relazione intermedia tecnico-scientifica delle attivita' svolte

RELAZIONE INTERMEDIA TECNICO-SCIENTIFICA
DELLE ATTIVITA’ SVOLTE
"
Messa a punto di un protocollo innovativo
per la prevenzione della moria degli alveari
(NEWPROBEE)
"
!"

!"#$%&'
$%&'()*+,(%-"......................................................................................................................................................"/"
!." 0&&,1,&2"!3"45'(1-",%"1,&'(6"........................................................................................................................."7"
!.!"8&*),(",%"1,&'("),"9--:0+;*"05,>":-&'*B&('".........................................................................."C"
!./""8&*),(",%"1,&'("),"5'()(&&,";"D;>-"),"&,:(*"05,>":-B,&;");N;";"5*%&("),">(%)-"5-'"

"
Introduzione
Per la messa a punto di un protocollo innovativo a basso impatto ambientale in grado di prevenire la
moria degli alveari causata dall’azione di Varroa destructor e patologie connesse (es. virosi,
nosemiasi) il progetto prevede che siano raggiunti i seguenti obiettivi:
1) Attività 1: “prove in vitro”
Individuazione delle modalità d’impiego del timolo, dell’estratto neem azal e dell’RNAi per la
lotta alla varroa ed alle virosi delle api (biosaggi su varroa ed api);
Sviluppo di metodiche analitiche per la determinazione del neem e del timolo nel miele.
2) Attività 2: “messa a punto delle apparecchiature”
Messa a punto della macchina innovativa per l’applicazione di polveri acaricide alimentata da
energia solare e suo collaudo in apiario;
Messa a punto di dispositivi per il conteggio delle api in entrata/uscita dagli alveari per la
valutazione di fenomeni di spopolamento degli alveari e loro collaudo in apiario;
Messa a punto di sonde per la misurazione della temperatura ed umidità relativa all’interno
degli alveari e loro collaudo in apiario.
3) Attività 3: “prove di campo”
Valutazione dell’efficacia antivirale del prodotto a base di RNAi;
Valutazione dei protocolli innovativi per la lotta alla varroa;
Monitoraggio e studio di apiari spopolati od a rischio di spopolamento.
"
/"

1. Attività 1: “prove in vitro”
Tale attività si propone il duplice obiettivo di:
a. individuare le modalità d’impiego in campo del timolo in cristalli, degli estratti di neem e
dell’RNAi per la lotta alla varroa ed alle virosi delle api (biosaggi su varroa ed api);
b. sviluppare specifiche metodiche analitiche per la determinazione del neem, (dell’RNAi) e
del timolo nel miele.
Al fine di ottenere indicazioni per le più appropriate modalità di applicazione in apiario sono stati
realizzati biosaggi in laboratorio per determinare la DL 50 su varroa ed api per le sostanze naturali
antivarroa in esame: estratti di neem (Azadirachta indica), timolo in cristalli ed RNAi.
Per la realizzazione delle prove in vitro si è provveduto ad acquistare i suddetti principi attivi da
testare, il materiale di consumo necessario per l’isolamento di varroe ed api (es. piastre Petri,
vaschette sterili, anse, etc.), come pure si è provveduto a prelevare dal campo le varroe e le api da
impiegare nei biosaggi.
Al fine di verificare le condizioni di temperatura ed umidità relativa ideali per la sopravvivenza di
adulti di Varroa destructor ed api in vitro, grazie ad uno studio bibliografico ad hoc (Lindberg et
al., 2000; Damiani et al, 2009) è stato possibile verificare: per le varroe valori di temperatura di 26-
29°C ed umidità relativa >60%, mentre per le api adulte valori di temperatura di 25-33°C ed
umidità relativa superiore del 50-70% (tabella 1).
" STLGTE0SUE0" UL$V$S0M"ETW0S$A0"
A0EEX0" #@Y/Q"Z[" \@Q]"F->."CQ]H"
[XA0S0" /7"Z[" "
0G$"0VUWST" #IZ[Y//Z[" \IQ]"F->."CQ]H"
!"#$%%"&'&(&G;';:-&',":,B'(B

In diversi lavori pubblicati in letteratura (es. Damiani et al, 2011) si utilizzano piastre Petri od altri
contenitori con, ciascuno, da 5 a 20 esemplari adulti per gruppo (Imdorf et al, 1999). Per ciascun
gruppo sperimentale, poi, vengono realizzate delle repliche (es. in caso di 5 esemplari possono
essere realizzate 5 repliche) per ottenere dei dati statisticamente significativi. La mortalità acuta per
api e varroa viene normalmente misurata a 24 ore, 48 ore e 72 ore.
"
I"

!"!#$%&'()#(*#+(%,)#'(#-../01234#%.5%2%)#5&#06(5#/.33(7.,2#
"
In fase di realizzazione.
In letteratura sono riportati dati di tossicità orale e dermale delle api verso i costituenti principali del
neem, responsabili della sua attività biologica, essendo le api uno degli indicatori biologici verso cui
si testano tutte le stanze attive ed i prodotti formulati impiegati in agricoltura per difendere le
colture dagli attacchi dei parassiti animali e fungini. Infatti, nel Draft Assesment Report
“Azadirachtin” del 19 Novembre 2007 (915 pagine) sono riportati i seguenti dati:
La somministrazione di neem azal (con un contenuto in principio attivo in azadirachtin A pari a
11,8%) ha causato la morte delle api alle seguenti concentrazioni:
Dose letale 50 orale (a 48 ore dall’applicazione applicazione) > 8.1 µg azadirachtin-A/ape;
Dose letale 50 per contatto (a 48 ore dall’applicazione) > 11.8 µg azadirachtin-A/ape.
"
@"

