Miglioramento della qualità igienico sanitaria del latte ... - Agricoltura
Miglioramento della qualità igienico sanitaria del latte ... - Agricoltura Miglioramento della qualità igienico sanitaria del latte ... - Agricoltura
. UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA - VITERBO DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI PROGRAMMA DI RICERCA AGRICOLA, AGROAMBIENTALE, AGROALIMENTARE E AGROINDUSTRIALE DEL LAZIO (PRAL) Area tematica 8.1: “Qualità della vita e gestione delle risorse del vivente” TITOLO DEL PROGETTO: “MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA’ IGIENICO SANITARIA DEL LATTE BUFALINO, OVINO E CAPRINO” (COD. 2003/57) RELAZIONE TECNICO-SCIENTIFICA FINALE Coordinamento: Prof. Bruno Ronchi (Dip. Di Produzioni Animali – Universita’ della Tuscia) - VITERBO 6 dicembre 2007 -
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.<br />
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA - VITERBO<br />
DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI<br />
PROGRAMMA DI RICERCA AGRICOLA, AGROAMBIENTALE,<br />
AGROALIMENTARE E AGROINDUSTRIALE DEL LAZIO (PRAL)<br />
Area tematica 8.1: “Qualità <strong><strong>del</strong>la</strong> vita e gestione <strong>del</strong>le risorse <strong>del</strong> vivente”<br />
TITOLO DEL PROGETTO:<br />
“MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA’ IGIENICO SANITARIA DEL LATTE<br />
BUFALINO, OVINO E CAPRINO”<br />
(COD. 2003/57)<br />
RELAZIONE TECNICO-SCIENTIFICA FINALE<br />
Coordinamento: Prof. Bruno Ronchi<br />
(Dip. Di Produzioni Animali – Universita’ <strong><strong>del</strong>la</strong> Tuscia)<br />
- VITERBO 6 dicembre 2007 -
INDICE<br />
1. PREMESSE ......................................................................................................................... 3<br />
2. VALUTAZIONE DELLO STATO IGIENICO SANITARIO DELLA MAMMELLA E<br />
CARATTERISTICHE REOLOGICHE DEL LATTE OVINO E CAPRINO ........................................... 4<br />
2.1. Introduzione ...................................................................................................... 4<br />
2.2. Studio epidemiologico: contenuto in cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di massa<br />
ovino e caprino ................................................................................................... 5<br />
2.2.1. PREMESSE .................................................................................................................. 5<br />
2.2.2. MATERIALI E METODI .................................................................................................. 7<br />
2.2.3. RISULTATI .................................................................................................................. 7<br />
2.2.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 10<br />
2.3. Studio sperimentale: qualità <strong>igienico</strong> <strong>sanitaria</strong> <strong>del</strong> <strong>latte</strong> caprino ........................... 11<br />
2.3.1. PREMESSE ................................................................................................................ 11<br />
2.3.2. MATERIALI E METODI ................................................................................................ 11<br />
2.3.3. RISULTATI ................................................................................................................ 14<br />
2.3.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 21<br />
2.4. Studio sperimentale: qualità <strong>igienico</strong> <strong>sanitaria</strong> <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino .............................. 22<br />
2.4.1. PREMESSE ................................................................................................................ 22<br />
2.4.2. MATERIALI E METODI ................................................................................................ 22<br />
2.4.3. RISULTATI ................................................................................................................ 23<br />
2.4.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 32<br />
3. ANALISI DELLE FRAZIONI CASEINICHE DEL LATTE OVINO .................................................. 33<br />
4.1. Premesse ......................................................................................................... 33<br />
4.1.1. Il <strong>latte</strong> ovino .............................................................................................................. 33<br />
4.1.2. Metodi cromatografici per l’analisi <strong>del</strong>le proteine <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ............................................... 36<br />
4.2. Materiali e metodi ............................................................................................ 37<br />
4.2.2. Campionamento ........................................................................................................ 37<br />
4.2.3. Metodo RP-HPLC per le caseine <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora ......................................................... 37<br />
4.2.4 Metodo per la produzione <strong><strong>del</strong>la</strong> γ-caseina ...................................................................... 40<br />
4.3. Risultati e discussioni ........................................................................................ 41<br />
4. VALUTAZIONE DELLA QUALITA’ DEL LATTE DI BUFALA ....................................................... 52<br />
