MKONA 1 (Z) Onconeural Antigens IgG - Milenia Biotec GmbH
MKONA 1 (Z) Onconeural Antigens IgG - Milenia Biotec GmbH
MKONA 1 (Z) Onconeural Antigens IgG - Milenia Biotec GmbH
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural HuD, Ri,<br />
Yo and Amphiphysin I/II specific <strong>IgG</strong> autoantibodies<br />
English: Page 1-8<br />
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-, Ri-,<br />
Yo- und Amphiphysin I/II-spezifischen <strong>IgG</strong> Autoantikörpern<br />
Deutsch: Seite 9-14<br />
Dot Blot per the la determinazione qualitativa di autoanticorpi<br />
<strong>IgG</strong> onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina I/II<br />
Italiano: Pagine 15-20<br />
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (<strong>IgG</strong>)<br />
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine I/II<br />
Français : Page 21-28<br />
REF:<br />
<strong>MKONA</strong> 1 (Z)<br />
24 (8)<br />
Privates Institut für Immunologie<br />
und Molekulargenetik <strong>GmbH</strong><br />
Kriegsstraße 99<br />
D-76133 Karlsruhe, Germany<br />
Distribution/Service:<br />
Vertrieb/Service:<br />
Distribuzione/Assistenza:<br />
Distribution/Service:<br />
<strong>Milenia</strong> <strong>Biotec</strong> <strong>GmbH</strong><br />
Hohe Straße 4-8<br />
D-61231 Bad Nauheim, Germany<br />
Tel.: +49-(0)6032-8040-0<br />
Fax: +49-(0)6032-8040-80<br />
E-Mail: info@milenia-biotec.de<br />
Distribution/Service:<br />
http://www.milenia-biotec.de<br />
<strong>MKONA</strong> / P / 2007-03-30
- 2 -<br />
Explanation of Sym bols<br />
Symbols (GB) / Symbole (D) / Symboli (I) /<br />
Símbolos (E) / Symboles (F) / Jelölés (H)<br />
REF<br />
Explanation / Erklärung / Significato / Significado /<br />
Signification / Magyarázat<br />
Expiry date<br />
Haltbarkeitsdatum<br />
Data di scadenza<br />
Fecha de caducidad<br />
Date d’expiration<br />
Lejárati idõ<br />
In Vitro Diagnostic Medical Device<br />
In Vitro Diagnostikum<br />
Dispositivo medico-diagnostico in vitro<br />
Para uso en el Diagnóstico in vitro<br />
Diagnostic in vitro<br />
In vitro diagnosztikum<br />
Batch code<br />
Los-Bezeichnung<br />
Codice del lotto<br />
Lote<br />
Numéro de lot<br />
Sarzsszám<br />
Catalogue number<br />
Artikel-Nummer<br />
Numero di catalogo<br />
Referencia<br />
Référence<br />
Katalógusszám<br />
Storage conditions<br />
Lagerungsbedingungen<br />
Temperatura di conservazione<br />
Temperatura de conservación<br />
Température de conservation<br />
Tárolási körülmények<br />
Consult Instructions for Use<br />
Gebrauchsanweisung beachten<br />
Consultare le istruzioni per l‘uso<br />
Consultar instrucciones de uso<br />
Consulter la notice<br />
A használati utasítás tanulmányozandó<br />
Consult attended documents<br />
Begleitdokumente beachten<br />
Consultare i documenti relativi<br />
Consultar documentos adjuntos<br />
Consulter le document avec attention<br />
A csatolt dokumentumok tanulmányozandók<br />
Package size<br />
Packungsgröße<br />
Numero di test<br />
Número de determinaciones<br />
Nombre de tests par trousse<br />
Kiszerelés nagysága<br />
Manufacturer<br />
Hersteller<br />
Produttore<br />
Fabricante<br />
Fabriqué par<br />
Gyártó<br />
Only for evaluation purposes<br />
Nur zur Leistungsbewertung<br />
Solo per uso sperimentale<br />
Con fines exclusivos de evaluación<br />
Pour évaluation uniquement<br />
Kizárólag vizsgálati célokra<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 3 -<br />
M aterials Supplied, Storage and Stability<br />
Components Cat.-No. Content Preparation Store at Shelf life<br />
ONA Dotblot Strips,<br />
nitrocellulose strips coated with<br />
recombinant onconeural antigens<br />
HuD, Ri, Yo and Amphiphysin I/II<br />
ONA Control Sera,<br />
negative control<br />
positive control<br />
cut-off control<br />
ONA Enzyme Conjugate,<br />
polyclonal (goat) anti-hu-<strong>IgG</strong><br />
antibodies, labeled with alkaline<br />
phosphatase<br />
ONA Buffered Wash Solution,<br />
Concentrate (5x)<br />
Substrate Solution,<br />
contains 5-Brom-4-chloro-3-<br />
indolyl phosphate and 4-Nitrobluetetrazoliumchloride<br />
MONADS 24 (8) ready to use 2 - 8 °C<br />
Protect from<br />
moisture! Store<br />
together with<br />
desiccant in the<br />
tube!<br />
Do not touch<br />
with fingers!<br />
MONAC1/2/3 1 set<br />
3 vials à<br />
50 µL<br />
MEONA<br />
MWBONA<br />
MSONA<br />
2 (1) vial(s)<br />
à 15 mL<br />
1 vial<br />
50 mL<br />
Disposable incubation trays MONAP 3 (1)<br />
Evaluation Sheet ONAA 1 (1)<br />
2 (1) vial(s)<br />
à 15 mL<br />
Predilution!<br />
Dilute 1 : 20 with<br />
1 x wash buffer<br />
see expiry date<br />
2 – 8 °C 30 days after<br />
dilution, resp.<br />
until the expiry<br />
date<br />
ready to use 2 - 8 °C 30 days after<br />
dilution, resp.<br />
until the expiry<br />
date<br />
Dilute before use:<br />
e.g. add to 10 mL<br />
5 x wash buffer<br />
to 40 mL dest.<br />
water<br />
ready to use 2 - 8 °C<br />
Protect from<br />
light!<br />
Material Safety Data Sheets are available on request (see also www.milenia-biotec.de).<br />
2 - 8 °C 30 days after<br />
opening, 5 days<br />
after dilution<br />
30 days after<br />
opening, resp.<br />
until the expiry<br />
date<br />
M aterials Required<br />
horizontal Shaker<br />
Vortex mixer<br />
destilled water<br />
graduated cylinder for 250 mL; storage flasks for the wash buffer<br />
pipettes for 10, 50 and 1000 µL<br />
reaction tubes for predilution of the samples<br />
optional: Westernblot Processor<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 4 -<br />
Specim en Collection and Preparation<br />
Serum, plasma (EDTA, citrated, heparinized) and cerebrospinal fluid (CSF) can be used as sample<br />
materials. All serum/plasma samples and controls provided with the kit should be prediluted 1:20 with<br />
wash buffer; e.g. 10 µL sample is mixed with 190 µL wash buffer. CSF can be used undiluted. At the<br />
end of the procedure the final dilution of the sample is 1:2000.<br />
During transportation, patient samples may be stored at room temperature for up to 24 hours. For<br />
short term storage the samples can be stored at 2-8 °C for up to 5 days. For long term storage the<br />
samples should be dispensed and stored frozen at < -18°C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.<br />
W arnings and Precautions<br />
All reagents of this test kit are strictly intended for in vitro diagnostic use only. This test should be<br />
carried out only by persons who are familiar in performing in vitro diagnostic procedures. Please follow<br />
strictly the sequence of pipetting steps provided in this protocol.<br />
Sample material of patients are always potentially infectious. Handling of samples suspected to be<br />
infectious should be done in a laminar flow clean bench.<br />