!"#8##$%&'()#(*#+(%,)#'(#%(/)3)#%.5%2%)#5&#92,,)2#'.5%,&:%),
!
Materiali e metodi
Le varroe oggetto del test sono state prelevate da telai provenienti da alveari infestati e sono state
trasferite in piastre Petri dal diametro di 9 cm con l’ausilio di pennelli e anse da laboratorio. In ogni
piastra Petri sono sono state inserite 10 varroe.
Le varroe sono state posizionate sulla base della piastra Petri ed il contenitore è stato chiuso con una
rete in cotone sterile a maglie strette per impedire l’allontanamento delle varroe. Il trattamento a
base di cristalli di timolo è stato posizionato in una seconda base di piastra Petri: i due contenitori
sono stati quindi sovrapposti e sigillati con nastro adesivo in questo modo le varroe si trovano nella
piastra Petri superiore, separati dalla piastra inferiore dalla rete in cotone, e quindi non direttamente
a contatto con il principio attivo ma comunque esposte ai vapori di timo. Il prodotto a base di timolo
essendo formulato in cristalli molto simili al comune zucchero da tavola (saccarosio) e, per ottenere
le concentrazioni di prodotto desiderate, sono state realizzate diluizioni opportune di timolo in
saccarosio.
Nella piastra Petri inferiore del gruppo trattato si è quindi provveduto ad inserire il timolo
mescolato con saccarosio per un peso complessivo di 2 g.
Nel gruppo di controllo sono stati invece posizionati semplicemente 2 g di saccarosio.
Le piastre Petri sono state incubate alla temperatura di 27°C.
La mortalità delle varroe è stata verificata 18 ore dopo il trattamento attraverso l’osservazione delle
varroe con ausilio di uno stereomicroscopio a 20-40 ingrandimenti. Le varroe che non si
muovevano spontaneamente sono state sollecitate con uno specillo. Le varroe che non mostravano
alcuna reazione anche dopo sollecitazione meccanica sono state considerate morte.
"
C"

Le dosi applicate nei diversi biosaggi sono riportate nelle tabelle dei risultati di ogni prova
sperimentale.
Biosaggio del 25 luglio 2011
Risultati
I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante:
Gruppo di trattamento
Dose
Varroe morte a
18 ore
Mortalità (%)
a 18 ore
Mortalità
(%)
corretta 1 * a 18 ore
CONTROLLO
40 0 8 20 0
TIMOLO
20 0,05 mg 3 15 0
20 0,1 mg 7 35 19
20 0,2 mg 1 5 0
20 0,5 mg 11 55 44
20 1 mg 18 90 88
Considerazioni
Il timolo applicato alla dose di 1 mg ha causato la mortalità del 88% delle varroe
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
! "*Correzione della Mortalità rilevata con la formula di Abbott.
% Mortalità corretta=[(% Mort. Osservata - % Mort. Controllo)/(100-M. controllo)] *100
"
"
K"

Biosaggio del 9 agosto 2011
Risultati
I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante:
Trattati Dose Varroe morte a 18 ore
Varroe % morte a 18
ore
CONTROLLO
60 0 20 33
TIMOLO
20 0,05 mg 6 30
20 0,1 mg 7 35
20 0,2 mg 5 25
20 0,5 mg 8 40
20 1 mg 7 35
Considerazioni
L’elevata mortalità nel controllo non permette di stabilire l’efficacia del prodotto nei confronti delle
varroe.
Biosaggio del 6 settembre 2011
Risultati
I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante:
"
P"

Gruppo di trattamento
Dose
Varroe morte
a 18 ore
Mortalità (%)
a 18 ore
CONTROLLO
100 0 79 79
TIMOLO
20 0,1 mg 15 75
20 0,2 mg 18 90
20 0,5 mg 20 100
20 1 mg 20 100
20 2 mg 20 100
20 5 mg 20 100
Considerazioni
L’elevata mortalità nel controllo non permette di stabilire l’efficacia del prodotto verso le varroe.
Conclusioni sulle attività di biosaggio in laboratorio.
1. Biosaggi effettuati con derivati di Azadirachta indica
Trattamenti acaricidi realizzati in vitro con derivati del NeemAzal® nei confronti di Varroa
jacobsoni sono riportati in letteratura dimostrando una valida attività acaricida (Melathopoulos et al,
2000a; Whittington et al. 2000b; Melathopoulos et al, 2000b).
Nella presente sperimentazione si è voluto testare l’efficacia acaricida della polvere tecnica di
NeemAzal® (neem azal) oltre a sperimentare un nuovo metodo di applicazione dei principi attivi.
"
!Q"

Infatti il prodotto è stato miscelato con cera d’ape al fine di annullare o, per lo meno, ridurre gli
effetti negativi riportati in letteratura verso gli adulti, la covata di api e riportati sulla vitalità delle
regine. Si è quindi ipotizzato che il neem mescolato alla cera possa svolgere un’azione di disturbo
od acaricida sulle femmine d’acaro presenti nelle cellette dell’alveare.
I risultati ottenuti nella presente sperimentazione hanno confermato l’effetto acaricida del
NeemAzal® ma non hanno permesso di calcolare una esatta dose letale 50 (DL 50 ) per la variabilità
dei dati di laboratorio ottenuti. Tale variabilità è spiegabile sia con l’elevata eterogeneità delle
varroe utilizzate (in quanto prelevate da infestazioni naturali), sia con la complessità delle
condizioni di laboratorio da ricreare per mantenere vitali gli acari per tutta la durata della
sperimentazione.
La prova sperimentale proseguirà con l’applicazione in campo della cera d’ape trattata con
NeemAzal® per verificare l’efficacia del trattamento in condizioni reali, per un periodo prolungato
di osservazione della infestazione da varroa. La prova prevederà, inoltre, l’osservazione dei
possibili effetti sulla covata, sulle regine e sulle variazioni numeriche delle api adulte.
2. Biosaggi effettuati con timolo
In diverse pubblicazioni scientifiche i trattamenti a base di timolo sono risultati idonei nel ridurre le
infestazioni da varroa, riportando livelli di efficacia acaricida compresi tra 54 e 98% (Gal et al,
1992; Higes, 1996). Simili livelli di efficacia si sono ripetuti anche usando metodi di applicazione
diversi (Imdorf et al. 1999). Le varroe in riproduzione nelle celle della covata opercolata non
subiscono danni dal trattamento con timolo: quindi, verificando l’efficacia acaricida complessiva
nell’arco di un anno di applicazione, questa risulta inferiore, compresa tra 54 e 85% (Gal et al,
1992). Con test di laboratorio è stata inoltre calcolata la concentrazione letale 50 (CL50) olio
"
!!"