3.1. Messa a punto conta differenziata cellule somatiche ........................................... 52<br />
3.1.1. Metodo conta differenziata cellule somatiche ................................................................. 52<br />
3.2. Analisi di qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino ..................................................................... 56<br />
3.2.1. Materiali e metodi ...................................................................................................... 56<br />
3.2.2. Risultati .................................................................................................................... 57<br />
3.2.3. Conclusioni ................................................................................................................ 67<br />
3.3. Analisi genetica ................................................................................................ 67<br />
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ............................................................................................. 75
1. PREMESSE<br />
Il presente elaborato costituisce relazione finale <strong>del</strong> programma di ricerca denominato<br />
“MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA’ IGIENICO SANITARIA DEL LATTE BUFALINO, OVINO<br />
E CAPRINO” e riporta nel dettaglio, per ogni unità operativa, i risultati ottenuti durante<br />
l’implementazione <strong>del</strong> programma idi cerca.<br />
Conformente ai presupposti proggettuali ed ai possibili risultati, in termini di vantaggi per<br />
gli operatori <strong>del</strong> sistema agricolo laziale e per la collettività, da ottenersi mediante<br />
l’attuazione <strong>del</strong> programma medesimo, le azioni elencate nel seguito, ed i risultati ottenuti,<br />
sono stati inquadrati al fine di:<br />
- mettere a punto metodiche analitiche ed ottimizzare gli strumenti utilizzati presso i<br />
laboratori per la determinazione <strong>del</strong>le cellule somatiche per l’ottenimento di risultati di<br />
prova accurati nell’applicazione al settore <strong>del</strong>l’allevamento ovi-caprino;<br />
- individuare parametri che permettono di effettuare una diagnosi accurata <strong>del</strong>lo stato<br />
sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella al fine di ridurre l’incidenza <strong><strong>del</strong>la</strong> mastite nelle specie animali<br />
considerate e di mettere in atto interventi appropriati con l’utilizzazione mirata e<br />
limitata di farmaci;<br />
- fornire dati di tipo genetico utili per avviare piani di selezione al fine di migliorare le<br />
capacità d’adattamento <strong>del</strong> bestiame allevato e ridurre l’impiego di trattamenti<br />
terapeutici, anche per le esigenze <strong>del</strong>l’allevamento di tipo biologico.<br />
Nel complesso, lo studio ed i relativi risultati nel seguito descrittI, potranno consentire il<br />
miglioramento <strong><strong>del</strong>la</strong> sostenibilità economica dei sistemi di allevamento di grande interesse<br />
per la Regione Lazio quali quelli <strong>del</strong> bufalo, <strong><strong>del</strong>la</strong> pecora e <strong><strong>del</strong>la</strong> capra, oltre che <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
qualità <strong>igienico</strong>-<strong>sanitaria</strong> <strong>del</strong> <strong>latte</strong> prodotto e destinato ai diversi tipi di trasformazione.<br />
3
2. VALUTAZIONE DELLO STATO IGIENICO SANITARIO DELLA<br />
MAMMELLA E CARATTERISTICHE REOLOGICHE DEL LATTE OVINO<br />
E CAPRINO<br />
2.1. Introduzione<br />
Il parametro cellule somatiche rappresenta uno dei sistemi di valutazione qualitativa <strong>del</strong><br />
prodotto <strong>latte</strong>, sebbene per quel che riguarda il comparto ovi-caprino, attualmente, non<br />
esista un livello di cellule somatiche con valenza di requisito. Il contenuto in cellule<br />
somatiche (CCS) nel <strong>latte</strong> di massa dei piccoli ruminanti frequentemente è superiore a<br />
10 6 /ml, come evidenziato in un recente volto alla definizione <strong>del</strong> valore soglia nazionale di<br />
cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di massa caprino e ovino (Rosati et al., 2004). Le mastiti<br />
subcliniche rappresentano il principale fattore di incremento <strong>del</strong> CCS e sono sostenute<br />
prevalentemente da Stafilococchi Coagulasi Negativi (SCN), Streptococcus spp. (non<br />
emolitici, S. uberis), Enterococcus spp., Escherichia coli ed altri enterobatteri quali<br />
Corynebacterium spp., Mannheimia haemolytica e Pseudomonas spp. Una modesta<br />
percentuale dei patogeni isolati da casi di mastite subclinica è rappresentata da<br />
Staphylococcus aureus, che ha rilevanza per la sicurezza alimentare essendo responsabile<br />
di forme di tossinfezione alimentare.<br />
La risposta cellulare nelle mastiti subcliniche dei piccoli ruminanti è più intensa rispetto al<br />
bovino, soprattutto nelle infezioni da SCN, con valori prossimi a 1,5 . 10 6 /ml. Nella pecora, il<br />
CCS è un efficace parametro di valutazione <strong>del</strong>lo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella. Nella<br />
capra la causa principale di variazione <strong>del</strong> CCS è rappresentata dalle infezioni<br />
intramammarie, sebbene sia riconosciuto che variazioni riconducibili anche a fattori<br />
fisiologici, incidono sulla sua efficienza quale indicatore sanitario. In generale, l’efficacia<br />
