Biologia Molecolare Computazionale

Biologia Molecolare Computazionale
Paolo Provero - paolo.provero@unito.it
2008-2009

Argomenti
◮ Allineamento di sequenze
◮ Ricostruzione di alberi filogenetici
◮ Gene prediction

Allineamento
Allineamento di sequenze
1. Scoring
2. Algoritmi esatti (programmazione dinamica)
3. Algoritmi euristici (BLAST)
4. Allineamento multiplo

Allineamento di sequenze
Problema
Date due sequenze (nucleotidiche, aminoacidiche o altro)
determinare se sono sufficientemente simili da farci ritenere
che siano derivate da un progenitore comune attraverso
processi di mutazione.

Allineamento
Un esempio di allineamento delle sequenze
CGGGTATCCAA e CCCTAGGTCCCA è
C G G G T A - - T C C A A
C C C - T A G G T C C C A
◮ Il simbolo “-” (indel) rappresenta un’inserzione o una
delezione avvenuta durante la storia evolutiva che ha
portato alle due sequenze
◮ Una sequenza di L indel consecutivi si dice gap di
lunghezza L: questo allineamento ha un gap di lunghezza
1 e uno di lunghezza 2

Tipi di allineamento
◮ Globale: si allineano le sequenze intere
◮ Locale: si allineano sottosequenze delle sequenze di
partenza
◮ Gapped: sono permessi indels
◮ Ungapped: non sono permessi indel
◮ Pairwise: di due sequenze
◮ Multiple: di più di 2 sequenze

Score di un allineamento
◮ Due possibili allineamenti di CTGTA e CGTA
C T G T A
1.
C - G T A
2.
C T G T A -
- C - G T A
◮ Il primo è migliore in quanto richiede un numero minore di
cambiamenti (sostituzioni e inserzioni/delezioni)
◮ E’ necessario definire uno score per confrontare
quantitativamente gli allineamenti

Scoring per allineamenti di sequenze nucleotidiche
◮ Per il momento adottiamo uno score semplice:
◮ Ogni match conta +1
◮ Ogni mismatch conta -1
◮ Ogni indel conta -2
◮ Esempio 1:
C T G T A
C - G T A
+1 -2 +1 +1 +1 +2
◮ Esempio 2:
C T G T A -
- C - G T A
-2 -1 -2 -1 -1 -2 -9

Algoritmi di allineamento
◮ Gli algoritmi di allineamento risolvono il seguente
problema: dato un sistema di scoring e due sequenze,
trovare l’allineamento (gli allineamenti) con lo score più
alto tra tutti quelli possibili
◮ Gli algoritmi esatti individuano certamente il migliore
allineamento, ma richiedono molte risorse di calcolo
1. Needleman-Wunsch: global gapped alignments
2. Smith-Waterman: local gapped alignments
◮ Gli algoritmi euristici non garantiscono che l’allineamento
trovato sia il migliore possibile, ma sono molto più veloci
1. BLAST (gapped or ungapped local alignments)

Perché abbiamo bisogno di algoritmi
◮ In linea di principio sarebbe possibile trovare l’allineamento
ottimale di due sequenze semplicemente:
1. Scrivere tutti gli allineamenti possibili
2. Calcolare il relativo score
3. Scegliere il migliore
◮ Tuttavia questo è possibile soltanto per sequenze molto
corte, in quanto il numero di allineamenti possibili cresce
molto rapidamente al crescere della lunghezza della
sequenza

Perchè abbiamo bisogno di algoritmi
◮ Supponiamo di avere due sequenze di n = 1000 residui
◮ Il numero di allineamenti possibili è
( 2n
N =
n
)
∼ 22n
√ πn
= 22000
√
1000π
∼ 2 · 10 600

Programmazione dinamica
◮ Gli algoritmi di programmazione dinamica suddividono il
problema iniziale (trovare l’allineamento ottimale di due
sequenze) in sottoproblemi più semplici e costruiscono
progressivamente la soluzione del problema globale
usando le soluzioni dei sottoproblemi
◮ L’algoritmo di Needleman-Wunsch calcola lo score
dell’allineamento ottimale di due sequenze in base agli
score degli allineamenti ottimali delle loro sottosequenze,
progressivamente più lunghe

Algoritmo di Needleman-Wunsch
◮ Sequenze:
x = X 1 X 2 . . . X m
y = Y 1 Y 2 . . . Y n
◮ L’algoritmo costruisce la matrice B tale che B ij è lo score
dell’allineamento ottimale tra le prime i lettere di x e le
prime j lettere di y
◮ I valori di B ij vengono calcolati progressivamente fino a
ottenere B mn , che è lo score dell’allineamento ottimale tra
x e y