M ethod and Test Principle<br />
The <strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> assay is an immunoassay in a dot blot format for the qualitative<br />
detection of human <strong>IgG</strong> autoantibodies against the neuronal antigens HuD, Ri, Yo and Amphiphysin.<br />
Human recombinant proteins HuD, Ri, Yo, Amphiphysin I and Aphiphysin II are immobilized on fixed<br />
locations of a nitrocellulose membrane; in addition anti-human <strong>IgG</strong> antibodies are immobilized as<br />
functional control.<br />
The prediluted sample is pipetted to the antigen coated carrier membrane. During the first incubation<br />
period the autoantibodies present in the patient’s samples will bind according to their antigen<br />
specificity. In the following step unbound serum components are washed away. Bound immune<br />
complexes are labelled with alkaline phosphatase conjugated anti-human <strong>IgG</strong> during the next<br />
incubation period. Surplus of conjugate is removed by washing the strips. Finally, immunocomplexes<br />
are visualized by the addition of the colorless enzym substrate BCIP which forms a blue precipitate<br />
line. Type of antibodies in the sample are then identified by comparing their position with the reference<br />
bands on the evaluation sheet.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 5 -<br />
Test Perform ance<br />
Important notes:<br />
Do not interchange components of different lots and assays.<br />
Do not use kit components beyond their expiration dates.<br />
All components should be prewarmed at room temperature (18 – 28 °C) before use.<br />
Dilute concentrates at least 30 minutes prior to use. Mix well, but prevent foam formation.<br />
To avoid carryover contamination carefully aspirate fluids; take particularly care on patient sample<br />
containing fluids!<br />
1. Dilute patient samples and controls 1 : 20<br />
with wash buffer (e.g. pipet 10 µL of sample +<br />
190 µL of wash buffer); mix well.<br />
2. Using tweezers, place the required number of<br />
strips in the incubation tray (labeling must<br />
face up).<br />
3. Overlay the strips with 1,000 µL wash buffer<br />
and incubate for 5 minutes at room<br />
temperature (18-28 °C) on a shaker. Do not<br />
aspirate; wash buffer remains in the<br />
reservoirs !<br />
4. Add 10 µL prediluted patient serum/plasma<br />
and prediluted controls (resp. 50 µL undiluted cerebrospinal fluid) and incubate for 90 minutes<br />
on a shaker.<br />
5. Aspirate and wash the strips with 1,000 µL wash buffer. Do it by carefully mixing and aspiration.<br />
6. Add 1,000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate the wash buffer. Repeat this<br />
step once.<br />
7. Pipet 1,000 µL Enzyme Conjugate solution and incubate for 60 minutes on a shaker.<br />
8. Aspirate and wash the strips with 1,000 µL wash buffer. Do it by carefully mixing and aspiration.<br />
9. Add 1,000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate fluid. Repeat this step once.<br />
10. Pipet 1,000 µL of Substrate Solution and incubate 5-15 minutes on a shaker. Control the color<br />
development after 5 minutes. The functional control should be a clearly visible band on all<br />
strips. Especially the positive control should show five clearly visible bands.<br />
11. Aspirate Substrate Solution and wash twice with 1,000 µL of distilled water.<br />
12. Remove the strips from their reservoir using tweezers. Airdry on adsorbent paper for about<br />
30 minutes.<br />
13. Interpret the band pattern according the evaluation sheet provided with the kit.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 6 -<br />
Interpretation of Results<br />
After complete drying the strips will be placed according their functional control on the evaluation<br />
sheet (see interpretation sample) with the numbers on top and the ends of the strips fixed with<br />
adhesive film. The position of the antigen bands may slightly vary from lot to lot, but they always lay<br />
within the indicated marks of the evaluation sheet. The blue color of the antigen bands will fade, if the<br />
dry strips are exposed to air and light for a longer time.<br />
M: marker for position of antigens.<br />
Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
1. negative control.<br />
2. positive control.<br />
3. cut-off control<br />
4-8. example of patient sera.<br />
Amphiphysin I<br />
Amphiphysin II<br />
Yo<br />
Ri<br />
HuD<br />
Functional Control<br />
Test results are interpreted by comparing locations and color intensities of the bands with those of the<br />
cut-off control supplied with the kit.<br />
Positive Result<br />
Negative Result<br />
Only samples with a stronger color intensity than No bands or very weak color intensities (weaker<br />
the signal obtained with the cut-off control are than those of the cut-off control) are interpreted<br />
clearly antibody positive<br />
as antibody negative<br />
In principle, the results of this immuno dot blot should only be interpreted for diagnosis only in context<br />
with the patient´s clinical state of health and other diagnostic and epidemiologic data.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 7 -<br />
Q uality Control<br />
The functional control on each strip (internal reaction control) has to display an intensive color. The<br />
negative control must show only the functional control band; in very rare cases very faint bands can be<br />
seen, which have no importance.<br />
The positive control must always show an intensive staining of the five antigens (Yo, Ri, Hu-D and<br />
Amphiphysin I/II) and the functional control; if not, the test has to be repeated.<br />
Assay Characteristics<br />
Sample material:<br />
Time for test procedure:<br />
Specificity:<br />
serum, plasma, cerebrospinal fluid<br />
3.5 hours<br />
by probing 100 healthy blood donors none tested serum was found to be<br />
positive.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 8 -<br />
Short Instruction: O nconeural <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
(all sample volumes are given in µL)<br />
Steps Solution Sample Controls<br />
negative/positive/cut-off<br />
Pipet to the strips Wash Buffer 1000 1000<br />
Incubate for 5 min at room temperature<br />
(18-28 °C) on a shaker; do not aspirate<br />
the solution!<br />
Add<br />
Add<br />
Incubate for 90 min at room temperature<br />
(RT) on a shaker<br />
Aspirate; wash the strips with 1,000 µL<br />
wash buffer by mixing gently and aspirate<br />
again<br />
Add 1,000 µL of wash buffer to each strip<br />
and incubate for 5 min at RT on a shaker;<br />
aspirate<br />
Repeat this step once<br />
Add<br />
pre-diluted<br />
Control<br />
pre-diluted<br />
Sample<br />
(CSF undiluted)<br />
Enzyme<br />
Conjugate<br />
- 10<br />
10<br />
(50)<br />
1000 1000<br />
