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COLORAZIONI<br />
ISTOMORFOLOGICHE
CLASSIFICAZIONE DELLE COLORAZIONI:<br />
Le colorazioni, indipendentemente dal meccanismo d’azione del<br />
colorante, possono essere divise in due gruppi:<br />
1.colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto nervoso,<br />
collagene, ecc...);<br />
2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze<br />
chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’ematossilina è una sostanza vegetale isolata da un estratto di legno azzurro<br />
(legno di campeggio, Haematoxylum campechianum ) un albero originario del<br />
centro America. Questa è di per sé incolore (o si presenta sotto forma di<br />
cristalli giallo-bruni) incapace di colorare. Il vero colorante non è<br />
l’ematossilina, ma il suo prodotto di ossidazione: l’emateina (per questo<br />
all’ematossilina vanno aggiunte sostanze ossidanti come il permanganato di<br />
potassio, l’idrato di potassio, iodato di sodio, ecc.).<br />
Ematossilina<br />
Emateina
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’emateina è colorata e costituisce il cromoforo, è anionica e non ha particolari<br />
affinità con gli acidi nucleici. Per conferire al composto una carica positiva è<br />
necessario aggiungere un mordente (ad es. l’allume potassico: KAl(SO 4<br />
) 2<br />
·<br />
12H 2<br />
O) che costituirà con l’emateina, una lacca relativamente insolubile:<br />
l’emallume. L’ematossilina più usata nel laboratorio e’ quella di Mayer, ed e’ così<br />
costituita:<br />
-ALLUME DI POTASSIO;<br />
-EMATOSSILINA;<br />
-IODATO DI SODIO;<br />
-ACIDO CITRICO;<br />
-CLORALIO (tossico; corrosivo).<br />
Alcuni metodi di colorazione comportano una mordenzatura. Questa operazione consiste nel trattare<br />
il tessuto con un composto capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali a loro volta,<br />
potranno legarsi con un colorante basico o acido. Il composto che costituisce questo termine di<br />
collegamento fra il tessuto e il colorante è detto mordente .
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)<br />
EMATEINA<br />
ossidazione di ematossilina<br />
Compl. con Al EMALLUME (Mayer - Carazzi)<br />
Fe EMAT. HARRIS (Lillie)<br />
Ematossiline<br />
progressive<br />
regressive<br />
- Differenziazione<br />
- pH
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
A seconda del mordente usato, alluminio, ferro, cromo, ecc..., si<br />
distinguono ematossiline alluminiche (o emallumi), ematossiline<br />
ferriche, ematossiline cromiche, ecc... .<br />
Le soluzioni ematossiliniche emalluminiche più usate in istologia sono:<br />
1. Ematossilina di Mayer;<br />
2. Ematossilina di Harris;<br />
3. Ematossilina di Delafield;<br />
4. Ematossilina di Carazzi;<br />
5. Ematossilina di Ehrlich.<br />
1. Ematossilina di Weigert;<br />
2. Ematossilina di Heidenhain.
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’eosina è un colorante artificiale debolmente acido, di cui esistono<br />
varie forme, che colora i citoplasmi, il tessuto connettivo e la<br />
sostanza intercellulare in varie tonalità di rosa. L'eosina è<br />
chimicamente una tetrabromofluoresceina. Più precisamente, sono di<br />
comune utilizzo due molecole di eosina denominate Y e B.<br />
Eosina Y<br />
Eosina B
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
• sezioni in H 2<br />
O distillata<br />
• Emallume acido di Mayer, filtrato ( 7’)<br />
• lavare H 2<br />
O corrente (10’)<br />
• Eosina [0.25 %], acidificata con qualche<br />
goccia di CH 3<br />
COOH (1’)<br />
• lavare in H 2<br />
O distillata (2’)<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Nucleo Blu - viola<br />
Citoplasma Rosa - rosso<br />
• disidratare in etanolo 95° (4’)<br />
• disidratare in etanolo 100° (4’) (3 cambi)<br />
• chiarificare in xilolo (3 cambi)<br />
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan<br />
o balsamo Canada)
EMATOSSILINA DI EHRLICH
METODI CITOLOGICI<br />
La colorazione EE può essere descritta come un metodo che si<br />
utilizza per lo studio topografico e generale per tessuti e organi.<br />
Ci sono però alcuni metodi in grado di mettere in evidenza strutture<br />
specifiche: ci sono quindi metodi che evidenzieranno il connettivo<br />
piuttosto che il tessuto nervoso, ma anche tecniche per lo studio<br />
fine di organuli cellulari.