Algoritmo di Needleman-Wunsch
◮ L’algoritmo di Needleman-Wunsch si basa sul fatto
seguente:
se si conoscono B i−1,j , B i,j−1 e B i−1,j−1 è possibile
calcolare B ij
◮ Una volta ottenuto lo score dell’allineamento ottimale il
traceback consente di ottenere l’allineamento o gli
allineamenti corrispondenti

Esercizio
Trovare un allineamento globale ottimale tra le sequenze
CATT
GAATCT
Soluzione: score -2
Allineamento (non l’unico):
C - A T - T
G A A T C T
-1 -2 +1 +1 -2 +1 -2

Algoritmo di Smith-Waterman
◮ L’algoritmo di Smith-Waterman trova l’allineamento locale
ottimale tra due sequenze, ovvero l’allineamento di score
più alto tra tutti quelli possibili tra una qualsiasi
sottosequenza di x e una qualsiasi sottosequenza di y
◮ L’algoritmo procede in modo simile a Needleman-Wunsch
eccetto che:
1. Ogni volta che B ij è negativo, si scrive 0
2. Il traceback non parte da B mn ma dallo score più alto
trovato sulla tabella

Esercizio
Trovare un allineamento locale ottimale tra le sequenze
CATT
GAATCT
Soluzione: score 2
Allineamento:
A T
A T
+1 +1 +2

Gap penalties
◮ Il tipo di gap penalty che abbiamo usato si chiama lineare:
la penalty (score negativo) associata a un gap è
proporzionale alla lunghezza del gap:
δ(L) = −d · L
◮ Un altro tipo di gap penalty usato spesso si chiama affine:
δ(L) = −d − (L − 1) · e
con e < d. In questo modo aprire un nuovo gap è più
penalizzato che allungarne uno esistente

Gap penalty affine: esempio
◮ Esempio: d = 2, e = 1
A C C C T
A - - C T
+1 -3 +1 +1 0
A C C C T
A - C - T
+1 -2 +1 -2 +1 -1

Allineamento di sequenze aminoacidiche
◮ Nel caso di allineamento di sequenze di aminoacidi, un
sistema di scoring come quello usato per le sequenze
nucleotidiche non è adeguato, in quanto alcune sostituzioni
sono più probabili di altre
◮ Quindi i mismatch avranno score diversi a seconda degli
aminoacidi coinvolti (matrici di sostituzione)
◮ Gli algoritmi di allineamento funzionano nello stesso modo,
eccetto che lo score per un match/mismatch varia a
seconda degli aminoacidi coinvolti
◮ Le matrici di sostituzione più usate sono BLOSUM e PAM

Esercizio
Usare le matrici di sostituzione BLOSUM62 e una linear gap
penalty uguale a -5 per trovare un allineamento ottimale
globale tra le sequenze
HAG
HEAE
Soluzione: score 5
Allineamento:
H - A G
H E A E
8 -5 4 -2 5

BLAST
Algoritmo euristico per allineare
◮ Query sequence vs target sequence
◮ Query sequence vs sequence database
Versione originale: ungapped alignments.
BLAST2: gapped alignments.

BLAST steps (simplified)
1. Generare una lista di tutte le parole di k (p.es. k = 3 per
proteine) lettere nella query
PQGEFG → (PQG, QGE, GEF, EFG)
2. Per ognuna di queste generare una lista di tutte le possibili
parole di 3 lettere che allineate danno un punteggio
maggiore di una soglia T (p.es. T = 13 con BLOSUM62)
PQG → PQG (18) PEG (15) . . .
3. Cercare nella sequenza target queste parole ed allinearle
alla parola della query
4. Estendere in modo massimale gli allineamenti nelle due
direzioni (ottenendo gli High Scoring Pairs)
5. Se possibile unire gli HSP per ottenere allineamenti più
lunghi.