-<br />
Incubate for 60 min at RT on a shaker<br />
Aspirate; wash the strips with 1,000 µL<br />
wash buffer by mixing gently and aspirate<br />
again<br />
Add 1,000 µL of wash buffer to each strip<br />
and incubate for 5 min at RT on a shaker;<br />
aspirate<br />
Repeat this step once<br />
Add<br />
Incubate for 5 – 15 min at RT on a shaker<br />
Decant and wash the strips twice with<br />
1,000 µL destilled water<br />
Remove the strips with tweezers and airdry<br />
on adsorbent paper for about 30 min<br />
Analyze the band pattern using the<br />
evaluation sheet<br />
Substrate<br />
Solution<br />
1000 1000<br />
For a detailed description of the procedure see also page 5.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 9 -<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural HuD, Ri, Yo<br />
and Amphiphysin I/II specific <strong>IgG</strong> autoantibodies<br />
English: Page 1-8<br />
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-,<br />
Ri-, Yo- und Amphiphysin I/II -spezifischen <strong>IgG</strong><br />
Autoantikörpern<br />
Deutsch: Seite 9-14<br />
Dot Blot per the la determinazione qualitativa di autoanticorpi<br />
<strong>IgG</strong> onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina I/II<br />
Italiano: Pagine 15-20<br />
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (<strong>IgG</strong>)<br />
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine I/II<br />
Français : Page 21-28<br />
REF:<br />
<strong>MKONA</strong> 1 (Z)<br />
24 (8)<br />
Privates Institut für Immunologie<br />
und Molekulargenetik <strong>GmbH</strong><br />
Kriegsstraße 99<br />
D-76133 Karlsruhe, Germany<br />
Distribution/Service:<br />
Vertrieb/Service:<br />
Distribuzione/Assistenza:<br />
Distribution/Service:<br />
<strong>Milenia</strong> <strong>Biotec</strong> <strong>GmbH</strong><br />
Hohe Straße 4-8<br />
D-61231 Bad Nauheim, Germany<br />
Tel.: +49-(0)6032-8040-0<br />
Fax: +49-(0)6032-8040-80<br />
E-Mail: info@milenia-biotec.de<br />
Distribution/Service:<br />
http://www.milenia-biotec.de<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 10 -<br />
Kitbestandteile, Lagerung und Stabilität<br />
Komponente Art.-Nr. Inhalt Vorbereitung Lagerung bei Haltbarkeit<br />
ONA Dot-Blot Streifen<br />
(ONA Dotblot strips),<br />
Nitrozellulose-Streifen<br />
beschichtet mit rekombinanten<br />
onkoneuralen<br />
Antigenen HuD, Ri, Yo und<br />
Amphiphysin<br />
MONADS 24 (8) gebrauchsfertig 2 - 8 °C<br />
Vor Feuchtigkeit<br />
schützen!<br />
Zusammen mit<br />
Trocknungsmittel<br />
in dem Röhrchen<br />
aufbewahren<br />
Nicht mit den<br />
Fingern anfassen!<br />
Bis zum<br />
Verfallsdatum<br />
ONA Kontroll-Sera<br />
(ONA Control Serum),<br />
Negativkontrolle<br />
Positivkontrolle<br />
Cut-off-Kontrolle<br />
MONAC1/2/3 1 Set<br />
3 Fl. à 50 µl<br />
Vorverdünnung!<br />
1:20 mit 1 x<br />
Waschpuffer<br />
verdünnen<br />
2 – 8 °C 30 Tage nach<br />
dem<br />
Verdünnen<br />
bzw. bis zum<br />
Verfallsdatum<br />
ONA Enzym-Konjugat<br />
(ONA Enzyme Conjugate),<br />
polyklonaler (Ziegen) antihu-<strong>IgG</strong><br />
Antikörper, markiert<br />
mit alkalischer Phosphatase<br />
ONA Waschpuffer<br />
(ONA Buffered Wash<br />
Solution),<br />
Konzentrat (5x)<br />
Substrat-Lösung<br />
(Substrate Solution),<br />
enthält 5-Brom-4-Chlor-3-<br />
Indolyl-Phosphat und 4-<br />
Nitro-Blautetrazoliumchlorid<br />
MEONA<br />
MWBONA<br />
MSONA<br />
2 (1) Fl.<br />
à 15 ml<br />
1 Fl.<br />
50 ml<br />
2 (1) Fl.<br />
à 15 ml<br />
Einweg-Inkubationswannen MONAP 3 (1)<br />
Auswertebogen ONAA 1 (1)<br />
gebrauchsfertig 2 - 8 °C 30 Tage nach<br />
dem<br />
Verdünnen<br />
bzw. bis zum<br />
Verfallsdatum<br />
Vor Gebrauch<br />
verdünnen: z.B.<br />
zu 10 ml<br />
Waschpuffer-<br />
Konzentrat<br />
40 ml dest.<br />
Wasser<br />
zugeben<br />
gebrauchsfertig 2 - 8 °C<br />
Vor Licht<br />
schützen!<br />
2 - 8 °C 30 Tage nach<br />
dem Öffnen, 5<br />
Tage nach dem<br />
Verdünnen,<br />
bzw. bis zum<br />
Verfallsdatum<br />
30 Tage nach<br />
dem Öffnen<br />
bzw. bis zum<br />
Verfallsdatum<br />
Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich (siehe auch unter www.milenia-biotec.de).<br />
Erforderliche Hilfsm ittel<br />
Horizontal-Schüttler<br />
Wirbelmischer (Vortex)<br />
destilliertes Wasser<br />
Messzylinder für 250 ml; Plastikgefäße zur Aufbewahrung des Waschpuffers<br />
Mikropipetten für 10, 50 und 1000 µl<br />
Reaktionsgefäße zur Probenverdünnung<br />
Optional: Westernblot Prozessor<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 11 -<br />
Probenentnahm e und -vorbereitung<br />
Als Probenmaterial können Serum, Plasma (EDTA, Citrat, Heparin) und Liquor cerebrospinalis<br />
verwendet werden. Alle Serum-/Plasmaproben und die im Kit befindlichen Kontrollen werden 1:20 mit<br />
Waschpuffer vorverdünnt; dazu wird beispielsweise 10 µl Probe zu 190 µl Wasch-Puffer gegeben.<br />
Liquor kann unverdünnt eingesetzt werden. Am Ende der Testdurchführung ist die Endverdünnung<br />
der Probe 1:2000.<br />
Für den Transport kann das Untersuchungsmaterial bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagert<br />
werden. Die Proben können gekühlt bei 2-8 °C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere<br />
Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei < -18 °C tiefgefroren werden. Wiederholte<br />
Einfrier- und Auftauzyklen sind zu vermeiden.<br />
Hinw eise und Vorsichtsm assnahm en<br />
Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-Diagnostik verwendet werden.<br />
Die Anwendung sollte durch Personal erfolgen, das speziell in Verfahren von in vitro-Diagnostika<br />
unterrichtet und ausgebildet wurde. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung<br />
des Tests ist unbedingt erforderlich.<br />
Untersuchungsmaterial von Patienten ist stets als potentiell infektiös einzustufen und sollte stets in<br />
einer Sicherheitswerkbank weiterbearbeitet werden.<br />
M ethodik und Testprinzip<br />
Der <strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> Test ist ein Immunoassay im Dot-Blot-Verfahren zur qualitativen<br />
Bestimmung von humanen <strong>IgG</strong>-Autoantikörpern gegen die neuronalen Antigene HuD, Ri, Yo und<br />
Amphiphysin. Die rekombinanten humanen Proteine HuD, Ri, Yo, Amphiphysin I und Amphiphysin II<br />
sind auf einer Nitrozellulose-Membran an fixen Stellen aufgetragen; zusätzlich sind anti-human-<strong>IgG</strong>-<br />
Antikörper als Funktionskontrolle aufgetragen.<br />
Die vorverdünnte Patientenprobe wird zu der Antigen-beladenen Trägermembran pipettiert. Während<br />
der ersten Inkubation (90 Minuten) binden die in der Patientenprobe vorhandenen Autoantikörper<br />
entsprechend ihrer Antigen-Spezifität. Im nächsten Schritt werden ungebundene Serumbestandteile<br />
