di - Sezione di Microbiologia

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Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
Neisseria meningitidis
Patogenesi e Diagnosi
Oliviero E. Varnier
2012
Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)

Neisseria meningitidis
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MALATTIA MENINGOCOCCICA: 7 NOTE
1. La prima descrizione di una malattia meningococcia risale al 16° secolo
2. La prima identificazione della malattia è del 1805 (Vieusseux M et al. J Med Chir
Pharmacol, 1805)
3. Il primo isolamento di Neisseria meningitidis avvenne nel 1887 (Weichselbaum A.
Fortschr Med, 1887)
4. È la causa principale delle meningiti batteriche e delle sepsi negli USA e di
epidemie nell’Africa sub-sahariana
5. La vaccinazione dei soggetti a rischio è attualmente una delle migliori strategie di
sanità pubblica per il controllo di una grave epidemia
6. Vaccini coniugati simili a quello per Haemophilus influenzae di tipo B sono in fase
avanzata di sviluppo e di sperimentazione
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Epidemiologia 1
I sierogruppi B e C sono responsabili della maggior parte dei casi in Europa
e nelle Americhe, mentre A e C sono predominanti in Asia e Africa.
Il gruppo B ha causato il 68% dei casi in Europa dal 1993 al 1996 ed
epidemie in paesi in via di sviluppo con un’incidenza di 5-50 casi per
100.000 persone.
In assenza di un efficace vaccino per il gruppo B, un’epidemia più diffusa
potrebbe avere morbilità e mortalità molto elevate.
Nella “cintura delle meningiti” africana, che va dall’Etiopia al Senegal, da
oltre 100 anni il gruppo B è un dramma sanitario ricorrente. L’incidenza della
malattia meningococcica è molte volte maggiore in questa regione che nei
paesi industrializzati: la mortalità è molto superiore al 10% in quanto i
pazienti muoiono prima di arrivare all’ospedale!
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Epidemiologia 2
Le infezioni causate da Hib, S. pneumoniae, e N. meningitidis sono
la causa dell’alta morbidità e mortalità nei bambini nell’Africa Sub-
Sahariana.
• L’Hib causa da 100,000 a 160,000 decessi infantili ogni anno nella
regione africana controllata dall’WHO.
• Lo S.pneumoniae causa da 250,000 a 400,000 morti pediatriche per
anno.
• La N.meningitidis è responsabile di grandi epidemie (che causano
migliaia di morti) in molti stati dell’Africa Orientale e Centrale.
Le epidemie si osservano ogni 8-12 anni con incidenza da 500 a
1000 casi per 100.000 persone. La più grande epidemia mai
descritta è stata nel 1996 con 152.813 casi e 15,783 decessi.
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Epidemia negli USA
Negli ultimi decenni si sono
osservati da 0,9 a 1,5 casi
per 100.000 persone per
2.500-3.000 casi all’anno.
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Epidemiologia 3
La malattia meningococcica si osserva durante tutto l’anno, la maggior
parte dei casi si ha durante l’inverno e l’inizio della primavera.
L’incidenza della malattia è più elevata nei neonati, nei quali non si sono
ancora prodotti anticorpi neutralizzanti.
L’incidenza diminuisce dopo l’infanzia, aumenta durante l’adoloscenza e
nella prima giovinezza.
Nonostante i casi diminuiscano nei giovani adulti, si hanno più casi nel
gruppo di età dai 23 ai 64 anni: dal 1992 al 1996, il 28% dei pazienti
aveva da 12 a 29 anni
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Patogenesi
L’uomo è l’unico ospite naturale della N. meningitidis
Il nasofaringe è il sito dal quale i meningococchi si
trasmettono mediante aereosol o secrezioni
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Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
Funzione
Protegge dalla
fagocitosi e
batteriolisi
CAPSULA
Classificazione
13 sierogruppi: A, B,
C, E-29,H, I, K, L, M,
W-135, X, Y, Z
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Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
Proteine esterne della membrana
Componente
Porine
PorA/ PorB
Opacity
associated
proteins
Opa
Opc
Funzione
Creano pori attraverso
i quali passano piccoli
soluti idrofilici
Promuovono adesività
alle cellule ospiti e ai
leucociti
Promuovono adesività
alle cellule ospiti
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Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
Proteine esterne della membrana
Componente
Lipooligosaccaride
Pili
Funzione
Potente attività endotossica
Adesione iniziale alle cellule
epiteliali ed endoteliali
e agli eritrociti
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PATOGENESI
PATOGENESI dell’INFEZIONE MENINGOCOCCICA
1. Colonizzazione
del naso-faringe
2. Invasione
dell’ epitelio
3. Invasione
del sangue
4 disseminazione
Liquor e Tessuti
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La Colonizzazione del Nasofaringe
1) I pili sono le principali adesine che
possono legarsi al recettore CD46, una
proteina cofattore di membrana;
2) di seguito, le “opacity associated proteins”
(Opa e Opc) si legano ai recettori
CD66e (antigene carcinoembrionale) e
ad altre molecole.