METODI CITOLOGICI CON COLORAZIONE<br />
REGRESSIVA DI LACCHE DI EMATOSSILINA<br />
Si tratta di metodi di cui non si conosce ancora appieno il<br />
meccanismo di azione.<br />
EMATOSSILINA FERRICA (Metodo di Heidenhain)<br />
Metodo di elezione per lo studio della cariocinesi. Regolando la<br />
differenziazione si possono mettere in evidenza anche i centrioli o<br />
inclusioni citoplasmatiche.
EMATOSSILINA FERRICA
STUDIO DEI TESSUTI E<br />
DEGLI ORGANI
TESSUTO<br />
NERVOSO
TESSUTO NERVOSO<br />
Tra le prime tecniche per lo studio del tessuto nervoso vanno<br />
ricordate quelle per mettere in evidenza i Corpi di Nissl.<br />
Uno di questi metodi prevede l’uso del Cresyl Violet. Si tratta di un<br />
colorante basico che lega rapidamente le componenti acide del<br />
citoplasma dei neuroni (soprattutto l’RNA dei ribosomi, compresi i<br />
nuclei). Questo colorante mette ben in evidenza i Corpi di Nissl che<br />
sono appunto aggregazioni del RER tipiche dei neuroni.<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
RNA nero<br />
Altre strutture viola<br />
Altri metodi impiegano l’uso del Blu di Toluidina.
Metodo di GOLGI-CAJAL<br />
Per quanto riguarda lo studio della forma dei neuroni si possono<br />
usare alcuni metodi colorimetrici sia vitali che non (un esempio di<br />
colorazione vitale usata nei vertebrati è quella con il Blu di<br />
Metilene). <strong>Risultati</strong> migliori si ottengono mediante impregnazioni<br />
metalliche elettive. Fra questi metodi il più noto è quello<br />
dell’impregnazione cromoargentica di Golgi (sec. Cajal) che utilizza la<br />
precipitazione elettiva di cromato di argento sulle cellule nervose<br />
quando queste sono state preventivamente fissate con tetraossido<br />
di osmio e bicromato di potassio. Oltre l’argento si può usare anche<br />
l’oro.
Metodo di BIELSCHOWSKY per neurofibrille<br />
Metodo di elezione per la visualizzazione di neurofibrille, assoni,<br />
dendriti, placca senile. I metodi di impregnazione argentica sono fra<br />
i metodi più comunemente usati in neuroistologia.<br />
Il principio su cui si basano le tecniche di impregnazione è il<br />
seguente: l’argento, presente in alcuni composti allo stato di<br />
ossidazione +1 (es. AgNO 3<br />
), può essere ridotto da alcune componenti<br />
tissutali allo stato metallico insolubile.<br />
Selettività del metodo Bielschowsky: il diverso grado di argirofilia<br />
degli elementi cellulari presenti del tessuto nervoso permette<br />
attraverso una opportuna calibrazione della soluzione riducente di<br />
evidenziare selettivamente neurofibrille, assoni, dendriti, placca<br />
senile.