weggewaschen. Während der nächsten Inkubation (60 Minuten) werden die gebundenen<br />
Immunkomplexe mit anti-human-<strong>IgG</strong>, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, markiert.<br />
Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen der Streifen entfernt. Schließlich werden die<br />
Immunkomplexe sichtbar gemacht, indem sich durch Zugabe von farblosem Enzymsubstrat (BCIP)<br />
eine blaue Präzipitat-Linie bildet. Die Antikörper-Typen der Probe werden durch den Vergleich der<br />
Positionen mit denen der Referenzbanden auf der Auswerteschablone identifiziert.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 12 -<br />
Testdurchführung<br />
Wichtige Hinweise<br />
Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen nicht ausgetauscht<br />
werden.<br />
Kitbestandteile dürfen nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht benutzt werden.<br />
Alle Komponenten müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 °C) erwärmt werden.<br />
Die Konzentrate müssen mindestens 30 Minuten vor Gebrauch verdünnt werden. Gut mischen,<br />
Schaumbildung vermeiden.<br />
Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden Flüssigkeiten vorsichtig absaugen; das gilt vor allem für<br />
die Patientenproben-haltigen Flüssigkeiten!<br />
1. Patientenproben und Kontrollen 1:20 mit<br />
Waschpuffer verdünnen (z.B. 10 µl Probe + 190<br />
µl Waschpuffer); gut mischen.<br />
2. Mit einer Pinzette die benötigte Anzahl an<br />
Streifen in die Inkubationswannen legen<br />
(Beschriftung nach oben).<br />
3. Streifen mit 1000 µl Waschpuffer überschichten<br />
und 5 Minuten bei Raumtemperatur (18-28 °C)<br />
auf einem Schüttler inkubieren. Nicht<br />
Absaugen, Waschpuffer verbleibt in den<br />
Reservoirs!<br />
4. 10 µl vorverdünntes Serum/Plasma und vorverdünnte Kontrollen (bzw. 50 µl unverdünnten<br />
Liquor) zugeben und 90 Minuten auf einem Schüttler inkubieren.<br />
5. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken und<br />
dann wieder absaugen.<br />
6. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritt<br />
einmal wiederholen.<br />
7. 1000 µl Enzymkonjugat-Lösung zupipettieren und 60 Minuten auf einem Schüttler inkubieren.<br />
8. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken und<br />
dann wieder absaugen.<br />
9. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritt<br />
einmal wiederholen.<br />
10. 1000 µl Substrat-Lösung zupipettieren und 5 - 15 Minuten unter Schütteln inkubieren. Nach<br />
5 Minuten die Farbentwicklung kontrollieren. Die Funktionskontrolle sollte auf allen Streifen als<br />
intensive Bande sichtbar sein. Insbesondere soll Positivkontrolle fünf deutlich sichtbare Banden<br />
aufweisen.<br />
11. Substratlösung absaugen und Streifen zweimal mit 1000 µl dest. Wasser waschen.<br />
12. Streifen mit einer Pinzette der Wanne entnehmen und für ca. 30 Minuten auf Filterpapier<br />
lufttrocknen.<br />
13. Das Bandenmuster mit dem im Kit vorhandenen Auswertebogen interpretieren.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 13 -<br />
Ausw ertung der Ergebnissse<br />
Die komplett getrockneten Streifen werden anhand der Funktionskontrolle auf dem Auswertebogen<br />
(siehe Auswertebeispiel) mit der Nummerierung nach oben ausgerichtet und mit Tesafilm an ihren<br />
Enden befestigt. Die Position der Antigene auf den Streifen kann chargenabhängig geringgradig<br />
variieren, sie liegen aber stets in dem Bereich der auf dem Auswertebogen befindlichen<br />
Markierungen. Die blaue Färbung der Antigen-Banden verblaßt, wenn die trockenen Streifen Luft und<br />
Licht für längere Zeit ausgesetzt sind.<br />
M: Positionsmarker der Antigene<br />
Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
1. Negativ-Kontrollserum<br />
2. Positiv-Kontrollserum<br />
3. Cut-off-Kontrollserum<br />
4-8. Beispiele für Patientenseren<br />
Amphiphysin I<br />
Amphiphysin II<br />
Yo<br />
Ri<br />
HuD<br />
Funktionskontrolle<br />
Die Testergebnisse werden anhand von Lokalisation und Farbintensität der Banden mit der Cut-off-<br />
Kontrolle aus dem Kit verglichen und entsprechend ausgewertet.<br />
Positives Ergebnis<br />
Negatives Ergebnis<br />
Nur Proben mit einer stärkeren Bandenintensität Keine oder ganz schwache Bandenintensitäten<br />
als die der Cut-off-Kontrolle sind eindeutig (schwächer als die der Cut-off-Kontrolle), sind als<br />
Antikörper-positiv.<br />
Antikörper-negativ zu interpretieren.<br />
Prinzipiell sollten die Ergebnisse des Immunoblots zur Diagnosestellung nur im Zusammenhang mit<br />
dem klinischen Bild und anderen diagnostischen und epidemiologischen Daten interpretiert werden.<br />
Q ualitätskontrolle<br />
Die auf jedem Streifen vorhandene Funktionskontrolle (interne Reaktionskontrolle) muß kräftig gefärbt<br />
sein. Die Negativ-Kontrolle darf nur die Färbung der Funktionskontrolle aufweisen; in wenigen<br />
seltenen Fällen treten sehr schwache Banden auf, denen keine Bedeutung zukommt.<br />
Die Positiv-Kontrolle muß immer eine kräftige Färbung der fünf Antigene (Yo, Ri, HuD und<br />
Amphiphysin I/II) und der Funktionskontrolle zeigen; falls nicht, muß der Test wiederholt werden.<br />
Testcharakteristika<br />
Probenmaterial:<br />
Zeit zur Testdurchführung:<br />
Spezifität:<br />
Serum, Plasma, Liquor<br />
3,5 Stunden<br />
Bei der Testung von 100 gesunden Blutspendern wurde für keines der<br />
untersuchten Seren ein positives Ergebnis gefunden<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 14 -<br />
Kurzanleitung: O nconeural <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
(alle Volumenangaben in µl)<br />
Schritte Lösung Probe Kontrolle<br />
negativ/positiv/cut-off<br />
Zu den Streifen pipettieren Waschpuffer 1000 1000<br />
5 min bei Raumtemperatur (18-28 °C) auf einem<br />
Schüttler inkubieren;<br />
die Lösungen nicht absaugen!<br />
Zugeben<br />
Zugeben<br />
90 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem<br />
Schüttler inkubieren<br />
Absaugen; die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer<br />
durch vorsichtiges Mischen waschen und wieder<br />
absaugen<br />
1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen zugeben<br />
und für 5 min bei RT auf einem Schüttler<br />
inkubieren; absaugen<br />
Diesen Schritt einmal wiederholen<br />
Zugeben<br />
60 min bei RT auf einem Schüttler inkubieren<br />
Absaugen; die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer<br />
durch vorsichtiges Mischen waschen und wieder<br />
absaugen<br />
1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen zugeben<br />
und für 5 min bei RT auf einem Schüttler<br />
inkubieren; absaugen<br />
Diesen Schritt einmal wiederholen<br />
Zugeben<br />
5 – 15 min bei RT auf einem Schüttler inkubieren<br />
Absaugen und zweimal mit 1000 µl dest. Wasser<br />
waschen<br />
Die Streifen mit einer Pinzette entfernen und auf<br />
