mg/l) (mg/l) (mg/l)
Anilazina 8 Diclofluanide 1,3 Mepanipirim 3,1
Azinfos etile 4,5 Dicloran 7 Pirazofos 4,2
Azoxistrobina 6 Etion 2 Pirimifos etile 2,3
Benfuracarb 8,1 Fenoxicarb 7,9 Pirimifos m 9
Bitertanolo 2 Fention 4,2 Procimidone 4,5
Cloroneb 8 Fentoato 10 Propizamide 15
Clorpirifos 1,4 Fludioxonil 1,8 Tiabendazolo 3
Clorpirifos m 2,6 Fosalone 3,05 Tebufenpirad 2,6
Clozolinate 2 Iodofenfos 2 Tolclofos m 1,1
Diclobutrazolo 9 Kresoxim m 2 Vinclozolin 2,6
Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

CLASSE C
10 < x ≤ 100 Sol.
(mg/l)
10 < x ≤ 100 Sol.
(mg/l)
10 < x ≤ 100 Sol.
(mg/l)
Azinfos metile 28 Esaconazolo 17 Paration 11
Benalaxil 28,6 Etrimfos 40 Paration metile 55
Benzossimato 30 Fenarimol 13,7 Penconazolo 73
Bromofos metile 40 Fenfuram 100 Piperofos 25
Bupirimate 22 Fenexamide 20 Piperonil butossido 14,3
Carbaril 120 Fenitrotion 21 Piridafention 74
Clormefos 60 Fenotiocarb 30 Profenofos 28
Clorprofam 89 Flusilazolo 54 Propiconazolo 100
Ciprodinil 13 Fonofos 13 Quinalfos 17,8
Diazinone 60 Forate 50 Tebuconazolo 36
Diclobenil 14,6 Fosmet 25 Tetraclorvinfos 11
Dietofenocarb 26,6 Furatiocarb 11 Triadimefon 64
Difenilammina 53 Iprodione 13 Triadimenol 47
Difenoconazolo 16 Iprovalicarb 11
Dodemorph 100 Nuarimol 26
Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

CLASSE D
100 < x ≤ 1000 Sol. (mg/l) 100 < x ≤ 1000 Sol. (mg/l)
Ametrina 200 Imazalil 180
Ciproconazolo 140 Malation 145
Clorbufam 540 Mecarban 999
Clorfenvinfos 145 Metidation 200
DEET 912 Miclobutanil 142
Difenamide 260 Pirifenox 115
Etoprofos 700 Pirimetanil 121
Famfur 109 Profam 250
Fenamifos 400 Propargite 632
Formotion 260 Tetraconazolo 156
Furalaxil 230
Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

CLASSE E
x > 1000 Sol. (mg/l) x > 1000 Sol. (mg/l)
Diclorvos 18000 Metalaxil 8400
Dimetilan 208000 Mevinfos 600000
Dimetoato 25000 Oxadixil 3400
Dioxation 1550 Pirimicarb 3000
Eptenofos 2200 Propoxur 1900
Fosfamidone 1000000 Tolifluanide 4000
Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

Sono considerate solo le matrici
appartenenti ad un determinato gruppo (I
e II).
Vengono fatti confronti solo fra p.a.
comuni a più matrici del medesimo gruppo
Il confronto consiste nell’applicazione di
test statistici al 95% di probabilità
Criterio delle
matrici rappresentative
eventualmente al 99% di probabilità

I test statistici adottati sono i seguenti:
test di normalità (Shapiro-Wilk o Kolmogorov-Smirnov)
test di Dixon
test di Grubbs
test di Huber
test del t di Student
test di Anova
I I confronti sono sono stati stati fatti fatti utilizzando più più test test statistici valutando la
la
significatività dei dei risultati al al 95% 95% di di probabilità.
Qualora i i risultati evidenziassero una una differenza significativa, a, si
si
procedeva alla alla ripetizione del del test test con con probabilità del del 99%.
99%.

Test statistici e software applicativi
Per l’applicazione dei test sono stati utilizzati
software specifici fra cui:
Modulo 30 rev. 4 del 27/12/2001 dell’ARPAT per
calcolo:
distribuzione normale (test di Shapiro-Wilk
Wilk)
test di Dixon, , di Grubbs e di Huber
SigmaStat 3.11 test t Student o software in excel
per il calcolo del t di Student prodotto dal prof.
Bottarelli – Università di PR
SigmaStat 3.11 test di Anova e test di Normalità
(Kolmogorov-Smirnov)