essenziale di timo contro Varroa destructor (CL50= 4,65 !l, dopo 24 ore di esposizione) e contro la
stessa ape adulta (CL50= 21,89 !l, dopo 24 ore di esposizione), (Damiani ed al. 2009).
Un trattamento di campo condotto in Italia con una preparazione commerciale di timolo
(Apiguard®) ha causato una mortalità del 98% di Varroa jacobsoni (Colombo e Spreafico, 1999).
In un altro lavoro condotto in Turchia sono stati utlizzati due prodotti, Thymovar® e BeeVital®, a
base di timolo applicandoli in due trattamenti in autunno, in apiario, contro Varroa destructor.
L’efficacia acaricida media riscontrata in tali lavori del Thymovar® e del BeeVital® era stata
rispettivamente del 96,91% e dell’88,66%. Nella prova sperimenentale e non era stata, tra l’altro,
rilevata mortalità di regine, adulti o covata (Akyol e Yeninar, 2008).
I risultati ottenuti durante i biosaggi svolti nel corso dell’attuale progetto con timolo in cristalli
hanno confermato l’efficacia acaricida del timolo anche se non è stato possibile determinare la dose
letale 50 (DL 50 ). Infatti, in alcuni biosaggi è stata registrata una elevata mortalità nel gruppo di
controllo dovuta presumibilmente alla variabilità delle varroe impiegate nelle prove ed alle
condizioni di laboratorio predisposte per mantenere vitali gli acari per la durata complessiva della
sperimentazione.
La prova sperimentale proseguirà con l’applicazione in campo del timolo per verificare in
condizioni reali l’efficacia del trattamento per un periodo prolungato e per valutare gli effetti sulla
covata, sulle api regine e sulle variazioni di numerosità di api adulte nelle famiglie testate.
!";##$%&'()#(*#+(%,)#'(#6,)')%%(#2#

stato posizionato in una seconda base di piastra Petri: i due contenitori sono stati quindi sovrapposti
e sigillati con nastro adesivo in questo modo le api si trovano nella piastra Petri superiore, separati
dalla piastra inferiore dalla rete in cotone, e quindi non direttamente a contatto con il principio
attivo ma comunque esposte ai vapori di timo.
Il prodotto a base di timolo essendo formulato in cristalli molto simili al comune zucchero da tavola
(saccarosio) e, per ottenere le concentrazioni di prodotto desiderate, sono state realizzate diluizioni
opportune di timolo in saccarosio.
Nella piastra Petri inferiore del gruppo trattato si è quindi provveduto ad inserire il timolo
mescolato con saccarosio per un peso complessivo di 2 g.
Nel gruppo di controllo sono stati invece posizionati semplicemente 2 g di saccarosio.
Le piastre Petri sono state incubate alla temperatura di 27°C.
La mortalità delle api è stata verificata a 24 ore e 48 ore dopo il trattamento, con osservazione dei
movimenti delle api. Le api che non si muovevano sono state sollecitate con uno specillo. Le api
che non mostravano alcuna reazione anche dopo sollecitazione meccanica sono state considerate
morte.
Le dosi applicate nei diversi biosaggi sono riportate nelle tabelle dei risultati di ogni prova
sperimentale.
"
"
Biosaggio del 3 agosto 2011
Risultati
I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante:
"
!/"

Api morte Api morte (%)
Gruppo di trattamento
Dose
a 24 ore
a 48
ore
a 24 ore
a 48 ore
CONTROLLO
30 0 0 0 0 0
TIMOLO
10 0,1 mg 0 0 0 0
10 0,2 mg 1 1 10 10
10 0,5 mg 0 0 0 0
10 1 mg 0 0 0 0
10 2 mg 0 0 0 0
Considerazioni
Nel presente biosaggio è stato riscontrata la completa sopravvivenza delle api al trattamento con
dosaggi di timolo inferiori od uguali a 2 mg.
"
!7"

!"=##$%&'()#(*#+(%,)#'(#>-0(#6.,#(3#:)*%,)33)#'.3#+(,&5#(5,2.3(2*)#'.332#62,23(5(#
2:&%2#@0A9B#
"
"
La somministrazione per via orale di 1 µg/ape di Remebee congiuntamente a 10 µg/ µl di IAPV
annulla l’effetto patogeno del virus e mantiene la mortalità delle api nel gruppo trattato simile a
quella del gruppo di controllo non trattato (Maori ed al, 2009).
In uno studio di tossicità acuta verso le api sul prodotto Remebee, condotto secondo le Buone
Pratiche di Laboratorio, è stata verificata l’innocuità della somministrazione sulle le api della dose
di 20 !g/ape. Tale dosaggio corrisponde, in realtà ad una dose 20 volte maggiore di quella
terapeutica consigliata (20X) (Comunicazione personale). Lo studio è stato condotto su 210
individui per gruppo. Le mortalità ottenute dopo 4 e 7 giorni di applicazione sono state: per la dose
massima applicata (20X) rispettivamente del 6,2 e 7,6%; tale risultato non è significativamente
differente dalla mortalità ottenuta nel gruppo di controllo non trattato (9,0% sia a 4 che a 7 giorni
dopo la l’applicazione). Lo studio riportato costituisce parte del dossier di registrazione del
prodotto.
"
!I"

!"C##$+(3&66)#'(#/.%)'(:D.#2*23(%(:D.#6.,#32#'.%.,/(*21()*.#'.3#-../01234#.#
'.3#%(/)3)#*.3#/(.3.#
!
Materiali e metodi
Per la valutazione dei diversi sistemi di estrazione e purificazione di neem e timolo da campioni di
miele sono state impiegate tecniche quali: estrazione liquido-liquido, purificazione con colonnine
SPE, sistemi di ultrafiltrazione. Successivamente sono ottimizzati i parametri strumentali per
determinare le concentrazioni di neem e timolo a livello di residuo dal miele.
"
Risultati per la messa a punto di un metodo per il NeemAzal®
L’attività di ricerca in questa prima fase ha riguardato una valutazione dello stato dell’arte nella
ricerca e determinazione dei residui di azadiractina, principio attivo del NeemAzal® nei prodotti
alimentari. Dalla ricerca bibliografica è stata evidenziata una carenza di metodi chimici per la
determinazione di tale sostanza ed in particolare gli unici metodi disponibili sono dei metodi HPLC
con rivelatori convenzionali come UV e DAD, che risultano poco sensibili ed inadatti per la ricerca
di azadiractina a livelli di residui. Per tale motivo si è iniziato lo sviluppo e la messa a punto di un
metodo LC-MS per la determinazione di residui di azadiractina nel miele.
In questa fase preliminare, dopo l’acquisizione di standard analitici sono stati iniziati gli studi
strutturali sulla molecola di interresse. In particolare attraverso il metodo in infusione, che consiste
nell’introduzione diretta di soluzioni standard di azadiractina nello spettrometro di massa, sono state
individuate le condizioni ottimali di ionizzazione. Lo studio ha previsto le modalità di ionizzazione
(positiva o negativa), la scelta di interfacce API ed ESI che meglio si adattano nell’analisi
dell’azadiractina. Successivamente sono stati valutati e modificati i parametri critici (come i
potenziali delle lenti, del capillare, la temperatura del capillare, il flusso dei gas) che influenzano la
formazione degli ioni molecolari e le relative frammentazioni, attraverso lo studio delle intensità
delle diverse specie ioniche (ioni molecolari, clusters, addotti), che si ottengono in funzione dei
"
!@"