TESSUTO NERVOSO<br />
(Luxol Fast Blue)<br />
Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li<br />
colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool<br />
isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina<br />
integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di<br />
Schwann). Tale colorazione è spesso associata al Cresyl Violet<br />
(Metodo di Klüver-Barrera).<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Mielina blu-azzurro<br />
Luxol Fast Blue:<br />
Rame ftalocianina<br />
solfonata<br />
(X=SO 3-<br />
)
Klüver-Barrera
TESSUTO<br />
CONNETTIVO
AZAN-MALLORY (AM)<br />
Colorazione AZAN (acronimo di AZocarmine-ANilin blue) modificata da Mallory. E’<br />
una delle tecniche di colorazione utilizzate per mettere in evidenza le fibre collagene<br />
del tessuto connettivo.<br />
Il metodo associa una colorazione citologica ottenuta tramite un colorante acido<br />
(azocarminio) ad una colorazione di contrasto effettuata con blu di anilina dopo<br />
mordenzatura con acido fosfotungstico. Per ottenere buoni risultati occorre<br />
sovracolorare con azocarminio, quindi differenziare lentamente con alcol-anilina, al<br />
fine di evitare che la colorazione di contrasto predomini<br />
Azocarminio<br />
Blu di anilina
AZAN-MALLORY (AM)<br />
Si utilizzano in sequenza due coloranti:<br />
-Azocarminio (colora i nuclei in rosso vivo ed il citoplasma in rosso<br />
chiaro)<br />
-Miscela di Mallory (Blu d’anilina, Orange G e acido ossalico, evidenzia<br />
il connettivo in azzurro).<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Collagene, reticolo, granuli basofili (ipofisi) blu-azzurro<br />
Neurofibrille rossastro<br />
Muscolo arancio<br />
Nuclei, eritrociti e granuli acidofili (ipofisi) rosso<br />
Granuli citoplasmatici delle cellule delta dell’ ipofisi azzurro<br />
Il meccanismo di colorazione non è ancora completamente compreso. Alcune<br />
spiegazioni propongono che l'acido fosfotungstico funga da mordente per<br />
legare i colori basici al tessuto.
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (MGG):
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA:<br />
È una doppia colorazione utilizzata normalmente per colorare gli<br />
strisci di sangue (simile al metodo Wright-Giemsa). Il sangue viene<br />
strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30 min.<br />
all’aria e colorato prima con la miscela di May-Grüwald (blu di<br />
metilene, colorante basico, e eosina, colorante acido). Segue poi un<br />
lavaggio e una colorazione con l’eosinato azzurro (colorante di<br />
Giemsa) composto da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B<br />
e violetto di metilene.<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Globuli rossi rosa-arancio<br />
Nuclei dei leucociti blu-porpora<br />
Granuli eosinofili rosso brillante<br />
Granuli basofili blu<br />
Blu di metilene
Acidofilo<br />
Neutrofilo<br />
Piastrine<br />
Linfocita<br />
Basofilo<br />
Monocita
VERHOEFF – VAN GIESON (VVG)<br />
Si tratta di un metodo combinato. Il metodo di Verhoeff è una colorazione<br />
specifica per le fibre elastiche (in particolare per la proteina elastina). La<br />
colorazione di Van Gieson è specifica per il collagene. In questo metodo le<br />
sezioni sono colorate regressivamente con ematossilina (usando un eccesso<br />
di mordente, il cloruro ferrico, in modo da avere una maggiore affinità della<br />
stessa ematossilina ferrica per le fibre elastiche rispetto agli altri<br />
elementi).<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Fibre elastiche blu-nero<br />
Nuclei blu-nero<br />
Collagene rosso<br />
Altri elementi giallo
WEIGERT - VAN GIESON (WvG):<br />
Metodo combinato per la visualizzazione sul medesimo preparato delle<br />
fibre elastiche, del connettivo, del collagene e dei nuclei.<br />
Il metodo (Weigert “metodo lungo”) sfrutta l’ affinità per le fibre<br />
elastiche del precipitato (cresofucsina) ottenuto facendo reagire<br />
resorcina, fucsina basica e cristalvioletto con perclorato di ferro. La<br />
specificità del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e<br />
membrane basali possono colorarsi; è quindi importante una accurata<br />
differenziazione per ottenere una colorazione marcata e selettiva delle<br />
fibre elastiche. Il contrasto con la colorazione tricromica di Van Gieson<br />
permette di differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel<br />
contempo anche i nuclei.<br />
Applicazione : fibre elastiche.