Sostanza attiva: attiva: DIAZINONE
matrice R%Vv
lattuga 77,1
lattuga 76,1
lattuga 68,8
lattuga 82,6
lattuga 100,9
lattuga 76,1
lattuga 99,1
lattuga 99,1
matrice R%Vv
cetriolo 60,8
cetriolo 87,4
cetriolo 108,4
cetriolo 109,1
cetriolo 114,9
cetriolo 51,0
Nota: probabilità del 95%
R%Vv: recupero %
valore vero
Modulo Modulo n. 30 ARPAT
- Distribuzione
n. 30 ARPAT
-
normale (Shapiro Wilk): Si
-
Distribuzione Presenza di dati
normale
anomali
(Shapiro
(Dixon
Wilk):
e Grub):
Si
- Presenza di dati anomali (Dixon e Grub): No
No
t-test (Sigma Stat 3.11)
t-test test (Sigma Stat 3.11)
Normality
Normality
Test:
Test:
Passed
Passed
(P
(P
=
=
0,196)
0,196)
Equal
Equal
Variance
Variance
Test:
Test:
Passed
Passed
(P
(P
=
=
0,095)
0,095)
Esempio
dimostrativo
Group
Group
Name
Name
N
N
Missing
Missing
Mean
Mean
Std
Std
Dev
Dev
SEM
SEM
diazinone
diazinone
6
6
0
0
88,613
88,613
27,148
27,148
11,083
11,083
diazinone
diazinone
8
8
0
0
84,977
84,977
12,749
12,749
4,508
4,508
Difference
Difference
3,636
3,636
t
t
=
=
0,336
0,336
with
with
12
12
degrees
degrees
of
of
freedom.
freedom.
(P
(P
=
=
0,743)
0,743)
95
95
percent
percent
confidence
confidence
interval
interval
for
for
difference
difference
of
of
means:
means:
-19,954
-19,954
to
to
27,226
27,226
The
The difference in the mean values of the two groups is not great enough to reject the
possibility
difference
that
in
the
the
difference
mean values
is due
of
to
the
random
two groups
sampling
is not
variability.
great enough
There
to
is
reject
not a
the
possibility
statistically
that
significant
the difference
difference
is due
between
to random
the
sampling
input groups
variability.
(P = 0,743).
There is not a
statistically significant difference between the input groups (P = 0,743).
Power
Power
of
of
performed
performed
test
test
with
with
alpha
alpha
=
=
0,050:
0,050:
0,050
0,050
The
The
power
power
of
of
the
the
performed
performed
test
test
(0,050)
(0,050)
is
is
below
below
the
the
desired
desired
power
power
of
of
0,800.
0,800.
Less
Less than desired power indicates you are more likely to not detect a difference when
one
than
actually
desired
exists.
power
Be cautious
indicates
in
you
over-interpreting
are more likely
the
to
lack
not detect
of difference
a difference
found
when
one actually exists. Be cautious in over-interpreting the lack of difference found here.
here.

Rappresentatività delle matrici
del gruppo 1: confronti
Parametri Matrice 1 Matrice 2 Matrice 3 t Test
Deltametrina cetriolo zucchino nds
Diazinone cetriolo lattuga nds
Metalaxil cetriolo zucchino nds
Vinclozolin cetriolo zucchino nds
nds = nessuna differenza significativa al 95% di probabilità

Rappresentatività delle matrici
del gruppo 2: confronti
Parametri Matrice 1 Matrice 2 Matrice 3 Matrice 4
Azoxistrobina actinidia pomodoro
Clortalonil actinidia pomodoro
Diazinone peperone pomodoro mela
Endosulfan peperone pomodoro
Iprodione
Metidation
Procimidone peperone pomodoro
Tiabendazolo
actinidia
pomodoro
mela
mela
uva
uva
uva
uva
t Test
nds
nds
nds
nds
nds
nds
nds
nds
nds = nessuna differenza significativa al 95% di probabilità

A fronte di quanto emerso dai risultati
ottenuti, per le matrici del gruppo I e II,
al 95% di probabilità, c’è
confrontabilità delle matrici
Per quanto potuto constatare il
il
criterio della rappresentatività
delle matrici risulta
ulteriormente confermato

Analiti rappresentativi
Sanco/10232/2006
‣ 42. Il sistema di determinazione deve essere “calibrated” con gli analiti
rappresentativi [1] per ogni serie di analisi. …
• 43… gli analiti rappresentativi devono essere scelti con molta attenzione,
per fornire la prova che la selezione realizzata è accettabile per tutti gli altri
analiti. La scelta dovrebbe essere fatta tenendo conto delle caratteristiche
chimico-fisiche degli analiti (polarità, degradabilità, basicità)
condizionatamente a quanto incluso in ciò che segue:
• tutti gli analiti devono probabilmente essere rilevabili nei campioni da
analizzare;
• analiti che probabilmente sono destinati a dare la più risposta più bassa
e/o i recuperi più variabili.
[1] Un analita usato per valutare la prestazione più probabili e utilizzando un altro analita nell'analisi. I
dati accettabili per un analita rappresentativo sono dati presunti per mostrare che quella prestazione è
soddisfacente. L'analita rappresentativo deve includere quelli per p
cui ci si aspetta la prestazione
peggiore.