parametri sperimentali. Sono state, perciò, effettuate analisi in infusione sia in assenza che in
presenza dei più comuni agenti ionizzanti, quali: Acido formico 0,1%, Acido acetico 1%, Acetato di
ammonio 2 mM, Formiato di ammonio 2 mM ed Ammoniaca 0,01%.
I risultati ottenuti hanno mostrato che la ionizzazione in modalità negativa è risultata la più efficace
nell’analisi di questo composto in termini di sensibilità e rapporto segnale rumore.
Una volta individuate le modalità di acquisizione, il passo successivo è stato quello della scelta
delle colonna cromatografica e l’ottimizzazione delle condizioni di separazione. Tra le diverse fasi
provate quella che la colonna che più si adatta alle nostre esigenze analitiche è risultata essere una
colonna C18 di diametro interno 2.1 mm e lunghezza 150 mm. Sono inoltre iniziati gli studi per la
predisposizione della base di sviluppo e validazione del metodo analitico per la purificazione del
principio attivo nel miele.
Risultati per la messa a punto di un metodo per il timolo
In fase di realizzazione
"
!C"

2. Attività 2: “messa a punto delle apparecchiature”
8"!#E.552#2#6&*%)#'.332#/2::D(*2#(**)+2%(+2#6.,#3F2663(:21()*.#'(#6)3+.,(#
2:2,(:('.#23(/.*%2%2#'2#.*.,G(2#5)32,.#.#5&)#:)332&')#(*#26(2,()#
!
Materiali e metodi
Nell’ambito del progetto NEWPROBEE è stato realizzato lo studio di fattibilità e la progettazione
di un apparecchio elettrico innovativo, alimentato con energia fotovoltaica, per la veicolazione di
acaricidi in polvere a basso impatto ambientale all’interno degli alveari.
Alla data di inizio delle attività di realizzazione della macchina erogatrice non era ancora
disponibile la polvere acaricida in questione: non conoscendone né la granulosità nè la consistenza
si è dovuto procedere in base ad ipotesi. Si è ipotizzato quindi che il NEEM avesse una consistenza
del tutto simile alla comune farina alimentare. L’ipotesi non comporta comunque alcuna
conseguenza negativa in quanto, se il NEEM dovesse presentare una granulosità di tipo differente lo
si ridurrà con un processo di molatura in farina.
Febbraio-2011
Nel mese di Febbraio 2011 si è ufficialmente dato il via allo sviluppo del macchinario soffiatore:
a. Scelta progettuale tra erogatore alimentato a scoppio ed erogatore alimentato ad energia
fotovoltaica.
Si è ragionato sull’opportunità di realizzare l’apparecchiatura alimentandola con un motore a
scoppio. Questa soluzione è stata presto abbandonata in quanto presentava alcuni
inconvenienti notevoli, quali:
" Rumorosità elevata;
"
!K"

" Generazione di forti odori con trasferimento degli stessi ai prodotti dell’alveare;
" Generazione di un flusso d’aria eccessivamente violento e conseguentemente
molesto per le api;
" Possibile sviluppo di incendio negli apiari.
Si è quindi optato per la soluzione di un erogatore alimentato con fonti rinnovabili che non
presentasse le problematiche del motore a scoppio e che fosse più in linea con la filosofia
del progetto NEWPROBEE.
b. Ricerca di mercato atta all’individuazione di prodotti già realizzati e presenti sul mercato.
c. Ideazione di un prototipo di soffiatore realizzato con ventole di raffreddamento del tipo
utilizzato in informatica (fig.6).
Fig. 6 Ventole di raffreddamento
"
d. Ricerca del tipo di ventola disponibile sul mercato atta alle esigenze del progetto.
Marzo 2011
a. Realizzazione di un prototipo con ventole.
b. Realizzazione di prove tecniche atte alla verifica della bontà della soluzione individuata.
"
!P"

La soluzione individuata non ha dato però fornito i risultati attesi in quanto le ventole hanno
dimostrato di :
" non riuscire a generare un flusso d’aria sufficiente a spargere la polvere;
" non risulta agevole direzionare il flusso d’aria sulla polvere e quindi all’interno
dell’arnia.
c. Ideazione di un prototipo di soffiatore mediante mini compressori d’aria;
d. Ricerca di mercato per individuare la tipologia di apparecchiatura idonea allo scopo.
Nel mercato esistono vari tipi di compressori con diverse caratteristiche:
" Compressori a membrana;
" Compressori a vite;
" Compressore a pistone;
" Compressori a corrente continua;
" Compressori a corrente alternata.
Aprile 2011
E’ stato individuato come adatto agli scopi del progetto un compressore ricavato da un comune
apparecchio domestico per aerosol.
L’apparecchio scelto presenta le seguenti caratteristiche:
Tensione di alimentazione
Frequenza di alimentazione
Assorbimento corrente
Pressione Max
220 V
50 Hz
0,5 A
2 Bar
a. Effettuazione di alcune prove per verificare la soluzione individuata.
Il compressore scelto si è dimostrato estremamente efficace per gli scopi del progetto. Infatti
"
è stato in grado di sollevare agevolmente la polvere utilizzata per le prove.
#Q"