einem Papier ca. 30 min lufttrocknen lassen<br />
Die Bandenmuster anhand des Auswertebogens<br />
analysieren<br />
vorverdünnte<br />
Kontrolle<br />
vorverdünnte<br />
Probe<br />
(Liquor<br />
unverdünnt)<br />
Enzym-<br />
Konjugat<br />
Substrat-<br />
Lösung<br />
Vgl. auch Seite 12 für eine detaillierte Beschreibung der Testdurchführung.<br />
- 10<br />
10<br />
(50)<br />
1000 1000<br />
1000 1000<br />
-<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 15 -<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural HuD, Ri, Yo<br />
and Amphiphysin I/II specific <strong>IgG</strong> autoantibodies<br />
English: Page 1-8<br />
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-, Ri-,<br />
Yo- und Amphiphysin I/II -spezifischen <strong>IgG</strong> Autoantikörpern<br />
Deutsch: Seite 9-14<br />
Dot Blot per the la determinazione qualitativa di<br />
autoanticorpi <strong>IgG</strong> onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e<br />
Amfifisina I/II<br />
Italiano: Pagine 15-20<br />
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (<strong>IgG</strong>)<br />
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine I/II<br />
Français : Page 21-28<br />
REF:<br />
<strong>MKONA</strong> 1 (Z)<br />
24 (8)<br />
Privates Institut für Immunologie<br />
und Molekulargenetik <strong>GmbH</strong><br />
Kriegsstraße 99<br />
D-76133 Karlsruhe, Germany<br />
Distribution/Service:<br />
Vertrieb/Service:<br />
Distribuzione/Assistenza:<br />
Distribution/Service:<br />
<strong>Milenia</strong> <strong>Biotec</strong> <strong>GmbH</strong><br />
Hohe Straße 4-8<br />
D-61231 Bad Nauheim, Germany<br />
Tel.: +49-(0)6032-8040-0<br />
Fax: +49-(0)6032-8040-80<br />
E-Mail: info@milenia-biotec.de<br />
Distribution/Service:<br />
http://www.milenia-biotec.de<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 16 -<br />
M ateriale Fornito, Conservazione e Stabilità<br />
Componenti Cat.-No. Contenuto Preparazione Conservare a Stabilità<br />
ONA Dotblot Strisce<br />
(ONA Dotblot strips),<br />
strisce di nitrocellulosa rivestite<br />
con antigeni ricombinanti<br />
onconeurali HuD, Ri, Yo e<br />
Amfifisina<br />
ONA Sieri di Controllo<br />
(ONA Control Serum),<br />
controllo negativo<br />
controllo positivo<br />
controllo cut-off<br />
MONADS 24 (8) Pronte all’uso 2 - 8 °C<br />
Proteggere<br />
dall’umidità!<br />
Conservare nel<br />
tubo con<br />
l’essiccante!<br />
Non toccare<br />
con le dita!<br />
MONAC1/2/3<br />
1 set<br />
3 flaconi da<br />
50 µL<br />
Prediluizione!<br />
Diluire 1:20 con<br />
tampone di<br />
lavaggio<br />
Fino alla data di<br />
scadenza<br />
2 - 8 °C 30 giorni dopo<br />
la diluizione o<br />
fino alla data di<br />
scadenza<br />
ONA Coniugato con Enzima<br />
(ONA Enzyme Conjugate),<br />
anticorpi policlonali (pecora) antih-<strong>IgG</strong>,<br />
marcati con fosfatasi<br />
alcalina<br />
ONA Soluzione di lavaggio<br />
tamponata (ONA Buffered Wash<br />
Solution)<br />
Concentrata (5x)<br />
Soluzione Substrato<br />
(Substrate Solution),<br />
contiene 5'Bromo-4'Cloro-<br />
3'Indolil-Fosfato e Cloruro di<br />
4'Nitro-Tetrazolio<br />
Contenitori disposable per<br />
l’incubazione<br />
MEONA<br />
MWBONA<br />
MSONA<br />
2 (1) flacone<br />
(i)<br />
da 15 mL<br />
1 flacone<br />
50 mL<br />
MONAP 3 (1)<br />
Schema di valutazione ONAA 1 (1)<br />
2 (1) flacone<br />
(i)<br />
da 15 mL<br />
Pronto all’uso 2 - 8 °C 30 giorni dopo<br />
la diluizione o<br />
fino alla data di<br />
scadenza<br />
Diluire prima<br />
dell’uso, ad es.<br />
aggiungendo 40<br />
mL acqua dist. a<br />
10 mL tampone<br />
lavaggio<br />
Pronta all’uso 2 - 8 °C<br />
Proteggere dalla<br />
luce!<br />
2 - 8 °C 30 giorni dopo<br />
l’apertura, 5<br />
giorni dopo<br />
diluizione<br />
30 giorni dopo<br />
l’apertura o fino<br />
alla data di<br />
scadenza<br />
Le schede di sicurezza sono disponibili a richiesta (consultare www.milenia-biotec.de).<br />
M ateriale richiesto<br />
Agitatore orizzontale<br />
Vortex mixer<br />
acqua distillata<br />
cilindro graduato per 250 mL; contenitori per il tampone di lavaggio<br />
pipette da 10, 50 e 1000 µL<br />
provette per la prediluizione dei campioni<br />
opzionale: Processore automatico per Western-blot<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 17 -<br />
Raccolta e preparazione dei cam pioni<br />
Siero, plasma (EDTA, citrato, eparinato) e liquido cerebrospinale (CSF) possono essere utilizzati<br />
come materiale campione. Tutti i campioni di siero/plasma forniti col kit devono essere prediluiti 1: 20<br />
con tampone lavaggio; ad es. 10 µL di campione è diluito con 190 µL di tampone lavaggio. Il liquido<br />
cerebrospinale (CSF) può essere utilizzato non diluito. Alla fine di esecuzione del test la diluizione<br />
finale del campione è 1:2000.<br />
Durante il trasporto i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 24 ore. I<br />
campioni refrigerati at 2-8 °C si conservano fino a 5 giorni. Per periodi più lunghi i campioni vanno<br />
aliquotati e congelati a < -18°C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti del campione.<br />
Avvertim enti e precauzioni<br />
Tutti I reattivi di questo kit sono tassativamente da intendersi solo per uso diagnostico in vitro. Il kit va<br />
utilizzato esclusivamente da personale addestrato all’uso di metodologie diagnostiche in vitro.<br />
Preghiamo di seguire alla lettera lo schema di pipettaggio indicato in questa procedura.<br />
I campioni dei pazienti sono sempre da considerarsi come potenzialmente infetti. I campioni di<br />
pazienti potenzialmente infetti vanno maneggiati in banchi di lavoro con cappe a flusso laminare.<br />
M etodo e principio del test<br />
Il test per gli <strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> è un immunoassay in formato “dot blot” per la determinazione<br />
qualitativa di autoanticorpi <strong>IgG</strong> umani anti antigeni neuronali HuD, Ri, Yo e Amfifisina. Proteine umane<br />
ricombinanti di HuD, Ri, Yo, Amfifisina I e Amfifisina II sono fissate su posizioni prestabilite su una<br />
membrana di nitrocellulosa; inoltre anticorpi antii-<strong>IgG</strong> umane sono fissati sulla membrana come<br />
controllo funzionale.<br />
Il campione prediluito è pipettato sulla membrana di supporto su cui sono fissati gli antigeni. Nel corso<br />
della prima incubazione gli autoanticorpi presenti nel campione del paziente si legano secondo la loro<br />
specificità agli antigeni.Nel passaggio successivo i componenti del campione non legati sono eliminati<br />
col lavaggio. Durante il periodo di incubazione seguente gli immunocomplessi legati vengono marcati<br />
con anticorpi anti-<strong>IgG</strong> umane, coniugati con fosfatasi alcalina. L’eccesso di coniugato è rimosso con il<br />