3) questo legame stimola l’intrappolamento da parte delle cellule epiteliali
dei meningococchi, che quindi attraversano l’epitelio mucosale mediante
vacuoli fagocitari.
4) La sopravvivenza dei meningococchi nelle cellule epiteliali può essere
promossa da una proteasi IgA1 e da porB.
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Colonizzazione
I meningococchi:
1. superano le difese dell’ospite
2. si attaccano alle cellule cilindriche epiteliali non cigliate della
mucosa del nasofaringe,
3. si moltiplicano in esse (colonizzazione)
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Meningococcemia
Il 5-10% degli adulti sono portatori nasofaringei asintomatici di ceppi di N.
meningitidis, la maggior parte dei quali non sono patogeni.
In un numero limitato di persone, la N. meningitidis penetra nella mucosa e arriva nel
circolo sanguigno, causando una malattia sistemica.
Nella maggior parte delle persone, lo
stato di portatore è un processo di
immunizzazione che comporta una
risposta anticorpale protettiva.
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FATTORI DI RISCHIO
Fattori favorenti la sopravvivenza intravascolare
LA CAPSULA
I meningococci comprendono organismi diversi: la maggior parte dei quali
sono batteri commensali nell’uomo.
Solo una minoranza dei ceppi del nasofaringe causa una malattia invasiva.
I meningococchi associati con la malattia invasiva producono una capsula,
che protegge dalla batteriolisi mediata dal complemento, dalla fagocitosi,
dalla disidratazione durante la transmissione e contribuisce a evadere i
meccanismi immunitari dell’ospite.
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Fattori di Rischio
meccanismi di acquisizione di sostanze nutritive: ferro da
lattoferritina, transferrina ed emoglobina umane
le adesine (i pili)
liberazione di vescicole derivate dalla membrana esterna contenenti
lipooligosaccaride (endotossina), proteine della membrana esterna,
fosfolipidi e polisaccaridi capsulari
Neisseria meningitidis – liberazione di endotossina dalla membrana esterna
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PATOGENESI
Meningococchi vanno incontro ad autolisi con rilascio di DNA e
componenti della parete cellulare, che inducono una cascata
infiammatoria.
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VIRULENZA
I meningococchi hanno la capacità di scambiare il materiale
genetico responsabile per la produzione della capsula e
pertanto di passare dal sierogruppo B a quello C e
viceversa:
questo “scambio di capsula” può diventare un importante
meccanismo di virulenza con l’ampio uso di vaccini che
forniscono una protezione sierogruppo-specifica.
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Eterogeneicità Antigenica delle Neisserie
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Colonizzazione di Neisseria
meningitidis nel nasofaringe
entrata nel circolo sanguigno
Entrata nel liquido cefalorachidiano
SEPSI e MENINGITE
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Manifestazioni cutanee della Meningococcemia: petecchie
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DIAGNOSI
La classica diagnosi di laboratorio di malattia meningococcica
su basa su:
Esame colturale: scarsa sensibilità, in particolare quando
eseguito dopo l’inizio di una terapia antibiotica
Esame microscopico dopo colorazione con Gram: è
importante e può essere utile
Metodi non colturali: ricerca antigeni polisaccaridici:
rapidi, specifici, possono fornire una diagnosi gruppo
specifica. Possibili falsi positivi.