Inoltre soffiando attraverso un tubo di gomma è risultato estremamente semplice indirizzare
l’aria a proprio piacimento.
b. Effettuazione di alcune prove di soffiaggio attraverso un tubo di gomma riempito di polvere.
c. Realizzazione di un vaso di espansione lungo la condotta dell’aria.
Poiché il compressore utilizzato è del tipo a membrana, il flusso d’aria creato non è
continuo, ma ad intermittenza. Per ridurre l’effetto ad intermittenza è stato necessario
inserire uno spezzone di tubo di portata maggiore in modo tale che la fuoriuscita dell’aria
avvenga con maggiore uniformità. Questo accorgimento è stato necessario per interferire il
meno possibile con le api.
d. Effettuazione di prove atte a verificare che il flusso d’aria fosse sufficiente allo scopo con
l’inserimento del vaso di espansione.
Maggio 2011
a. Studio del modalità di inserimento del flusso d’aria all’interno dell’arnia:
1. Inserimento del tubo del compressore sollevando il coprifavo dell’arnia. Soluzione
abbandonata perché poco agevole.
2. Inserimento del tubo del compressore tra il coprifavo rovesciato ed il nido. Soluzione
abbandonata perché poco pratica, inoltre non si ottiene una distribuzione uniforme del
prodotto acaricida all’interno dell’arnia.
3. Individuazione della soluzione ottima per l’erogazione del prodotto acaricida.
E’ stata scelta quale soluzione più adatta per l’erogazione della polvere sia quella di
sistemare sulla parte superiore del coprifavo (fig.7) un tubo di gomma inserito attraverso un
foro realizzato sulle pareti del coprifavo, opportunamente sagomato (fig.8).
"
#!"

Fig. 7 Coprifavo
Fig. 8 Coprifavo provvisto di tubi sagomati per la somministrazione del prodotto acaricida
La sagoma imposta al tubo è tale da far coincidere il tubo con gli spazi tra i favi.
Una volta sistemato e fissato il tubo si è proceduto a forarlo mediante un ago, distanziando
gli stessi di circa 3 cm l’uno dall’altro.
Attraverso i fori praticati la polvere di acaricida sarà immessa uniformemente all’interno
dell’arnia.
Il tubo individuato per questa applicazione è del tipo utilizzato per l’irrigazione a goccia.
Giugno 2011
a. Realizzazione di alcune prove tecniche di erogazione della polvere collegando il
compressore al tubo sistemato sul coprifavo. Verifica della corretta fuoriuscita dell’aria.
"
##"

. Realizzazione di prove tecniche di erogazione della polvere. Si è proceduto a riempire
l’espansione (vedi Aprile punto e) di farina ed a verificarne la uniforme fuoriuscita
attraverso tutti i fori praticati.
c. Prova di erogazione di farina all’interno dell’arnia.
d. Ricerca sul mercato di una ampolla che possa contenere la farina e che offra una maggiore
semplicità di utilizzo rispetto all’espansione realizzata con il tubo di sezione maggiore.
e. Dimensionamento del generatore elettrico fotovoltaico e degli apparati ad esso connessi
(fig.9).
Fig. 9 Dimensionamento del generatore elettrico fotovoltaico e degli apparati ad esso connessi
"
e. Ricerca di mercato degli apparati presenti con le caratteristiche opportune:
a. Modulo fotovoltaico (FV)
b. Regolatore di Carica
c. Batteria.
f. Modulo fotovoltaico di tipo monocristallino con potenza di 175 Wp (vedi DATA SHEET
modulo fotovoltaico);
"
#/"

g. Regolatore di carica Steca PR2020 con grado di protezione IP65 (vedi DATA SHEET
regolatore di carica);
h. Batteria di tipo Automobilistico a 12V/74Ah/680°.
"
#7"

DATA SHEET Modulo fotovoltaico di tipo monocristallino con potenza di 175 Wp
"
#I"

DATA SHEET Regolatore di carica Steca PR2020 con grado di protezione IP65
"
#@"

"
#C"

8"8#E.552#2#6&*%)#'(#'(56)5(%(+(#6.,#(3#:)*%.GG()#'.33.#26(#(*#.*%,2%2H&5:(%2#
'2G3(#23+.2,(#6.,#32#+23&%21()*.#'(#7.*)/.*(#'(#56)6)32/.*%)#'.G3(#23+.2,(#.#
3),)#:)332&')#(*#26(2,()##
"
Materiali e metodi
Nell’ambito del progetto “Messa a punto di un protocollo innovativo per la prevenzione della moria
degli alveari” l’unità operativa Università La Sapienza di Roma ed in particolare il Dipartimento di
Ingegneria dell’Informazione, Elettronica e Telecomunicazioni (DIET) nella persona di Ing. Marco
Balsi, ricercatore nel medesimo dipartimento, ha in carico lo studio di un dispositivo automatizzato
atto a monitorare fenomeni di spopolamento delle api.
Per conteggiare le api in ingresso ed in uscita sono stati preliminarmente sperimentati sensori
montati in corrispondenza di un foro di uscita dall’arnia e collegati a sistemi di acquisizione da
laboratorio (multimetro, interfacce per PC, ecc.): una fotocellula basata su un semplice circuito con
un fototransistor e un LED, un sensore capacitivo realizzato in laboratorio in cui il corpo dell’ape
passando all’interno produce una perturbazione del debole campo elettrico applicato, un pirometro
che evidenzi il passaggio dell’ape attraverso l’emissione di calore corporeo, e un sistema software
di elaborazione di immagini acquisite da telecamera che conti oggetti in movimento che entrano o
escono da una regione di interesse delimitata nell’ambito dell’immagine inquadrata. L’efficacia di
ciascun sensore sarà valutata confrontando il conteggio diretto visivo delle api con l’acquisizione
automatica dei dati (validazione del metodo). Uno o più sistemi di conteggio saranno prescelti per la
realizzazione di un numero sufficiente di dispositivi per la sperimentazione in campo.
In particolare le attività da svolgere possono essere così descritte:
1) Monitoraggio Arnia:
"
#K"