BLAST

Grafi
◮ Un grafo è un insieme di nodi e di archi
◮ Ogni arco unisce due nodi
◮ Un cammino tra il nodo n e il nodo m è una successione di
archi consecutivi che porta da n a m
◮ Un circuito è un cammino tra un nodo e se stesso
◮ Un grafo è connesso se per ogni coppia di nodi (n, m)
esiste un cammino tra n e m

Alberi
◮ Un grafo connesso e privo di circuiti si dice albero
◮ Dati due nodi di un albero, esiste uno e un solo cammino
che li unisce
◮ Un albero si dice binario senza radice se ogni nodo è
connesso a uno o tre archi
◮ Un albero si dice binario con radice se ogni nodo è
connesso a uno o tre archi, tranne un unico nodo, la
radice, che è connesso a due archi
◮ I nodi connessi a un solo arco si dicono foglie

Ricostruzione di alberi filogenetici
◮ Problema: dato un insieme di specie attualmente esistenti
ricostruire l’albero filogenetico che riproduce il percorso
evolutivo attraverso il quale esse sono derivate da un
antenato comune
◮ L’albero filogenetico è rappresentato da un albero binario,
con o senza radice
◮ La lunghezza degli archi è proporzionale al tempo
trascorso tra gli eventi di speciazione
◮ Le specie esistenti sono rappresentate dalle foglie
◮ La radice, se specificata, rappresenta l’antenato comune
◮ Se l’albero filogenetico è senza radice, non è specificata la
direzione del tempo evolutivo tra nodi interni

Ricostruzione di alberi filogenetici
◮ Distance methods
◮ Parsimony methods
◮ Statistical methods

Distanze
◮ Una distanza è una regola per associare a ogni coppia
(x, y) di punti di un insieme S un numero d(x, y) ≥ 0 tale
che
1. d(x, y) = 0 se e solo se x = y
2. d(x, y) = d(y, x)
3. d(x, y) + d(y, z) ≥ d(x, z)
◮ Per esempio la distanza geometrica tra punti di un piano
soddisfa questi assiomi

Distanza evolutiva
◮ La distanza evolutiva tra due specie esistenti si può
definire come il doppio del tempo trascorso dal loro
antenato comune più recente
◮ E’ facile convincersi che questa definizione soddisfa gli
assiomi che definiscono una distanza
◮ Se si considera un albero filogenetico con radice, la
distanza evolutiva tra le specie x e y è proporzionale alla
lunghezza del cammino tra x e y

Distanza ultrametrica
◮ La distanza evolutiva ha la seguente proprietà:
dati tre punti x, y, z e le tre distanze tra di essi, due di
queste sono uguali tra loro e maggiori della terza
◮ Una distanza che soddisfi queste proprietà si dice
ultrametrica

Metodi basati sulle distanze
◮ Vedremo due metodi basati sulle distanze:
1. UPGMA: ricostruisce alberi filogenetici con radice
2. Neighbor joining: ricostruisce alberi filogenetici senza
radice
◮ L’algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using
Arithmetic averages) permette di risolvere il problema
seguente:
dato un insieme di specie esistenti e le loro distanze
evolutive, ricostruire l’albero filogenetico con radice che ne
rappresenta l’evoluzione da un antenato comune

UPGMA
1. Individuare le due specie più vicine tra le N esistenti
2. Definire un nuovo nodo come loro antenato comune,
ponendolo all’altezza uguale a metà della distanza tra i
due nodi
3. Eliminare le due specie dalla lista e sostituirle con
l’antenato comune
4. Ripetere con la nuova lista di N − 1 specie
5. Ripetere fino a che la lista contiene una sola specie (la
radice = antenato comune)
6. Si può dimostrare che il metodo riproduce l’unico albero
filogenetico con radice che riproduce le distanze evolutive

Distanza tra gruppi
◮ Per calcolare la distanza tra nodi interni si usa la formula
d(A, B) = 1
n A n B
∑
x∈A;y∈B
d(x, y)

Esempio
◮ Le distanze evolutive tra 4 specie sono date nella tabella
seguente (Mya)
Human Chimp Bonobo Gorilla
Human 0 12 12 14
Chimp 12 0 4 14
Bonobo 12 4 0 14
Gorilla 14 14 14 0
◮ Verificare la proprietà ultrametrica
◮ Ricostruire l’albero filogenetico con radice usando UPGMA

UPGMA in pratica
◮ In pratica le distanze evolutive in genere non sono note
◮ Si usano allora distanze surrogate, chesi suppone siano
approssimativamente proporzionali alle distanze evolutive
◮ Le distanze surrogate in genere non sono ultrametriche
◮ La conseguenza è che le distanze calcolate sull’albero
così prodotto non sono uguali alle distanze in input

Esempio
◮ Considerare la matrice di distanza tra 3 specie:
A B C
A 0 6 8
B 6 0 4
C 8 4 0
◮ Mostrare che si tratta di una matrice di distanza
◮ Mostrare che questa distanza non è ultrametrica
◮ Costruire l’albero filogenetico con radice usando UPGMA e
calcolare le distanze sull’albero
◮ Mostrare che queste distanze sono ultrametriche e che
non coincidono con quelle in input