Criterio dei
parametri rappresentativi
Sono stati fatti confronti per tutti i i principi attivi
appartenenti alla stessa matrice:
Parametri
Esempio: matrice cetriolo
Norm
1 2 dati 1
Test
Dixon1
Test
Norm
Grubbs1 dati 2
Test
Dixon2
Test
Grubbs2
diazinone clorpirifos N NDA NDA N NDA NDA NS
fosmet iprodione N NDA NDA N NDA NDA NS
iprodione azinfos m N NDA NDA N NDA NDA NS
T
Test
Legenda: Legenda:
N = distribuzione distribuzione N al al test test di di Shapiro-Wilk Shapiro-Wilk (probabilità (probabilità del del 95%) 95%) (Norm) (Norm)
NS NS = La La differenza differenza fra fra le le medie medie osservate, osservate, al al 95% 95% di di probabilità, probabilità, non non è significativa
significativa
NDA NDA = nessun nessun dato dato anomalo anomalo al al test test statistico statistico con con probabilità probabilità del del95%

Riassunto t test su tutti i gruppi di matrici
Gruppo
III
II
I
Sono stati fatti confronti per tutti i i principi attivi
appartenenti alla stessa matrice:
Matrice
pa t Test nds nds (*) ds nds (nN)
n. n. n. % n. % n. % n. %
arancia 14 91 68 75 5 5 18 20 0 0
uva 12 66 55 83 0 0 11 17 0 0
mela 3 3 3 100 0 0 0 0 0 0
actinidia 6 15 13 87 0 0 2 13 0 0
pomodoro 10 45 29 64 7 16 9 20 0 0
peperone 6 15 15 100 0 0 0 0 0 0
zucchino 4 6 2 33 2 33 2 33 0 0
lattuga 12 66 32 48 14 21 20 30 0 0
cetriolo 11 57 50 88 5 9 0 0 2 4
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%
ds – differenza significativa al 95% e al 99%
nds(nN) – nessuna differenza significativa (dati non normali al 99% di probabilità)

Riassunto classi principali
con differenza significativa
Matrice
p.a. appartenenti
alla classe che ha
dato maggiore DS
cetriolo /
lattuga E 19/66 28,8
zucchino E 2/6 33,3
pomodoro E 8/45 17,8
peperone /
mela /
n. volte
sul totale
% sul totale
uva B 9/66 13,6
actinidia E 2/15 13,3
arancia E 14/83 16,9

Criterio dei parametri rappresentativi
Sono stati fatti confronti fra fra più p.a. appartenenti alla
stessa classe di di solubilità e nella stessa matrice.
E’ stato applicato il il test di Anova
confrontando i i risultati conseguiti nei
proficiency test dai laboratori, per
valutare, al 95% di probabilità, la
confrontabilità dei parametri
Qualora il il confronto evidenziasse differenze statisticamente significative, il
il
test test di di Anova Anovaveniva veniva ripetuto al al 99% 99% di di probabilità.

Test della Varianza
One
One
Way
Way
Analysis
Analysis
of
of
Variance
Variance
(Sigma
(Sigma
stat
stat
3.11)
3.11)
Normality Test:
Normality Test:
Passed
Passed
(P = 0,180)
(P = 0,180)
Equal Variance Test:
Equal Variance Test:
Passed
Passed
(P = 0,398)
(P = 0,398)
Group Name N Missing Mean Std Dev SEM
Group Name N Missing Mean Std Dev SEM
Bromoprop. 8 0 76,162 30,259 10,698
Bromoprop. 8 0 76,162 30,259 10,698
clortalonil 7 0 94,087 11,176 4,224
clortalonil 7 0 94,087 11,176 4,224
endosulfan 8 0 99,645 21,651 7,655
endosulfan 8 0 99,645 21,651 7,655
Matrice:
Pomodoro
Source
Source
of
of
Variation
Variation
DF
DF
SS
SS
MS
MS
F
F
P
P
Between Groups 2 2391,887 1195,944 2,291 0,127
Between Groups 2 2391,887 1195,944 2,291 0,127
Residual 20 10439,975 521,999
Residual 20 10439,975 521,999
Total 22 12831,863
Total 22 12831,863
The
The
differences
differences
in
in
the
the
mean
mean
values
values
among
among
the
the
treatment
treatment
groups
groups
are
are
not
not
great
great
enough
enough
to
to
exclude
exclude
the
the
possibility
possibility
that
that
the
the
difference
difference
is
is
due
due
to
to
random
random
sampling
sampling
variability;
variability;
there is not a statistically significant difference (P = 0,127).
there is not a statistically significant difference (P = 0,127).
Power of performed test with alpha = 0,050: 0,239
Power of performed test with alpha = 0,050: 0,239
The power of the performed test (0,239) is below the desired power of 0,800.
The power of the performed test (0,239) is below the desired power of 0,800.
Less than desired power indicates you are more likely to not detect a difference when
Less than desired power indicates you are more likely to not detect a difference when
one actually exists. Be cautious in over-interpreting the lack of difference found here.
one actually exists. Be cautious in over-interpreting the lack of difference found here.
Nota: Probabilità del 95%