Studio di fattibilità di un sistema di misura della temperatura e umidità all’interno dell’arnia. In
particolare si progetterà il sistema di condizionamento del segnale, acquisizione e memorizzazione
dei dati.
2) Contatore Api:
Progettazione di sistema di conteggio delle api entranti e uscenti dall’arnia.
Preliminarmente, si eseguirà un’analisi dello stato dell’arte nella letteratura scientifica e tecnica e
sul mercato. Conseguentemente si farà una valutazione di fattibilità di sistemi prevalentemente di
tipo ottico oppure capacitivo.
Monitoraggio Arnia
In questa prima fase si è definito il sistema di acquisizione il quale vista la particolarità della
applicazione dove garantire l’attività di monitoraggio delle variabili ambientali all’interno
dell’arnia, quali temperatura e umidità, senza soluzione di continuità ed allo stesso tempo offrire la
possibilità di fruire in modo semplice dei dati registrati. Questo imponeva che la catena di
elaborazione potesse memorizzare continuamente i dati forniti dai sensori e renderli fruibile a
seconda delle disponibilità dell’operatore.
Fig. 10 Schema di principio di un sistema di acquisizione dati
A valle di tale considerazioni l’idea implementata consisteva nel progettare una catena di
elaborazione del dato di temperatura ed umidità, come quella concettualmente descritta in fig. 10. In
essa si riconosce il sensore, il quale generalmente fornisce in output un segnale elettrico analogico
proporzionale al grandezza da misurare. L’esigenza di mettere in comunicazione il sensore con
"
#P"

l’unità di elaborazione/controllo ed il successivo blocco di memorizzazione impone l’utilizzo del
convertitore analogico digitale (ADC).
Individuata l’organizzazione logica della catena di elaborazione si è passati alla scelta dei
componenti al fine di implementare il sistema.
In particolare la scelta dei sensori è ricaduta su due soluzioni, di prestazioni adeguate e costo
contenuto, quali il sensore SHT15 (fig. 11), ed il DHT22, (fig. 12).
Fig. 11 Sensore di umidità e temperatura. SHT15
Principali Caratteristiche Tecniche:
• sensori calibrati dalla fabbrica per temperatura ed umidita'relativa
• Interfaccia Digital 2-wire
• Punto di rugiada calcolabile con precisione
• Range di misura: 0-100% RH
• Accuratezza RH assoluta: +/- 2% RH (10...90% RH)
• Ripetibilita' RH: +/- 0.1% RH
• Accuratezza temperatura : +/- 0.3°C @ 25°C
• Tempo di risposta < 4 sec.
• Basso consumo ( 30 µW tipico)
• Costo Contenuto (" 45,77)
"
/Q"

Fig. 12 Sensore di umidità e temperatura. DHT22
Principali Caratteristiche Tecniche:
• .3-6V Input
• 1-1.5mA measuring current
• 40-50 uA standby current
• Humidity from 0-100% RH
• -40 - 80 degrees C temperature range
• +-2% RH accuracy
• +-0.5 degrees C
• Basso Costo (" 10,59)
Entrambi i sensori permettono di poter monitorare contemporaneamente sia la temperatura che
l’umidità dell’aria inoltre offrono in uscita il dato digitale che permette la connessione diretta del
sensore alla soluzione di elaborazione/gestione senza quindi la necessità di interfacciarli con un
convertitore analogico-digitale.
Il controllo e la gestione di tali dispositivi veniva affidato alla piattaforma hardware basata su
microcontrollori ATMEL Arduino 2009 (www. arduino.cc), (fig. 13).
"
/!"

Fig. 13 Piattaforma hardware Arduino2009.
Principali Caratteristiche Tecniche:
• microprocessore: ATMEGA 328 (ATMEL)
• I/O 13 ingressi digitali
• 5 ingressi analogici
• 1 ADC 10 bit
• Alimentazione 5V – 12V. Alimentabile da USB
• Costo (" 30,00)
Una volta individuata la piattaforma di controllo la scelta della soluzione di memorizzazione
ricadeva sulla shield micro-SD, interfacciabile con l’Arduino 2009. Tale soluzione permette di
memorizzare fino a 2GB di dati.
Fig. 14 Shield microSD. Interfacciata all’Arduino permette la memorizzazione del dato rilevato (Costo circa " 20,00).
"
/#"

Fig. 15 Il sistema assemblato.
Si osservi che il sensore di DHT22 è montato su basetta solo per facilitarne l’utilizzo in questa fase di studio.
In figura 15 è visibile l’intero sistema assemblato. Ovviamente esso si presenta nella forma di
prototipo e non nella forma finale. La scelta di utilizzare due sensori sarà ovviamente limitata alla
sola fase di studio in quanto sarà necessario verificare l’affidabilità e la ripetibilità della misura
all’interno dell’arnia.
I primi test effettuati fuori dall’arnia mostrano un buon accordo tra le misure dei due sensori sia per
i valori di temperatura che quelli di umidità. Il passo successivo prevederà di studiare una soluzione
che possa inglobarli all’interno dell’arnia senza che la loro presenza non alteri il comportamento
delle api. Si ipotizza l’uso di gabbiette da regina o di analoga gabbietta costruita appositamente, da
inglobare in un favo.
Contatore Api
Allo scopo di poter monitorare l’attività delle api ed in particolare il flusso netto definite come
differenza tra le api entranti ed uscenti dall’arnia stiamo valutando l’ipotesi di poter utilizzare
sensori ottici commerciali generalmente utilizzati all’interno del mouse.
Infatti tali dispositivi restituiscono un informazione di movimento nelle direzione x ed y dello
spazio. Tale informazione può essere ottenuta in linea di principio sia quando è il sensore a
muoversi su di una superficie che nel caso opposto, cioè qualcosa è transitato al di sotto del sensore.
"
//"

Oltre alle coordinate spaziali tali sensori restituiscono un informazione di “surface quality” in
particolare ogni variazione nella trama/colore della superficie osservata è rilevata. Tali
caratteristiche permettono di pensare che tali soluzioni possono essere utilizzate allo scopo di
conteggio, secondo lo schema logico qui proposto:
ogni volta che un’ape transita sotto il sensore questo produrrà un’informazione di posizione
x o y a seconda di come sarà disposto il sensore rispetto al moto dell’ape;
la presenza di un’ape produrrà un cambio nella trama della superficie osservata dal sensore
che si tradurrà in un’informazione di “surface quality”.
È importante osservare che in letteratura è ampiamente documentato che la luce rossa emessa da tali
dispositivi non nuoce alle api le quali risultano insensibili.
Fig. 16. Kit per mouse ADNS 2051. Si riconoscono il sensore le due lenti ed il diodo led
Allo scopo di poter effettuare lo studio di fattibilità di tale soluzione è stato predisposto l’acquisto
del kit di sensori ADNS 2051 (fig. 16).
Anche in questo caso il sensore fornisce l’informazione in formato digitale e quindi si presta ad
essere interfacciato con microcontrollori senza convertitori ADC. Per continuità progettuale la
piattaforma di elaborazione è stata identificata in Arduino 2009.
"
/7"