Neighbors
◮ Dato un albero filogenetico senza radice, due foglie si
dicono neighbors se il cammino che le unisce passa per
un solo nodo interno
◮ Notare che non è necessariamente vero che il neighbor di
una specie è la specie più vicina nel senso della distanza
calcolata sull’albero

Tree-derived distances
◮ Data una matrice di distanze il metodo del neighbor joining
costruisce l’albero unrooted che riproduce le distanze date,
se questo esiste
◮ Una distanza per la quale esista tale albero si dice
“tree-derived” o “additive”
◮ Una distanza ultrametrica è tree-derived, ma l’opposto non
è necessariamente vero

δ(x, y)
◮ Supponiamo di avere una matrice di distanze d(x, y) tra
specie
◮ Definiamo la quantità
δ(x, y) = (N − 4)d(x, y) − ∑
(d(x, n) + d(y, n))
n≠x,y
◮ Se x e y sono tali che la δ(x, y) è minima, allora x e y
sono neighbors

Neighbor joining
◮ Calcolare la matrice delle δ
◮ Unire la coppia di specie con il delta più piccolo attraverso
un nodo interno r 1 con le distanze
d(x, r 1 ) =
d(x, n) − d(y, n) + d(x, y)
2
d(y, n) − d(x, n) + d(x, y)
d(y, r 1 ) =
2
dove n è un’altra foglia qualsiasi
◮ Sostituire x e y con r 1 . La distanza tra r 1 e le altre foglie è
data da
d(r 1 , n) =
d(x, n) + d(y, n) − d(x, y)
2
◮ Ripetere fino a che non si ricostruisce l’intero albero

Esempio
x
y
◮ Calcolare le distanze tra
le foglie dell’albero
rappresentato in figura
1
1
1
◮ Applicare l’algoritmo
"neighbor joining" alle
distanze calcolate e
mostrare che l’albero
ottenuto riproduce quello
di partenza
z
5
4
w

Rooting
◮ E’ possibile localizzare la radice di un albero ottenuto con
neighbor-joining aggiungendo un outgroup (specie che si
sa essere più distante dalle altre di quanto queste siano tra
loro)
◮ La radice dell’albero originario coincide con il punto da cui
si diarma l’outgroup.

Esempio
◮ Costruire l’albero unrooted di 3 specie dalle seguenti
distanze:
A B C
A 0 3 4
B 3 0 5
C 4 5 0
◮ Localizzare la radice usando l’outgroup D, con distanze
d(D, A) = 12 d(D, B) = 11 d(D, C) = 14

Maximum Parsimony
◮ Trovare l’albero che spiega la discendenza delle specie
esistenti da un antenato comune con il minimo numero di
mutazioni.
◮ Per semplicità ci limiteremo a considerare sostituzioni
◮ Esempio: le specie esistenti sono rappresentate dalle
seguenti sequenze:
AAG
AAA
GGA
AGA

Costo di un albero
1
0
AAA
0
AAA
1
1
Cost = 3
AGA
0
1
0
AAA
1
AAA
0
0
Cost = 4
AAA
2
AAG AAA GGA AGA
AAG AGA AAA GGA
◮ Elencare i possibili alberi
◮ Calcolare il costo per ogni albero
◮ Scegliere l’albero di costo minore

Alberi possibili
Gli alberi si distinguono per
◮ Topologia
◮ Assegnazione delle specie esistenti alle foglie
◮ Assegnazione di sequenze ai nodi intermedi

Topologie per 4 specie

Numero di alberi
◮ Il numero di assegnazioni (sommato su tutte le topologie) è
◮ Esempio: per N = 4
(2N − 3)!
2 N−2 (N − 2)!
(2N − 3)!
2 N−2 (N − 2)! = 5!
4 · 2! = 15
◮ Questo numero diventa rapidamente molto grande: per
N = 10:
17!
2 8 8! = 34.459.425
◮ Con metodi euristici si può usare parsimony anche per
centinaia di specie

Allineamenti multipli: SP scores
Il modo più comune di assegnare uno score a un allineamento
multiplo è un Sum of Pairs (SP) score:
◮ Lo score totale è la somma degli score delle singole
colonne:
S = ∑ S i
i
◮ Lo score di una colonna è la somma degli score di tutte le
coppie di simboli (usando una matrice di sostituzione
appropriata)
S i = ∑ s(mi k , mi l )
k

Esempio
match = 1, mismatch = -1, d = -2
A A C G
A A C T
A - C T
A G C T
+6 -7 +6 0 =5