Riassunto confronto
parametri rappresentativi
Matrici gruppo II
Matrici gruppo III (arancia)
Matrici
classi
n. pa parametri
p.a.
classi
n. pa
parametri
p.a.
Pomodoro
A 3
Bromopropilato
Clortalonil
endosulfan
nds
B
3
azoxistrobina
clorpirifos
clorpirifos m
nds
uva
D 3
Carbaril,
pirimetanil
Tetraconazolo
nds
C
3
azinfos m
diazinone
paration
nds
Matrici gruppo I
matrice
cetriolo
lattuga
classi
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
A
C
n. pa
3
4
parametri
Deltametrina
Permetrina
endosulfan
Diazinone
Fosmet
Paration
propizamide
p.a.
nds
nds

Criterio dei parametri rappresentativi
Da confronti effettuati, di cui sono
riportati, per brevità, solo alcuni
esempi, con probabilità del 95%,
viene confermato il criterio della
rappresentatività dei parametri
nell’ambito della
stessa classe di solubilità
e per lo
stesso gruppo di matrici

Criterio dei parametri rappresentativi
Sono stati fatti confronti fra fra più p.a. appartenenti alla
stessa classe di di solubilità e nella stessa matrice.
E’ E’ stato stato applicato il il test test di di Anova Anovaconfrontando i i risultati risultati conseguiti nei
nei
profinciency test test dai dai laboratori, per per valutare, al al 95% 95% di di probabilità, l’eventuale
differenza qualora:
siano siano portate portate all’analisi diverse diverse quantità, in in g, g, di di campione
utilizzo utilizzo di di diversa diversa tipologia di di terra terra di di diatomee
impiego o meno meno dell’automazione nell’estrazione
influenza della della purificazione sul sul risultato analitico
confronto fra fra i i diversi diversi tipi tipi di di solvente di di estrazione
confronto fra fra risultati risultati conseguiti impiegando un un diverso diverso volume e di di solvente
la la quantificazione con con retta retta (
(multilivello) ) o con con uno uno standard esterno
l’influenza dello dello standard di di processo nell’analisi quantitativa
confronto fra fra risultati risultati conseguiti preparando lo lo standard in in matrice m
o in
in
solvente
Qualora il il confronto avesse evidenziato differenze statisticamente
te
significative, il il test test di di Anova Anovaveniva veniva ripetuto al al 99% 99% di di probabilità.

Riassunto applicazione test Anova
Matrici
classi
n. pa pa
Gruppo II (matrici: pomodoro e uva)
p.a.
Q.tà
Terra
diatomee
ASE
Purif.
Pomodoro
A 3
Bromopropilato
Clortalonil
endosulfan
nds nds nds nds(*) nds
uva
D 3
Carbaril,
pirimetanil
Tetraconazolo
nds nds nds nds nds
Matrici
classi
n. pa
pa
Solv
tipo
vol
solv.
Std
Solv.
Retta o
singolo
Std
proc.
Pomodoro
A
3
Bromopropilato
Clortalonil
endosulfan
nds
nds
nds
nds
nds
uva
D
3
Carbaril,
pirimetanil
Tetraconazolo
nds
nds
nds
nds
nds
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%
(Alcuni esempi)

Riassunto applicazione test Anova
Gruppo III (matrice: Arancia)
classi n. pa parametri p.a. Q Hmx ASE sol
B 3
azoxistrobina
clorpirifos
clorpirifos m
nds nds nds nds nds
C 3
azinfos m
diazinone
paration
nds nds nds nds nds
classi
n. pa
parametri
Purific
vol sol
S/M
R/S
Std pr
B
3
azoxistrobina
clorpirifos
clorpirifos m
nds
nds
nds(*)
nds
nds
C
3
azinfos m
diazinone
paration
nds
nds
nds
nds
nds
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%
(Alcuni esempi)