lavaggio delle strisce. Infine aggiungendo una soluzione di substrato incolore (BCIP), gli<br />
immunocomplessi vengono visualizzati, con la formazione di una banda di precipitato blu.<br />
Confrontando con le bande di riferimento sul foglio di valutazione gli autoanticorpi presenti nei<br />
campioni vengono identificati.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 18 -<br />
Esecuzione del test<br />
Important notes:<br />
Non mescolare componenti di lotti e dosaggi differenti.<br />
Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza.<br />
Tutti i componenti devono essere portati a temperatura ambiente (18 – 28°C) prima dell’ uso.<br />
Diluire I concentrati almeno 30 minuti prima dell’ uso Mescolare bene, evitando la formazione di<br />
schiuma.<br />
Per evitare contaminazione da trascinamento aspirare i liquidi con cura, particolarmente i liquidi<br />
contenenti il campione!<br />
1. Diluire I campioni e i controlli 1:20 con<br />
tampone lavaggio (ad es. pipettare 10 µL<br />
di campione + 190 µL di tampone);<br />
mescolare bene.<br />
2. Usando le pinzette, collocare il numero di<br />
strisce richiesto nel contenitore per<br />
reazione (l’etichettatura deve apparire<br />
verso l’alto).<br />
3. Ricoprire le strisce con 1.000 µL tampone<br />
lavaggio e incubare per 5 minuti a<br />
temperatura ambiente (18-28 °C) su un<br />
agitatore. Non aspirare; il tampone<br />
rimane nelle cellette!<br />
Zona di<br />
Aspirazione<br />
Camera di reazione<br />
Aggiunta reattivi<br />
4. Aggiungere 10 µL di siero/plasma del paziente prediluito e i controlli prediluito (oppure 50 µL di<br />
liquido cerebrospinale non diluito) ed incubare per 90 minuti su agitatore.<br />
5. Aspirare e lavare le strisce con 1.000 µL tampone lavaggio. Mescolare e aspirare con molta<br />
cura.<br />
6. Aggiungere 1.000 µL di tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare il tampone lavaggio.<br />
Ripetere questo lavaggio per una volta.<br />
7. Pipettare 1.000 µL di soluzione Coniugato e incubare per 60 minuti su agitatore.<br />
8. Aspirare e lavare le strisce con 1.000 µL tampone lavaggio. Mescolare e aspirare con molta<br />
cura.<br />
9. Aggiungere 1.000 µL tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare il liquido. Ripetere<br />
questo lavaggio per una volta.<br />
10. Pipettare 1.000 µL soluzione Substrato e incubare 5-15 minuti su agitatore. Controllaree dopo<br />
circa 5 minuti lo sviluppo del colore. La linea del controllo funzionale deve essere chiaramente<br />
visibile in tutte le strisce. In particolare il controllo positivo deve presentare cinque bande ben<br />
visibili.<br />
11. Aspirare la Soluzione Substrato e lavare due volte con 1.000 µL di acqua distillata.<br />
12. Rimuovere le strisce dal contenitore usando le pinzette. Asciugare con aria calda su carta<br />
assorbente per circa 30 minuti.<br />
13. Interpretare le bande presenti confrontandole con il foglio di valutazione fornito col kit.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 19 -<br />
Interpretazione dei Risultati<br />
Dopo che le strisce sono completamente asciugate, le stesse vengono posizionate sul foglio di<br />
valutazione a partire dalla posizione del controllo di funzionamento (v. esempio di interpretazione) con<br />
i numeri in cima alla parte terminale della striscia fissata con pellicola adesiva. La posizione delle<br />
bande degli antigeni può variare leggermente da lotto a lotto, ma le stesse si trovano sempre in<br />
corrispondenza della posizione indicata sul foglio di valutazione. La colorazione blu delle bande tende<br />
a sbiadire se le strisce asciutte sono esposte all’aria e alla luce per un periodo prolungato.<br />
M: posizione delle bande di antigeni.<br />
1. controllo negativo.<br />
2. controllo positivo.<br />
3. controllo cut-off<br />
4-8. sieri dei pazienti.<br />
Antigeni M 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
Amfifisina I<br />
Amfifisina II<br />
Yo<br />
Ri<br />
HuD<br />
Controllo funzionale<br />
I risultati si ottengono confrontando la posizione e l'intensità del colore delle bande del campione con<br />
quelle del controllo "cut-off" fornito con la confezione.<br />
Risultati positivi<br />
Risultati negativi<br />
Solo campioni con una intensità di colore più<br />
elevata del controllo cut-off sono chiaramente<br />
positivi all'anticorpo.<br />
In caso di assenza di bande o intensità di colore<br />
molto debole (più debole del controllo cut-off) il<br />
risultato è da considerarsi negativo.<br />
In linea di principio, i risultati di questo immuno dot blot dovrebbero essere tenuti in considerazione<br />
per una diagnosi solo insieme ad un quadro clinico ed altri dati diagnostici ed epidemiologici.<br />
Controllo di qualità<br />
Il controllo di funzionalità su ciascuna striscia (controllo di reazione interno) deve mostrare un colore<br />
intenso. Il controllo negativo deve mostrare solamente la banda di controllo interno; in casi molto rari<br />
possono essere osservate bande molto deboli, senza nessun valore.<br />
Il controllo positivo deve presentare sempre una colorazione intensa per i cinque antigeni (Yo, Ri, Hu-<br />
D e Amfifisina I/II); altrimenti il test deve essere ripetuto.<br />
Caratteristiche del test<br />
Campione:<br />
Tempo di esecuzione:<br />
Specificità:<br />
siero, plasma, liquido cerebrospinale<br />
3,5 ore<br />
il test eseguito su 100 donatori sani non ha dato alcun risultato positivo<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 20 -<br />
M etodica breve: O nconeural <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
(quantità espresse in µL)<br />
Operazioni Soluzioni Campione Controllo<br />
negativo/positivo/cut-off<br />
Pipettare sulle strisce Tampone lavaggio 1000 1000<br />
Incubare per 5 min. a temperatura<br />
ambiente (TA) su un agitatore, non<br />
aspirare le soluzioni!<br />
Aggiungere Controllo prediluito - 10<br />
Aggiungere<br />
Incubare per 90 min. a TA su un<br />
agitatore<br />
Aspirare il liquido. Lavare le strisce con<br />
1000 µl di tampone lavaggio , mescolare<br />
delicatamente e aspirare di nuovo<br />
Aggiungere 1000 µl tampone lavaggio ad<br />
ogni striscia e incubare per 5 min. su un<br />
agitatore.<br />
Ripetere una seconda volta<br />
Campione<br />
prediluito<br />
(CSF non diluito )<br />
Aggiungere Coniugato 1000 1000<br />
Incubare per 60 min. a TA su un<br />
agitatore<br />
Aspirare. Lavare con 1000 µl di tampone<br />
lavaggio. Mescolare delicatamente.<br />
Aspirare ancora<br />
Aggiungere 1000 µl di tampone lavaggio<br />
incubare per 5 min. a TA su un agitatore.<br />
Ripetere una seconda volta<br />
Aggiungere<br />
Incubare per 5-15 min. a TA e su un<br />
agitatore<br />
Vuotare e lavare due volte con 1000 µl di<br />
acqua distillata<br />
Rimuovere le strisce con una pinzetta e<br />
lasciarle asciugare su carta da filtro per<br />