In questa prima fase ci si e dedicati con esito positivo all’interfacciamento del sensore con Arduino
con lo scopo di trasferire il dato rilevato al PC. Sono inoltre in essere delle attività di
sperimentazione per validare il rilevamento di un oggetto che transiti al disotto del sensore. Al fine
di poter effettuare prove in sito si è definito il layout del PCB (fig. 17).
Fig. 17 Circuito stampato
La prototipazione, validazione e realizzazione dei ciruiti necessari alla sperimentazione sarà affidata
alla ditta spin-off universitaria Oben s.r.l. di Sassari.
Si verificherà periodicamente l’efficienza dei sistemi di conteggio, anche tenendo conto del
probabile deterioramento dei dispositivi anche ad opera delle api (in particolare dovuti alla
propolizzazione), riparando eventuali dispositivi danneggiati e modificandoli ove necessario.
"
"
"
/I"

8";#E.552#2#6&*%)#'(#5)*'.#6.,#32#/(5&,21()*.#'.332#%./6.,2%&,2#.'#&/('(%I#
,.32%(+2#233F(*%.,*)#'.G3(#23+.2,(#.#3),)#:)332&')#(*#26(2,()#
"
In fase di realizzazione
"
/@"

Attività 3: “prove di campo”
"
9el periodo gennaio 2010- dicembre 2011 sono state svolte dal dottor Giovanni Formato missioni in
territorio nazionale per realizzare visite in apiario per confrontarsi con le diverse metodologie di
lotta alla varroa.
Nello specifico, le visite in apiario sono state finalizzate a:
- monitorare fenomeni di moria/spopolamento di api;
- correlare gli eventi di moria e spopolamento rilevati ai diversi protocolli di lotta alla varroa (es.
anche con le strategie messe a punto da altri Enti di ricerca operanti sul territorio nazionale: IZS
Firenze, CRA-Api, etc.);
- verificare la praticità, l’efficacia acaricida e le modalità di somministrazione di diversi prodotti
antivarroa a basso impatto ambientale impiegati dagli apicoltori;
- verificare i dispositivi innovativi in fase di costruzione;
- campionamento di matrici apistiche utilizzate per valutare la quantità di residui dei principi attivi
(neem e timolo) oggetto dello studio nei prodotti dell’alveare, come pure per ottenere api adulte e
varroe vive da sottoporre a saggi di laboratorio per individuare la dose letale 50 (DL 50 ).
Il dottor Formato ha infine preso parte ad eventi di formazione sull’impiego di prodotti a basso
impatto ambientale e fitoterapici per la lotta alla varroa in quanto attinenti al progetto di ricerca, con
il fine di acquisire ulteriori conoscenze in merito all’impiego di sostanze naturali per la lotta alla
varroa ed alle malattie correlate.
Mediante l’osservazione diretta su alveari nel secondo anno di progetto sarà verificata l’efficacia
acaricida dei diversi principi attivi oggetto del presente progetto (neem, timolo ed RNAi) impiegati
con i dispositivi innovativi costruiti relazionando i risultati alle condizioni climatiche (in particolare
la temperatura esterna) e considerandone la tossicità in vivo per le api.
"
/C"

;"!#923&%21()*.#'.33F.77(:2:(2#2*%(+(,23.#'.3#6,)')%%)#2#

"
;"8#923&%21()*.#'.(#6,)%):)33(#(**)+2%(+(#6.,#32#3)%%2#2332#+2,,)2#
"
In fase di realizzazione.
Nella sperimentazione in campo, che sarà completata per la fine del progetto (dicembre 2012),
saranno costituiti dei gruppi di trattamento di almeno 8 alveari finalizzati a confrontare l’efficacia
acaricida di diversi protocolli di lotta alla varroa. Nei gruppi sarà anche incluso un numero di
alveari in cui non verrà somministrato alcun trattamento (controllo). Per le diverse tesi sperimentali,
saranno monitorati i seguenti indicatori di efficacia del protocollo: quantità di miele prodotto,
vitalità delle colonie (mediante conta delle api morte cadute nelle gabbie underbasket, numero di
favi occupati dalle api adulte, numero di telaini di covata), quantificazione dei patogeni oggetto
dello studio (virus e varroa) e di altri eventuali patogeni associati (es. Nosema spp.), efficacia
acaricida ed antivirale. Lì dove saranno effettuati trattamenti con neem, si procederà alla
determinazione della presenza di residui nel miele prodotto, attraverso analisi LC-MS,
indispensabili per garantire la qualità del miele prodotto
"
/P"

&
;";#E)*(%),2GG()#.#5%&'()#'(#26(2,(#56)6)32%(#)'#2#,(5:D()#'(#56)6)32/.*%)#
"
Grazie all’osservazione dal vivo di fenomeni di moria/spopolamento di alveari è stato possibile
costruire la tabella riassuntiva di seguito riportata in cui si correlano le perdite di alveari evidenziate
con i diversi protocolli di lotta alla varroa messi in atto dagli apicoltori.
Tabella- Risultati delle visite in apiario in caso di moria/spopolamento di alveari
Casi di moria/
spopolamento
Motivo del sopralluogo
Correlazione tra il fenomeno di moria/spopolamento con i
protocolli di lotta alla varroa adottati
Caso 1 moria e spopolamento Varroatosi e virosi associate (mancato trattamento acaricida
invernale). Alcune famiglie erano affette da patologie
denunciabili (Peste americana, peste europea, nosemosi)
Caso 2 moria e spopolamento Varroatosi e virosi associate (mancato trattamento acaricida
invernale). Alcune famiglie erano affette da (Peste americana
Caso 3 moria Varroatosi e virosi associate(mancato trattamento acaricida
invernale).
Avvelenamento da sostanze presenti in una discarica limitrofa
allo apiario.
Caso 4 spopolamento Forte sospetto di avvelenamento da agro farmaci (sintomi acuti
sulle api adulte di tremori e movimenti sconnessi)
Indebolimento delle famiglie per trattamento acaricida ripetuto
in periodo invernale (9 volte AO gocciolato nei mesi invernali)
Caso 5 moria Avvelenamento da trattamenti fitosanitari su mais. Alcune
famiglie erano morte per Peste Americana
Caso 5 moria e spopolamento Avvelenamento da agro farmaci su trattamento della vite
Caso 6 moria varroatosi e virosi associate (gran parte delle famiglie presenti in
"
7Q"