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Esame Microscopico dopo Colorazione con Gram
Neisseria meningitidis (freccia) nel liquor (Gram,
x1000). Diplococchi Gram-negativi intracellulari
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Esame Colturale per N. meningitidis e tipizzazione del sierogruppo B
mediante agglutinazione con sieri specifici
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Ricerca di Antigeni Batterici
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DIAGNOSI
Amplificazione genica (PCR)
Specificità
Identifica organismi non-viventi
(in pazienti in terapia)
Rapidità d’esecuzione
Single Strand RNA
1 cicle = 1 (RNA/cDNA hybrid)
2 cicles = 2
3 cicles= 4
4 cicles = 8
5 cicles = 16
6 cicles = 32
7 cicles = 64
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TEMPI DI REFERTAZIONE DELLA DIAGNOSTICA CLASSICA
Primi due casi
15 marzo 2004 ore 05:00: decesso di PO
ore 10.00: decesso di DMS
16 marzo 2004 ore 12:00: autopsie e raccolta campioni
17 marzo 2004 ore 09:00: isolamento di N.meningitidis da
liquor, saliva e tamponi nasali
18 marzo 2004 0re 09:00: tipizzazione N.meningitidis tipo B
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LightCycler Real Time PCR
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Concetti Moleculari: Sonde d‘Ibridizzazione
Principio: ibridizzazione adiacente e FRET
EXCITATION
NON DETECTED
EMISSION
EXCITATION FRET
DETECTED
EMISSION
AMPLICON
AMPLICON
Annealing
1-5 nt
Fluorescein (donor) LC RED640/705 (acceptor) Phosphate
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LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis
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Identificazione di N.meningitidis
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Identificazione di N.meningitidis mediante
Analisi della Temperatura di Melting
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Identificazione di Neisseria meningitidis di tipo B
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Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo B
N. meningitidis B - melting curve analisys
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Identificazione di Neisseria meningitidis di tipo C
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Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo C
Neisseria meningitidis C - melting curve analisys
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CASI CLINICI
Nel marzo 2004 sono deceduti in Genova due bambini di
19 (PO) e 21 (DMS) mesi, che frequentavano lo stesso
asilo nido nel comune di S. Olcese
Identico il breve decorso della malattia: comparsa di
febbre elevata, evoluzione ingravescente con vomito,
petecchie ed exitus.
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PROTOCOLLO MEALATTIE INFETTIVE CONTAGIOSE
Sulla base del sospetto clinico di malattia infettiva
contagiosa, l’Autorità Giudiziaria dispone l’autopsia
nominando un articolato gruppo di periti, al fine di:
1. Identificare l’agente infettivo
2. Escludere altre cause di morte:
a) avvelenamento
b) intossicazione
c) altra malattia pediatrica
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TEAM APPROACH
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PRELIEVI DA EFFETTUARSI IN CORSO DI
AUTOPSIA PRIMA DELLA RIMOZIONE O
ALL’ATTO DELL’APERTURA DEGLI ORGANI:
2.A Per esami tossicologici
2.B Per esami Microbiologici
2.C Per indagini metaboliche
2.B Per esami microbiogici
1) un campione di sangue
2) un campione di midollo osseo ottenuto mediante
puntato sternale o biopsia della cresta iliaca
3) un campione di contenuto gastrico
4) un campione di feci
5) tampone faringeo
6) tampone bronchiale
7) tampone polmonare
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Meningite meningococcica (P.O.)
Courtesy of Ezio Fulcheri
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Meningite meningococcica (DM.)
Courtesy of Ezio Fulcheri
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Surrenalite Emorragica Bilaterale
Courtesy of Ezio Fulcheri
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Encefalo e Meningi
DIAGNOSI
Meningite acuta da Neisseria meningitidis di gruppo B con edema cerebrale,
surrenalite emorragica bilaterale e petecchie alla cute ed alle mucose; stasi
poliviscerale ed edema polmonare terminale.
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PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO
1. prelievi da effettuarsi prima del riscontro autoptico
Un tampone nasale per ciascuna narice
Un tampone orofaringeo
Un tampone anale
Liquido cefalorachidiano (ottenuto sterilmente con puntura
lombare)
2. prelievi da effettuarsi in corso di autopsia prima della
rimozione o all’atto dell’apertura degli organi
3. il riscontro diagnostico con procedura congiunta
anatomo-patologica e medico legale
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Casi Clinici con Sospetta Meningite Batterica
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20 Casi di Sospetta Meningite Batterica
20 casi di sospetta meningite batterica: 12 maschi e 8 femmine di età da 4
mesi ad 80 anni
9 deceduti
Meningococcus meningitidis è stato identificato in 7 pazienti: 3 ceppi erano
di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C
Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 3 pazienti.
Mycobacterium tuberculosis è stato identificato in 1 paziente.