Riassunto applicazione test Anova
Gruppo I (Matrici: cetriolo e lattuga)
matrice classi n. pa parametri p.a. Q Hmx ASE sol
cetriolo
lattuga
A 3
C 4
Deltametrina
Permetrina
endosulfan
Diazinone
Fosmet
Paration
propizamide
nds nds nds nds(*) nds(*)
nds nds nds nds nds
matrice
classi
n. pa
parametri
Purific
vol sol
S/M
R/S
Std pr
cetriolo
A
3
Deltametrina
Permetrina
endosulfan
nds(*)
nds
nds
nds
nds
lattuga
C
4
Diazinone
Fosmet
Paration
propizamide
nds
nds
nds
nds
nds
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%
(Alcuni esempi)

Considerazione sui
confronti dei p.a.
Fra i i p.a. appartenenti alla
stessa classe di solubilità,
nell’ambito dei gruppi di
matrici esaminate viene
confermato il il criterio della
rappresentatività dei
parametri

Per quanto attiene i confronti
a sostegno del metodo di prova…
‣ Si rileva “nds“
al 95% di probabilità” per le
seguenti fasi del metodo:
• Fase preparativa/estrattiva
• quantità, in g, di campione portata all’analisi
• impiego di diversa tipologia di terra di diatomee
• utilizzo o meno di sistemi automatici di estrazione
• diversi tipi di solvente di estrazione
• un diverso volume di solvente di estrazione
• nessuna influenza della purificazione sul risultato analitico
• Quantificazione
• con retta (multilivello(
multilivello) ) o con uno standard esterno
• Impiego o meno dello standard di processo
• utilizzo dello standard in matrice o in solvente

Considerazione…
Tutti i confronti fatti, dimostrano al
95% di probabilità (pochi casi al
99% di probabilità) che il il metodo di
prova utilizzato dai laboratori,
analizzando p.a. in un ampio range
di solubilità, , e per le matrici
riconducibili ai gruppi I, I, II IIe III è
robusto

Con p.a. di classe di solubilità contigue
Gruppo II (matrici:pomodoro e uva)
Matrici classi n. pa pa p.a. Q.tà
pomodoro
uva
B/C 4
D/C 5
Azoxistrobina
Diazinone
Procimidonet
iabendazolo
Carbaril,
Ciprodinil,
Diazinone
Fenexamide,
Iprodione
Terra
diatomee
ASE
Purif.
nds(*) nds nds nds nds
nds nds nds nds nds
Matrici
classi
n. pa
pa
solv.
tipo
vol
solv.
Std Solv.
Retta o
singolo
Std proc.
pomodoro
B/C
8
Azoxistrobina
Diazinone
Procimidonet
iabendazolo
nds
nds
nds
nds
nds
uva
D/C
5
Carbaril,
Ciprodinil,
Diazinone,
Fenexamide
Iprodione
nds
nds
nds
nds
nds
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%

Con p.a. di classe di solubilità contigue
Gruppo I (matrici: cetriolo e lattuga)
Matrici classi n. pa pa p.a. Q.tà
cetriolo
lattuga
D/E 5
B/C 3
Acefate,
Metamidofos
Metalaxil
Propoxur
imazalil
Fosmet
Paration
Tolclofos
Terra
diatomee
ASE
Purif.
nds nds nds nds nds
nds nds nds nds nds
Matrici
classi
n. pa
pa
solv.
tipo
vol
solv.
Std Solv.
Retta o
singolo
Std proc.
cetriolo
D/E
5
Acefate,
Metamidofos
Metalaxil
Propoxur
imazalil
nds
nds
nds
nds
nds
lattuga
B/C
3
Fosmet
Paration
Tolclofos m
nds
nds
nds
nds
nds
Legenda:
nds – nessuna differenza significativa al 95%
nds(*) - nessuna differenza significativa al 99%

Dati di validazione dei metodi di
prova dei laboratori…
‣ Sono stati considerati solo le s.a. comuni a
più di 3 laboratori
‣ Disponendo di livelli di concentrazione
differenti, i dati, per essere confrontati,
sono stati normalizzati rispetto
all’incremento teorico
‣ Per ciascun p.a. è stato calcolato lo scarto
tipo di riproducibilità (S R )