almeno 30 min.<br />
Confrontare le bande ottenute con il<br />
foglio di valutazione<br />
Soluzione<br />
Substrato<br />
10<br />
(50)<br />
1000 1000<br />
-<br />
Per una descrizione dettagliata della procedura vedi anche alle pagine 18.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 21 -<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural HuD, Ri, Yo<br />
and Amphiphysin I/II specific <strong>IgG</strong> autoantibodies<br />
English: Page 1-8<br />
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-, Ri-,<br />
Yo- und Amphiphysin I/II-spezifischen <strong>IgG</strong> Autoantikörpern<br />
Deutsch: Seite 9-14<br />
Dot Blot per the la determinazione qualitativa di autoanticorpi<br />
<strong>IgG</strong> onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina I/II<br />
Italiano: Pagine 15-20<br />
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps<br />
(<strong>IgG</strong>) anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine I/II<br />
Français : Page 21-28<br />
REF:<br />
<strong>MKONA</strong> 1 (Z)<br />
24 (8)<br />
Privates Institut für Immunologie<br />
und Molekulargenetik <strong>GmbH</strong><br />
Kriegsstraße 99<br />
D-76133 Karlsruhe, Germany<br />
Distribution/Service:<br />
Vertrieb/Service:<br />
Distribuzione/Assistenza:<br />
Distribution/Service:<br />
<strong>Milenia</strong> <strong>Biotec</strong> <strong>GmbH</strong><br />
Hohe Straße 4-8<br />
D-61231 Bad Nauheim, Germany<br />
Tel.: +49-(0)6032-8040-0<br />
Fax: +49-(0)6032-8040-80<br />
E-Mail: info@milenia-biotec.de<br />
Distribution/Service:<br />
http://www.milenia-biotec.de<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 22 -<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 23 -<br />
Contenu du kit, stockage et stabilité<br />
Composants Cat.-No. Quantité Préparation Conservation Durée de vie<br />
Bandelettes Dotblot ONA<br />
(ONA Dotblot Strips),<br />
Bandelettes de nitrocellulose<br />
coatées avec des antigènes<br />
onconeuraux recombinants HuD,<br />
Ri, Yo et Amphiphysine<br />
Sérum de contrôle ONA<br />
(ONA Control Serum),<br />
contrôle négatif<br />
contrôle positif<br />
contrôle valeur seuil<br />
Conjugué enzymatique ONA<br />
(ONA Enzyme Conjugate),<br />
Anticorps polyclonal (de chèvre)<br />
anti-<strong>IgG</strong> humaines, marqué à la<br />
phosphatase alcaline<br />
Solution de lavage ONA<br />
(ONA Buffered Wash Solution),<br />
Concentrée (5x)<br />
Solution de substrat<br />
(Substrate Solution),<br />
Substrat : 5-Bromo-4-chloro-3-<br />
indolyl phosphate and 4-Nitrobluetetrazoliumchloride<br />
MONADS 24 (8) Prêt à l’emploi 2 - 8 °C<br />
Protéger des<br />
moisissures !<br />
Stocker avec du<br />
dessicant !<br />
Ne pas toucher<br />
avec les doigts!<br />
MONAC1/2/3<br />
3 flacons de<br />
50 µl<br />
MEONA 2 (1)<br />
flacon(s)<br />
à 15 ml<br />
MWBONA<br />
1 flacon<br />
50 ml<br />
MSONA 2 (1)<br />
flacon(s)<br />
à 15 ml<br />
Plateau d’incubation MONAP 3 (1)<br />
Fiche d’évaluation ONAA 1 (1)<br />
Prédilution !<br />
dilution 1:20 avec<br />
la solution de<br />
lavage 1x<br />
Voire date de<br />
péremption<br />
2 – 8 °C 30 jours après<br />
ouverture ou<br />
jusqu'à la date<br />
de péremption<br />
Prêt à l’emploi 2 - 8 °C 30 jours après<br />
ouverture ou<br />
jusqu'à la date<br />
de péremption<br />
Diluer avant<br />
usage : 10 ml de<br />
solution de lavage<br />
concentrée dans<br />
40 ml d’eau<br />
distillée<br />
Prêt à l’emploi 2 - 8 °C<br />
Protéger de la<br />
lumière !<br />
2 - 8 °C 30 jours après<br />
ouverture, 5<br />
jours après<br />
dilution<br />
30 jours après<br />
ouverture ou<br />
jusqu'à la date<br />
de péremption<br />
Les fiches de sécurité sont disponibles sur demande (voir également sur www.milenia-biotec.de).<br />
M atériel requis<br />
Agitateur horizontal<br />
Vortex<br />
Eau distillée<br />
Eprouvette graduée de 250 ml; flacon pour stocker la solution de lavage<br />
Pipettes de 10, 50 et 1000 µl<br />
Tubes à essais pour la prédilution des échantillons<br />
optionnel: automate de western-blot<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 24 -<br />
Echantillon et Préparation<br />
Le sérum, le plasma (sous EDTA, citrate, héparine) et le liquide cérébrospinal (CSF) peuvent être<br />
employés pour ce test. Tous les échantillons de sérum et de plasma doivent être prédilués au 1:20<br />
avec la solution de lavage; ex: 10 µl d’échantillon mélangé à 190 µl de solution de lavage. Le CSF<br />
peut être utilisé sans dilution. À la fin de la réalisation du test la dilution finale de l´échantillon est<br />
1:2000.<br />
Pendant le transport, les échantillons peuvent être stockés à température ambiante pendant 24<br />
heures. Pour le stockage à court terme (5 jours maximum), les échantillons peuvent être conservés à<br />
2-8°C. Pour une conservation à plus long terme, aliquotez les échantillons et congelez les à < -18°C.<br />
Evitez des cycles de congélation / décongélation répétitifs.<br />
Avertissem ent et précautions d’em ploi<br />
Tous les réactifs de ce kit sont strictement réservés à un usage de diagnostic in vitro. Le personnel<br />
doit être formé et exercer les bonnes pratiques de laboratoire nécessaires au diagnostic in vitro.<br />
Respecter rigoureusement l'ordre des étapes de pipetage du protocole.<br />
Les réactifs du kit doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les échantillons issus de<br />
groupes de patients à risque doivent être identifiés et manipulés sous hotte à flux laminaire.<br />
M éthode et Principe du test<br />
Le test <strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> est un immuno-test dot blot pour la détection qualitative des<br />
auto-anticorps humains <strong>IgG</strong> anti antigènes neuronaux, HuD, Ri, Yo et Amphiphysine. Des protéines<br />
humaines recombinantes HuD, Ri, Yo, et Amphiphysine I e Amphyphisine II sont fixées sur une<br />
membrane de nitrocellulose. Des anticorps anti <strong>IgG</strong> humaines sont également fixés sur la membrane<br />
et servent de contrôle interne.<br />
L'échantillon prédilué est déposé à la pipette sur la membrane porteuse des antigènes. Pendant la<br />
première période d'incubation (90 minutes) les auto-anticorps présents dans l’échantillon du patient se<br />
fixent à leur antigène spécifique. Le lavage permet d’éliminer les éléments non liés. Un conjugué anti-<br />
<strong>IgG</strong> humaines couplé à de la phosphatase alcaline est ajouté et se fixe sur les immunocomplexes liés<br />
à la membrane. L'excédent de conjugué est éliminé par le lavage. En phase finale, les<br />
immunocomplexes sont visualisés par l'addition d’un substrat incolore (BCIP) qui forme un précipité<br />
bleu en leur présence. Les types d'anticorps présents dans l'échantillon sont alors identifiés en<br />