3 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi:
S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata
IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis
ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale
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Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare
Il 17 maggio 2004, alle ore 15.30, è stata autorizzata la raccolta dei seguenti
campioni per eseguire gli esami microbiologici: liquor, tampone narice destra e
sinistra.
Il DNA è stato estratto dai 3 campioni, ed è stata eseguita una amplificazione
genica per l’identificazione di Neisseria meningitidis mediante Real Time PCR
LightCycler specifica per le sequenze del gene “Capsular transport ctrA”.
Tutti i tre campioni analizzati sono risultati positivi per la presenza di
sequenze specifiche di N. meningitidis.
Il 17 maggio 2004, alle ore 18.39, circa tre ore dopo la raccolta dei campioni, i
risultati sono stati comunicati telefonicamente e via e-mail alle autorità sanitarie
regionali.
Il 18 maggio 2004, alle ore 10.00, circa 18 ore dal prelievo dei campioni, la
ripetizione delle prove di tipizzazione sui ceppi isolati di Neisseria meningitidis con
sieri tipo-specifici è risultata positiva per il gruppo C
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Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare
LIGHTCYCLER REAL TIME PCR
L’assenza di Neisseria meningitidis nel liquor del paziente SC è stata
confermata 3 ore dalla raccolta del campione di liquor e ha evitato una
inutile profilassi.
L’identificazione di Neisseria meningitidis e la tipizzazione del ceppo (C)
nel campione di liquor del paziente FG sono state completate in meno di
4 ore.
N.meningitidis è stata diagnosticata nel liquor del paziente FA con esame
microscopico dopo colorazione con Gram e ricerca degli antigeni. È stata
fatta la profilassi in circa 500 persone esposte e sono stati chiusi due uffici
ed una scuola. Poiché la clinica non correlava con la diagnosi, una
aliquota del campione di liquor è stata inviata ai nostri laboratori e dopo 3
ore abbiamo refertato la presenza di S.pneumoniae.
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LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis, Streptococcus
pneumoniae e Haemophylus influenzae tipo B
N.meningitidis Capsular transport ctrA Tm
ctrA F gCTgCggTAggTggTTCAA 58,9°C
ctrA A TgTCgCggATTTgCAACTAA 58,2°C
ctrA FL TTCgTACTACATTgCCACgTgTCAgC X 64,4°C
ctrA LC CACATTCgTATCCTgCACATTTgCC p 64,3°C
H. influenzae DNA Gyrase (gyrA) Tm
gyrA F AAATCAgCgCgTgTTgT 53.4°C
gyrA R CCATCATAgTTTggCgAgAA 54.1°C
gyrA FL gCTgCAATgCgTTATACCgAAgT--FL 61.1°C
gyrA LC CgTATgCAAAAAATTACgCAAgCATTACT--PH 63.7°C
S. pneumoniae Pneumolysin gene (ply) Tm
ply F TgCAgAgCgTCCTTTggTCTAT 59.6°C
ply R CTCTTACTCgTggTTTCCAACTTgA 59.2°C
ply TM TggCgCCCATAAgCAACACTCgAA XT--PH 70.1°C
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DIAGNOSI di Meningite Batterica
LightCycler RealTime PCR per:
• Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis
• Tipizzazione di N.meningitidis A, B e C
• Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae
• Identificazione di Mycobacterium spp
• Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium
• Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato
• Tipizzazione di Borrelia afzelii, Borrelia garinii, e B. burgdorferi sensu stricto
• Identificazione e quantificazione di Listeria monocytoge-nes
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PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO
TEAM APPROACH
Microbiologia – Università
Claudio Giacomazzi
Maddalena Perotti
Isabella Martini
Jennifer McDermott
Anatomia Patologica - Università
G. Gaggero
M. Mora
Ezio Fulcheri
Malattie Infettive – Università
Claudio Viscoli
Matteo Bassetti
Gabriella Pagano
Medicina Legale – Università
Benedicta Astengo
Francesco Ventura
A. Gianelli Castiglione
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DOMANI: MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION
Meningitis is one of the most terrifying diseases.
It can be fatal in hours yet its early symptoms resemble selflimiting
conditions like flu and colds…..
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MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION
1.Streptococcus pneumoniae
2. Neisseria meningitidis
3. Streptococcus gruppo B
4. Haemopjlus influenzae
5. Listeria monocytogenes
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