SP scores: problema
A A C T G G
A A C T G G
A A C A G G
A A C T G G
A A C T G G
+10 +10 +10 +2 +10 +10 =52
◮ Per N sequenze una colonna di T vale N(N−1)
2
◮ Un singolo mismatch costa N − 1
◮ Costo relativo di un singolo mismatch: 2/N: decresce
all’aumentare di N
Over-counting of evolutionary events

Algoritmi per l’allineamento multiplo
◮ Esistono algoritmi di programmazione dinamica per
l’allineamento multiplo, ma sono utilizzabili solo per N
piccolo
◮ Tra gli algoritmi euristici i più comuni sono gli algoritmi di
allineamento progressivo:
◮ Allineare due sequenze
◮ Allineare una terza sequenza all’allineamento ottenuto
◮ Continuare ad aggiungere una sequenza alla volta
all’allineamento

Algoritmo di Feng-Doolitle
1. Trovare tutti gli N(N − 1)/2 pairwise alignments delle N
sequenze
2. Costruire un albero “filogenetico” usando come distanza
una funzione dello score dei pairwise alignments
3. Allineare le due sequenze “evolutivamente” più vicine
4. Allineare gli altri nodi dell’albero nell’ordine i cui sono stati
aggiunti all’albero
Per allineare due insiemi di sequenze, calcolare tutti i pairwise
alignments e usare il migliore

Esempio
Usando lo scoring:
match = 1; mismatch = -1; gap=-2
allineare AAG, ATG, AA :
A A G
A T G
A A -
+3 -1 -3 =-1

Applicazione: Positional Weight Matrices
◮ Siti di legame di TF:
◮ Brevi sequenze di DNA (∼ 6 − 15 bps)
◮ Non completamente conservate
◮ Una descrizione possibile è la sequenza consensus,
ricavabile da un allineamento multiplo di siti di legame noti:
IUPAC codes:
◮ Y = pyrimidine (C or T)
◮ W = T or A
A C C G G T
A C T G G T
- C T G G A
A C C G G T
A C Y G G W

Positional Weight Matrices
Una descrizione più accurata è data dalla PWM:
A C C G G T
A C T G G T
- C T G G A
A C C G G T
A C Y G G W
n A C G T
1 3 0 0 0
2 0 4 0 0
3 0 2 0 2
4 0 0 4 0
5 0 0 4 0
6 1 0 0 3

Ricerca di TFBS con PWM
Le PWM possono essere usate per identificare potenziali
binding sites di TFs:
◮ Considerare le sequenze regolatrici dei geni di interesse
(promotore, primi introni, ...)
◮ Fare “scorrere” la PWM sulla sequenza calcolando uno
score a ogni posizione
◮ Lo score esprime la somiglianza tra la sequenza e la
matrice

Log-likelihood ratio
Un sistema di scoring usato in pratica è il seguente: data una
PWM M e una sequnenza S:
dove
S = log 2
P(S|M)
P(S|B)
◮ P(S|M) è la probabilità di generare S a partire da M
◮ P(S|B) è la probabilità di generare S a partire dalle
(appropriate) frequenze nucleotidiche di background

Esempio
S = ACTGGA
n A C G T
1 3 0 0 0
2 0 4 0 0
3 0 2 0 2
4 0 0 4 0
5 0 0 4 0
6 1 0 0 3
P(S|M) = 1 · 1 · 1
2 · 1 · 1 · 1
4 = 1 8
( ) 6 1
P(S|B) = = 2 −12 = 4096
4
P(S|M)
P(S|B) = 2−3 + 2 12 = 2 9
score = 9
(N.B. per evitare problemi con log(0)
si aggiungono “pseudocounts” per le
basi che non compaiono mai in
ciascuna posizione)

Ricerca di TFBS
◮ Ogni volta che la sequenza supera un certo score minimo
deciso a priori, la si identifica come un candidato TFBS
◮ Problema: in genere si trovano troppi candidati:
◮ PWM di lunghezza 6
◮ Accettiamo solo il massimo score possibile (1 sola
sequenza)
◮ Su sequenze casuali, otteniamo un candidato ogni
4 6 = 4, 000 basi
◮ Sul genoma umano, ci aspettiamo
3 · 10 9
∼ 7.5 · 105
4 · 103 candidati semplicemente per caso

Soluzioni
1. Spesso i TFBS funzionali sono ripetuti nella regione
regolatrice ⇒ Selezionare soltanto le regioni regolatrici
in cui il numero di candidati è significativamente più
alto di quanto ci si aspetta per caso
2. Spesso i TFBS funzionali sono evolutivamente conservati
⇒ Selezionare soltanto i candidati TFBS che si
ritrovano in altre specie