apiario presentavano Parasitic Mite Syndrome) (mancato
trattamento acaricida estivo).
Caso 7 moria Varroatosi e virosi associate (Errore gestionale: trattamento con
timolo nel periodo ottobre-novembre). Avvelenamento per
presenza di una industria di confetture e conserve nel raggio di
300 m dall’apiario.
Caso 8 moria e spopolamento Avvelenamento da diserbanti glifosati (Klorane)
Varroatosi (l’apicoltore non ha realizzato alcun trattamento
acaricida estivo)
Caso 9 moria e spopolamento Varroatosi e virosi asosciate (L’apicoltore non tratta da anni per
la varroa).
Avvelenamento doloso da parte di un vicino
Caso 10 moria Varroatosi e virosi associate (l’apicoltore non ha eseguito alcun
trattamento acaricida invernale ed ha trattato quale trattamento
estivo le famiglie con APIGUARD in periodo non idoneo:
settembre-ottobre 2010
Caso 11 moria e spopolamento Lo spopolamento è verosimilmente da attribuire a fenomeni di
avvelenamento oppure a virosi particolarmente gravi
Caso 12 spopolamento Varroatosi generalizzata a tutto l’apiario (mancato trattamento
con acido ossalico per ritardi nell’arrivo di Api-Bioxal).
Avvelenamento per trattamento fitosanitario contro la mosca
dell’olivo realizzato con Imidacloprid (Confidor) e Dimetoato.
Caso 13 moria e spopolamento L’apicoltore ipotizza un avvelenamento da agrofarmaci per il
trattamento di coltura di sorgo, girasole e vite.
'
Si realizzerà infine, entro la fine del progetto, una attività di monitoraggio in campo di apiari a
rischio di spopolamento in quanto affetti da varroatosi e/o malattie correlate (virosi e nosemiasi),
"
7!"

per verificare l’andamento delle popolazioni di api mediante loro conteggio in entrata/uscita
impiegando i dispositivi messi a punto. Si provvederà infatti ad installare i dispositivi di conteggio
delle api, prevedendo un sistema affidabile di acquisizione e immagazzinamento dei dati basato su
datalogger e/o rete senza filo per il trasferimento di dati ad una unità centrale.
"
7#"

Bibliografia
3. Akyol, E; Yeninar, H (2008). Controlling Varroa destructor (Acari: Varroidae) in honeybee
Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) colonies by using Thymovar® and BeeVital®.
Ital.J.Anim.Sci. 7: 237-242.
4. Colombo, M; Spreafico, M (1999). Control of Varroa jacobsoni infestation in bees with a
new thymol preparation. Selezione Veterinaria 7: 473-478.
5. Damiani N., Gende L.B., Ballac P. (2009). Acaricidal and insecticidal activity of essential
oils on Varroa destructor (Acari: Varroidae) and Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae).
Parassitol Res. 106: 145-1639-y. DOI 10.1007/s00436-009-1639-y
6. Damiani, N; Gende, LB; Bailac, P; Marcangeli, J A; Eguaras. M J, 2009. Acaricidal and
insecticidal activity of essential oils on Varroa destructor (Acari: Varroidae) and Apis
mellifera (Hymenoptera: Apidae). Parasitol Res 106:145–152.
7. Damiani N., Gende L.B., Matias D. Maggi S.P., Marcangeli J.A., Eguaras M. (2009).
Repellent and acaricidal effects of botanical extracts on Varroa destructor. Parasitol. Res
108:79-86.
8. Gal, H; Slabezki, Y; Lensky, Y (1992). A preliminary report on the effect of origanum oil
and thymol applications in honey bee (Apis mellifera L.) colonies in a subtropical climate on
population levels of Varroa jacobsoni. Bee Science 2(4): 175-180.
9. Higes Pascual, M; Suarez Robles, M; Llorente Martinez, J (1996). Test of the efficacy of
thymol in the control of varroosis in the honey bee (Apis mellifera). Colmenar 1: 29-31.
10. Imdorf, A; Bogdanov, S; Ochoa, R I; Calderone, N W (1999). Use of essential oils for the
control of Varroa jacobsoni Oud. in honey bee colonies. Apidologie 30(2-3): 209-228.
11. Lindberg C. M., Melathopoulos A.P., Winston M.L. (2000). Journal of Economic
Entomology 93 (2):189-198.
12. Maori, E; Paldi, N; Shafir, S; Kalev, H; Tsur, E; Glick , E; Sela I. (2009) IAPV, a beeaffecting
virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA
ingestion. Insect Molecular Biology 18(1), 55–60.
13. Melathopoulos, A; Winston, M; Whittington, R; Smith, T; Lindberg, C; Mukai, A; Moore,
M (2000a). Comparative laboratory toxicity of neem pesticides to honey bees, their mite
parasites Varroa jacobsoni and Acarapis woodi and brood pathogens Paenibacillus larvae
and Ascophaera apis. Journal of Economic Entomology 93(2): 199-209
"
7/"

14. Melathopoulos, A; Winston, M; Whittington, R; Higo, H; Le Doux, M (2000b). Field
evaluation of neem and canola oil for the selective control of the honey bee mite parasites
Varroa jacobsoni and Acarapis woodi. Journal of Economic Entomology 93(3): 559-567.
15. Whittington, R; Winston, M; Melathopoulos, A; Higo, H (2000). Evaluation of the botanical
oils neem, thymol and canola sprayed to control Varroa jacobsoni and Acarapis woodi in
colonies of honey bees. American Bee Journal 140(7): 567-572.
"
77"