comparant leur position aux bandes de référence sur la fiche d'évaluation.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 25 -<br />
Réalisation du test<br />
Important :<br />
Ne pas échanger les composants de différents lots.<br />
Ne pas utiliser après la date de péremption.<br />
Tous les composants doivent être à température ambiante (18 – 28 °C) avant usage.<br />
Diluer les concentrés moins de 30 minutes avant usage. Bien mélanger, mais éviter la formation de<br />
mousse.<br />
Pipeter soigneusement pour éviter les contaminations par transfert !<br />
1. Diluer les échantillons et les contrôles au<br />
1:20 avec la solution de lavage (ex: ajouter<br />
10 µl d’échantillon à 190 µl de solution de<br />
lavage); mélanger.<br />
2. En utilisant des pincettes, placer le nombre<br />
requis de bandelettes sur le plateau d’incubation<br />
(marquage vers le haut).<br />
3. Recouvrir les bandelettes de 1000 µl de solution<br />
de lavage et incuber 5 minutes à température<br />
ambiante (18-28°C) sous agitation. Ne pas<br />
aspirer, la solution de lavage reste dans les<br />
barquettes !<br />
Réservoir<br />
Aspirer<br />
Chambre d´incubation<br />
Adjonction de réactifs<br />
4. Ajouter 10 µl d’échantillon prédilué (sérum/plasma) ainsi que les contrôles positif et négatif<br />
prédilués (remarque: ou 50 µl de liquide cérébrospinal non dilué) et incuber 90 minutes sous<br />
agitation.<br />
5. Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger et<br />
aspirer soigneusement.<br />
6. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la solution de lavage.<br />
Répéter l’opération de lavage encore une fois.<br />
7. Ajouter 1000 µl de conjugué et incuber 60 minutes sous agitation.<br />
8. Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger et<br />
aspirer soigneusement.<br />
9. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la solution de lavage.<br />
Répéter l’opération de lavage encore une fois.<br />
10. Ajouter 1000 µl de substrat et incuber 5-15 minutes sous agitation. Vérifier le développement<br />
de la couleur après 5 minutes. Le contrôle interne doit être clairement visible sur chaque<br />
bandelette. La bandelette contrôle positif doit présenter 5 lignes colorées nettement visibles.<br />
11. Aspirer le substrat et laver deux fois avec 1000 µl d’eau distillée.<br />
12. Retirer les bandelettes du portoir en utilisant des pincettes. Laisser sécher à l’air sur du papier<br />
absorbant pendant 30 minutes.<br />
13. Interpréter le profil des bandelettes en vous référant à la fiche d’évaluation fournie avec le kit.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 26 -<br />
Interprétation des Résultats<br />
Après séchage complet, placer les bandelettes sur une feuille, numérotation vers le haut, en alignant<br />
le contrôle interne. Fixer les extrémités des bandelettes avec du ruban adhésif (voir l'exemple<br />
d'interprétation). La position des bandes d'antigène peut légèrement varier d’un lot à l’autre, mais elles<br />
sont toujours comprises entre les marques indiquées par la fiche d'évaluation. La couleur bleue des<br />
bandes d'antigènes peut pâlir si les bandelettes sont exposées trop longtemps à l'air et à la lumière.<br />
M: Marqueur de position pour les antigènes.<br />
1. contrôle négatif.<br />
2. contrôle positif.<br />
3. contrôle valeur seuil<br />
4-8. exemples de sérums de patient.<br />
Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
Amphiphysine I<br />
Amphiphysine II<br />
Yo<br />
Ri<br />
HuD<br />
Contrôle interne<br />
Les résultats du test sont interprétés en comparant les localisations et les intensités de couleur des<br />
bandes à celles du contrôle valeur seuil fourni avec le kit.<br />
Résultat positif<br />
Seuls les échantillons ayant une intensité plus<br />
forte que celle du signal obtenu avec le contrôle<br />
valeur seuil du kit sont clairement positifs.<br />
Résultat négatif<br />
Pas de coloration ou une coloration plus faible<br />
que le contrôle valeur seuil est interprétée<br />
comme un résultat négatif.<br />
Par principe, les résultats de cet immuno-dot blot doivent être interprétés uniquement en fonction de<br />
l’état clinique du patient et des autres données diagnostiques et épidémiologiques.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 27 -<br />
Contrôle Q ualité<br />
Le contrôle interne de chaque bande doit être de couleur intense. Le contrôle négatif doit seulement<br />
présenter une coloration au niveau du contrôle interne; dans de très rares cas des lignes d’intensité<br />
très faible peuvent être visibles, sans aucune incidence sur le résultat.<br />
Le contrôle positif doit toujours présenter des colorations intenses pour les cinq antigènes (Yo, Ri, Hu-<br />
D et Amphiphysine I/II) et pour le contrôle interne, sinon le test ne peut être interprété.<br />
Caractéristiques du test<br />
Echantillons :<br />
Temps de manipulation :<br />
Spécificité :<br />
sérum, plasma, liquide cérébrospinal (CSF)<br />
3h 30 min.<br />
Sur 100 donneurs sains testés aucun n’est apparu positif.<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)
- 28 -<br />
Protocole court: O nconeural <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong><br />
(Tous les volumes sont donnés en µl)<br />
Etapes Solution Echantillon Contrôles<br />
négatif/positif/ valeur seuil<br />
Ajouter sur les bandelettes solution de lavage 1000 1000<br />
Incuber 5 min à température ambiante<br />
(18-28 °C) sous agitation;<br />
ne pas aspirer la solution!<br />
Ajouter<br />
Ajouter<br />
Incuber 90 min à température ambiante<br />
(RT) sous agitation<br />
Aspirer, laver les bandelettes avec 1000<br />
µl de solution de lavage, mélanger<br />
doucement et aspirer de nouveau.<br />
Ajouter 1000 µl de solution de lavage sur<br />
chaque bandelette et incuber 5 min à<br />
RT sous agitation; aspirer<br />
Répéter l’opération une fois<br />
Contrôles<br />
prédilués<br />
échantillons<br />
prédilués<br />
(CSF pur)<br />
- 10<br />
Ajouter Conjugué 1000 1000<br />
Incuber 60 min à RT sous agitation<br />
Aspirer; laver les bandelettes avec 1000<br />
µl de solution de lavage mélanger<br />
doucement et aspirer<br />
Ajouter 1000 µl de solution de lavage<br />
sur chaque bandelette et incuber 5 min à<br />
RT sous agitation; aspirer<br />
Répéter l’opération une fois<br />
Ajouter Substrat 1000 1000<br />
Incuber 5 – 15 min à RT sous agitation<br />
Aspirer et laver les bandelettes 2 fois<br />
avec 1000 µl d’eau distillée.<br />
Enlever les bandelettes avec des<br />
pincettes et sécher à l’air et sur papier<br />
absorbant 30 min<br />
Analyser le profil des bandelettes en<br />
utilisant la fiche d’évaluation<br />
Pour plus de détails voir page 25.<br />
10<br />
(50)<br />
-<br />
<strong>Onconeural</strong> <strong>Antigens</strong> <strong>IgG</strong> (<strong>MKONA</strong>)