Matrici oggetto di validazione
Cod.
Cod.
II
II
II
II
II
II
III
III
I
I
I
I
Lab.
Lab.
1m
1m
2m
2m
3m
3m
4m
4m
5m
5m
6m
6m
7m
7m
8m
8m
9m
9m
10
10
m 11m
11m
12m
12m
1
1
2
2
mela
mela
zucchine
zucchine
3
3
pere
pere
limoni
limoni
lattuga
lattuga
4
4
mela
mela
farina
farina
5
5
pere
pere
pomodoro
pomodoro
loto
loto
uva
uva
vino
vino
6
6
mela
mela
7
7
mela
mela
8
8
patate
patate
9
9
10
10
zucchine
zucchine
11
11
mela
mela
farina
farina
12
12
mela
mela
insalata
insalata
13
13
mela
mela
pomodoro
pomodoro
limone
limone
zucchine
zucchine
fagiolo
fagiolo
farina
farina
totale
totale
7
7
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
3
3
1
1
Nota:
Con I, II e III sono stati indicati i gruppi di matrici
Con 1m,…,12m sono state indicate le matrici usate dai laboratori nella validazione

Validazione: matrici e livello di
concentrazione
Cod. Lab. 1m 2m 3m 4m 5m 6m 7m 8m 9m 10 m 11m 12m
1
2 mela (0,03;0,2) zucchine (0,03;0,2)
3 pere (0,1) limoni (0,1) lattuga (0,1)
4 mela (0,1) farina (0,2;0,4)
5 pere (0,1-0,3) pomodoro (0,1-0,4) Cachi (0,01) Uva (0,1-1) Vino(0,01-0,04)
6 mela (0,2-3)
7 mela (0,15)
8 patate (0,1)
9
10 zucchine (0,13)
11 mela (0,1) farina (cereali)
12 mela insalata
13 mela (0,04-0,2) zucchine (0,04-0,2) limone (0,04-0,2)pomodoro (0,04-0,2)fagiolo (0,04-0,2) farina (0,04-0,2)

Risultati validazione – matrici gr. II
Parametro Matrice n
Media
R% S R
CV%
Azinfos metile mela 6 111 27 24,4
Captano mela 6 89,9 14,7 16,4
Clorpirifos etile mela 6 89,1 15,2 17
Clorpirifos metile mela 6 86,5 18 20,9
Diclofluanide mela 6 84,8 10,2 12
Pirimicarb mela 6 91,8 9,6 10,4
Procimidone mela 6 86,4 9,6 11,1
Bromopropilato mela 5 86,8 11,3 13
Dimetoato mela 5 107 18,6 17,4
Fenitrotion mela 5 98,1 23,8 24,3
Fention mela 5 90,1 13 14,4
Iprodione mela 5 88,1 16,5 18,8
Vinclozolin mela 5 92,6 22,2 24
Azinfos etile mela 4 82,6 18,4 22,3
Cipermetrina mela 4 87,3 12,3 14,1
Clorfenvinfos mela 4 86,7 6,2 7,2
Deltametrina mela 4 82,8 17,7 21,3
Nota: dati cerchiati in rosso valore di CV % elevato
Pag. 1 di 2

Risultati validazione – matrici Gr. II
Parametro Matrice n
Media
R% S R
CV%
Diazinone mela 4 87,4 7,9 9
Endosulfan alfa mela 4 81,3 6,3 7,7
Endosulfan beta mela 4 84,6 14,5 17,2
Eptenofos mela 4 93,7 9 9,6
Fosalone mela 4 82,7 13,4 16,2
Lambda-cialotrina mela 4 72,8 5,6 7,7
Malation mela 4 87,5 9,6 11
Metidation mela 4 91 13,9 15,3
Paration etile mela 4 82,4 9,5 11,6
Paration metile mela 4 93,4 12,3 13,1
Pirazofos mela 4 84,5 11,7 13,9
Pirimifos metile mela 4 86,7 15,4 17,7
pp'-DDE mela 4 74,9 8,7 11,7
pp'-DDT mela 4 77,7 7,6 9,8
Propizamide mela 4 102 9,6 9,4
Tetradifon mela 4 80,6 16 19,9
captano Pomodoro 3 81,8 20,39 24,9
Nota: dati cerchiati in rosso valore di CV % elevato
Pag. 2 di 2

Risultati validazione – matrici Gr. I
Parametro Matrice n
Media
R% S R
CV%
Bromopropilato zucchino 4 85,5 8,73 10,2
Clorpirifos zucchino 4 94,4 7,65 8,1
diazinone lattuga 3 98,5 18,47 18,8
endosulfan alfa lattuga 3 90,2 3,01 3,3
iprodione lattuga 3 88,6 27,4 30,9
Nota: dati cerchiati in rosso valore di CV % elevato