Weigert - Van Gieson:<br />
Resorcina<br />
Fucsina basica<br />
Cristalvioletto<br />
<strong>Risultati</strong><br />
Fibre elastiche da blu scuro a nero<br />
Nuclei neri<br />
Collagene rosso,<br />
Connettivo, eritrociti, ecc giallo
TRICROMICA DI GOLDNER:<br />
Una colorazione è detta tricromica quando si usano due o più coloranti per<br />
tingere differenzialmente diverse strutture istologiche.<br />
Il metodo della tricromica di Goldner (conosciuto anche come Masson-<br />
Goldner) utilizza l’ematossilina, rosso Ponçeau, orange G e light green.<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Strutture basofile (come la cromatina) marrone-nero<br />
Strutture debolmente acidofile (cartilagine) rosso-arancio<br />
Strutture fortemente acidofile (fibre collagene, osso) azzurro-verde<br />
Rosso Ponceau Orange G Light green
TRICROMICA DI MASSON:<br />
Metodo di elezione per il tessuto connettivo, particolarmente<br />
indicato per gameti, nuclei, neurofibrille, nevroglia, collagene,<br />
cheratina, fibrille intracellulari e immagini in negativo dell’ apparato<br />
di Golgi.<br />
Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina<br />
ferrica di Weigert, una colorazione delle emazie con acido picrico e<br />
una colorazione del connettivo con due differenti coloranti acidi<br />
(Light Green oppure blu di anilina/blu di metilene)<br />
<strong>Risultati</strong> :<br />
Nuclei e gameti nero<br />
Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili rosso<br />
Collagene, muco, granuli basofili dell’ipofisi blu /verde<br />
Eritrociti giallo
PENTACROMICA DI MOVAT:<br />
Questo metodo, piuttosto lungo e laborioso, consente di rivelare<br />
contemporaneamente le mucosostanze acide e i diversi componenti<br />
del connettivo. Coloranti utilizzati: alcian blu, resorcifucsina, blu di<br />
celestina sec Culling, ematossilina di Weigert e miscela di Van<br />
Gieson.<br />
<strong>Risultati</strong>:<br />
Mucine acide e sostanza fondamentale blu<br />
Collagene rosso<br />
Elastina rosso purpureo<br />
Muscolo giallo<br />
Neclei neri
Tessuto osseo<br />
Per l’osservazione microscopica del tessuto osseo si<br />
utilizzano tecniche particolari che tengono conto della<br />
struttura dura e mineralizzata dell’osso stesso. Per<br />
allestire un preparato sottile di tessuto osseo per<br />
l’osservazione microscopica vengono generalmente<br />
impiegate delle varianti delle procedure tradizionali<br />
che possono essere schematizzate come segue:<br />
1) METODI PER DECALCIFICAZIONE<br />
2) METODI PER USURA
Osso – Metodo per decalcificazione<br />
I metodi per decalcificazione servono per mantenere la componente<br />
organica dell’osso, a scapito tuttavia della componente minerale che viene<br />
più o meno completamente rimossa. Il frammento di osso da esaminare<br />
viene fissato subito dopo il prelievo, al fine di preservare al meglio la<br />
morfologia delle cellule e l’integrità delle molecole organiche della sostanza<br />
intercellulare. Successivamente si procede alla rimozione della componente<br />
minerale, che viene dissolta chimicamente mediante il soggiorno del<br />
frammento in una soluzione acida. Per queste tecniche si possono usare o<br />
soluzioni di acidi organici (es. acido citrico, acido ascorbico) o di chelanti<br />
del calcio (es. acido etilendiamminotetraacetico o EDTA, acido<br />
etilenglicoltetraacetico o EGTA), che rimuovono la parte inorganica senza<br />
troppo danneggiare la parte organica. Una volta rimosso il minerale, il<br />
campione viene trattato come qualunque altro campione molle: inclusione in<br />
paraffina, sezionamento con microtomo e colorazione.
Osso – Metodo per usura<br />
I metodi per usura sono utilizzati quando si vuole preservare la componente<br />
minerale (ma anche la componente organica – collagene – mineralizzata). La<br />
componente cellulare (componente organica non mineralizzata) viene<br />
eliminata facendo macerare in acqua (per un tempo sufficiente) il<br />
frammento osseo prelevato. Successivamente dal frammento macerato<br />
viene tagliata manualmente una sezione piuttosto spessa che viene fatta<br />
asciugare e poi aderire ad un vetrino portaoggetto tramite una goccia di<br />
mezzo di montaggio (es. balsamo del Canadà o balsami sintetici). Una volta<br />
che questo si è solidificato, la sezione di osso viene lavorata con carta<br />
abrasiva a grana decrescente, fino a ridurla per usura ad uno spessore<br />
sufficientemente sottile da renderla attraversabile dalla luce. Viene poi<br />
messo sopra il montante e il vetrino coprioggetto.