Per tutti i laboratori che hanno partecipato alla
validazione dei metodi di prova è stato constatato
che lo scarto tipo di riproducibiltà (S R ), in fase di
validazione, rispettasse la condizione:
½ σ R ≤ S R ≤ ⅔ σ R o 0,5 ≤ Sr/σ H ≤ 0,66
dove:
‣ σ R
scarto tipo valutato con la relazione di Horwitz.
‣ S R
scarto tipo di riproducibilità calcolato dai dati medi dei laboratori atori con p.a.
comuni nella matrice esaminata
Questo consente di di esprimere il il risultato secondo la la seguente
relazione
(y (y ± (σ (σ R **K))
dove: dove:
y y = valore valore misurato misurato
σ R scarto tipo di riproducibilità secondo Horwitz
R = scarto tipo di riproducibilità secondo Horwitz
K = fattore fattore di di copertura copertura

Dai proficiency test…
‣ Vengono considerati i p.a. comuni a più
laboratori
‣ Sono considerati solo i p.a. che presentano
almeno 4 dati dopo l’elaborazione statistica
‣ Questi parametri, , unitamente a quelli
derivanti dalla validazione dei metodi, sono
i parametri proposti per il metodo di prova

Dal Rapporto Istisan 97/24
Possiamo valutare il valore massimo di CV% fra laboratori
per ogni valore di concentrazione:
Livello residuo Grado di imprecisione interlaboratorio Grado di precisione intralaboratorio
mg/kg CV % CV %
0.0001 64 43
0.001 45 30
0.01 32 21
0.01 23 15
1 16 11
10 11 7

Risultati da profinciecy test
matrici del Gruppo I
matrice parametro n. v.v. M S R CV% ds H CV% Istisan Verifica CV
lattuga paration 9 0,216 0,185 0,041 22,3 0,038 23 Ok
lattuga diazinone 8 0,109 0,094 0,014 14,7 0,021 23 Ok
lattuga oxadixil 7 0,153 0,18 0,031 17,1 0,037 23 Ok
lattuga fosmet 7 0,167 0,178 0,037 20,5 0,037 23 Ok
lattuga ometoato 7 0,042 0,068 0,017 24,6 0,015 32 Ok
lattuga mevinfos 6 0,167 0,203 0,023 11,1 0,041 23 Ok
lattuga propizamide 6 0,387 0,387 0,043 11,1 0,071 23 Ok
cetriolo deltametrina 5 0,287 0,297 0,043 14,3 0,057 23 Ok
cetriolo pirimifos m 5 0,524 0,589 0,037 6,2 0,102 20 Ok
cetriolo propoxur 5 0,453 0,415 0,053 12,7 0,076 20 Ok
cetriolo permetrina 5 0,706 0,97 0,16 16,5 0,156 20 Ok
cetriolo vinclozolin 4 0,149 0,183 0,016 8,7 0,038 23 Ok
Nota:
Verifica CV indica il confronto fra CV% e CV% Istisan
Legenda: v.v. = valore vero; M = media; S R
: scarto tipo di riproducibilità; d SH
: scarto
tipo valutato con la relazione di Horwitz

Risultati da profinciecy test
matrici del Gruppo II
matrice parametro n. v.v. M S R CV% ds H CV% Istisan Verifica CV
pomodoro azoxistrobina 7 0,225 0,232 0,036 15,4 0,046 23 Ok
pomodoro clortalonil 7 1,626 1,545 0,186 12 0,231 16 Ok
pomodoro tiabendazolo 5 1,9 1,873 0,307 16,4 0,273 16 No
Uva Carbaril 5 0,263 0,225 0,03 13,4 0,045 23 Ok
Uva ciprodinil 4 0,119 0,066 0,008 11,9 0,014 23 Ok
Uva fenexamide 4 0,381 0,202 0,037 18,1 0,041 23 Ok
Uva diazinone 4 0,115 0,154 0,033 21,5 0,033 23 Ok
Nota:
Verifica CV: indica il confronto fra CV% e CV% Istisan (Ok:riscontro positivo;
NO: riscontro negativo)
Legenda: v.v. = valore vero; M = media; S R
: scarto tipo di riproducibilità; d SH
: scarto
tipo valutato con la relazione di Horwitz

Risultati da profinciecy test
matrici del Gruppo III
matrice parametro n. v.v. M S R CV% ds H CV% Istisan Verifica CV
Arancia cipermetrina 5 0,389 0,319 0,06 18,9 0,061 23 Ok
Arancia clorpirifos m 5 0,05 0,048 0,012 25,5 0,011 32 Ok
Arancia metidation 5 1,62 1,827 0,319 17,5 0,267 16 No
Arancia clorpirifos 4 0,516 0,522 0,09 17,3 0,092 20 Ok
Arancia diazinone 4 0,49 0,474 0,02 4,3 0,085 20 Ok
Nota:
Verifica CV: indica il confronto fra CV% e CV% Istisan (Ok:riscontro positivo;
NO: riscontro negativo)
Legenda: v.v. = valore vero; M = media; S R
: scarto tipo di riproducibilità; d SH
: scarto
tipo valutato con la relazione di Horwitz

Pertanto….
‣ Dai dati della validazione dei laboratori
su alcuni matrici (mele, lattuga, pomodoro,
zucchino) appartenenti ai gruppi I e II II
‣ Dai risultati dei profinciency test su p.a.
comuni a più laboratori appartenenti ai
gruppi I, I, II II e III
Si dispone di un elenco di s.a. delle quali
si conoscono i dati di riproducibilità

Elenco delle s.a.
Matrici dei gruppi I e III
parametri
matrice
deriva da
parametri
matrice
deriva da
bromopropilato zucchino v propizamide
Clorpirifos zucchino v deltametrina
clozolinate zucchino v permetrina
azinfos metile lattuga v pirimifos m
diazinone lattuga v, pt propoxur
endosulfan alfa lattuga v vinclozolin
lattuga
cetriolo
cetriolo
cetriolo
cetriolo
cetriolo
pt
pt
pt
pt
pt
pt
fosmet
lattuga pt cipermetrina arancia pt
iprodione lattuga v clorpirifos m arancia pt
mevinfos
ometoato
oxadixil
lattuga pt metidation arancia pt
lattuga pt clorpirifos arancia pt
lattuga pt diazinone arancia pt
paration
lattuga pt Di colore rosso s.a. con Sr elevato
Legenda:
v: informazione derivante dalla procedura di validazione adottata dai laboratori
pt: informazione derivante dai profinciency test

Elenco delle s.a. Matrici gruppo II
parametri
matrice
deriva da
parametri
matrice
deriva da
Azinfos mela v Metidation mela v
Azinfos metile mela v Paration mela v
Bromopropilato mela v Paration metile mela v
Captano mela v Pirazofos mela v
Cipermetrina mela v Pirimicarb mela v
Clorfenvinfos mela v Pirimifos metile mela v
Clorpirifos mela v pp'-DDE mela v
Clorpirifos metile mela v pp'-DDT mela v
Deltametrina mela v Procimidone mela v
Diazinone mela v Propizamide mela v
Diclofluanide mela v Tetradifon mela v
Dimetoato mela v Vinclozolin mela v
Endosulfan alfa mela v captano Pomodoro v
Endosulfan beta mela v azoxistrobina pomodoro pt
Eptenofos mela v clortalonil pomodoro pt
Fenitrotion mela v tiabendazolo pomodoro pt
Fention mela v Carbaril Uva pt
Fosalone mela v ciprodinil Uva pt
Iprodione mela v fenexamide Uva pt
Lambda-cialotrina mela v diazinone Uva pt
Malation mela v Legenda: v: validazione; pt: profinciency test
Di colore rosso s.a. con Sr elevato

Proposta di metodo di prova…
‣ Pesare X g di campione (con X compreso fra: 5 e 15 g)
‣ Mescolare il campione con circa 20 g di terra di diatomee
‣ Eluizione:
• Manuale: porre il campione disperso nella colonna
cromatografica.
• Automatica: con l’ausilio di apposita apparecchiatura
‣ Eluire con un volume di:
• V 1 ml se etile acetato (con V 1 compreso fra 25 e 80 ml)
• V 2 ml se diclorometano (con V 2 compreso fra 100 e 150 ml)
‣ Raccogliere l’eluato
e evaporare il solvente
‣ Possibile purificazione del campione
‣ Analisi strumentale
• stessi rivelatori impiegati dai laboratori per le medesime matrici ed i
medesimi p.a. nei proficiency test e nella fase di validazione

Considerazioni sul metodo…
Il Il metodo di di prova, , qualora condiviso e redatto dal
gruppo di di lavoro AAAF, verrà proposto al al Ministero
della Salute quale “metodo“
ufficiale per il
il
controllo dei residui dei prodotti fitosanitari
nell’ortofrutta”
Il Il gruppo di di lavoro AAAF predisporrà altresì un
documento riguardante le le modalità di di validazione
del metodo di di prova al al fine di di adottare,
compatibilmente con i i sistemi di di gestione della
qualità in in essere nelle singole agenzie, modalità ed
atteggiamenti comuni.

GRUPPO DI LAVORO
APAT - ARPA - APPA
FITOFARMACI
Grazie a tutti
per l’attenzione
Dr Marco Morelli
Arpa Regione Emilia Romagna
Sezione Provinciale di Ferrara
Eccellenza Fitofarmaci
Tel. 0532 900374 fax 0532 901018
E-mail: mamorelli@arpa.emr.it