<strong>del</strong> CCS quale parametro diagnostico è spesso in discussione anche per le possibili<br />
difficoltà applicative.<br />
La relazione che segue esporrà i risultati ottenuti relativi all’attività svolta dal Centro Latte<br />
<strong>del</strong>l’IZS nell’ambito <strong>del</strong> progetto di ricerca “miglioramento <strong><strong>del</strong>la</strong> qualità <strong>igienico</strong>-<strong>sanitaria</strong><br />
<strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino, ovino e caprino”. Parte <strong>del</strong>l’attività, secondo gli obiettivi generali <strong>del</strong><br />
piano, è stata svolta in collaborazione con il Dipartimento di Produzioni Animali <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
Facoltà di Agraria <strong>del</strong>l’Universitò degli Studi <strong><strong>del</strong>la</strong> Tuscia di Viterbo.<br />
4
Il progetto di ricerca è stato articolato in una parte epidemiologica e una parte<br />
sperimentale.<br />
Lo studio epidemiologico è stato condotto su 400 allevamenti ovini da <strong>latte</strong> e 35<br />
allevamenti caprini da <strong>latte</strong> distribuiti nelle province di Latina, Frosinone, Roma, Rieti e<br />
Viterbo con l’obiettivo di determinare il contenuto in cellule somatiche (CCS) nel di <strong>latte</strong><br />
massa.<br />
Lo studio sperimentale è stato realizzato in due allevamenti, uno di pecore da <strong>latte</strong> ed un<br />
altro di capre da <strong>latte</strong>, con l’obiettivo di valutare i seguenti aspetti:<br />
• Individuazione degli indicatori idonei a diagnosticare precocemente le mastiti nella<br />
pecora e nella capra.<br />
• Valutazione dei parametri produttivi e <strong>del</strong>le caratteristiche chimico-fisiche e<br />
tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino e caprino in relazione al contenuto in cellule somatiche.<br />
• Studio <strong>del</strong>le relazioni esistenti tra il contenuto in cellule somatiche e lo stato sanitario<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> ghiandola mammaria.<br />
• Caratterizzazione <strong>del</strong>le cellule somatiche (per la specie caprina).<br />
• Definizione di valori di riferimento di cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di capra e di pecora.<br />
2.2. Studio epidemiologico: contenuto in cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di<br />
massa ovino e caprino<br />
2.2.1. PREMESSE<br />
La Direttiva CE 92/46, normativa verticale comunitaria, indicava i limiti per i parametri<br />
chimico-fisici e <strong>igienico</strong>-sanitari, per il <strong>latte</strong> crudo <strong>del</strong>le specie bovina, ovina, caprina e<br />
bufalina. Tale norma, recepita in Italia con il D.P.R. n° 54 <strong>del</strong> 14 gennaio 1997<br />
“Regolamento recante attuazione <strong>del</strong>le Direttive 92/46 e 92/47/CEE in materia di<br />
produzione e immissione sul mercato di <strong>latte</strong> e di prodotti a base di <strong>latte</strong>”, tuttavia non<br />
individua alcun valore soglia per il contenuto in cellule somatiche per il prodotto da<br />
pecore, capre e bufale e destinato al consumo umano.<br />
5
La Direttiva CE 92/46 prevedeva che le norme riguardanti il contenuto in cellule<br />
somatiche, nel <strong>latte</strong> ovino e caprino, sarebbero state fissate a partire dal 1° gennaio <strong>del</strong><br />
1998 mediante studi tendenti ad individuare il valore soglia nel <strong>latte</strong> crudo di massa.<br />
Il Comitato Scientifico <strong>del</strong> Simposio Internazionale “Cellule somatiche e qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> dei<br />
piccoli ruminanti”, tenutosi nel 1994 a Bella (Pz), ha proposto come obiettivo a termine, un<br />
valore soglia unico per i piccoli ruminanti pari a 1.500.000 cell./ml. Gli studi condotti nel<br />
nostro Paese sono stati effettuati su realtà territorialmente definite, che proprio per<br />
l’estrema variabilità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> sotto il profilo <strong>del</strong> contenuto in cellule somatiche, hanno<br />
portato fino ad oggi ad individuare valori di riferimento molto eterogenei.<br />
Caria et al. (2000) hanno condotto alcuni studi regionali per individuare il contenuto medio<br />
in cellule somatiche nel <strong>latte</strong> ovino di massa; nella tabella che segue (Tab. 1) vengono<br />
riportati i risultati di quel lavoro.<br />
Tabella 1 - Valori medi <strong>del</strong> contenuto in cellule somatiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino di<br />
massa in alcune regioni italiane. Da: Caria et al., 2000<br />
REGIONE<br />
CELLULE SOMATICHE (cell./ml)<br />
Sardegna 1.700.000<br />
Lazio 1.000.000<br />
Toscana 1.700.000<br />
Sicilia 1.655.000<br />
Marche 1.463.000<br />
Basilicata 945.000<br />
Calabria 1.235.000<br />
Per la valutazione <strong>del</strong>le cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di capra, Aleandri et al. (1993) e Rosati<br />
et al. (1995; 1998), in riferimento a studi condotti su allevamenti intensivi di capre di razza<br />
Saanen ed Alpine, hanno dimostrato l’importanza dei fattori di allevamento nell’incremento<br />
<strong>del</strong>le cellule somatiche.<br />
Con un progetto di ricerca (Rosati et al., 2000) a cui hanno partecipato le regioni Lazio,<br />
Toscana, Sicilia e Sardegna, territori nei quali viene allevato oltre l’80% <strong>del</strong> patrimonio<br />
6
ovino nazionale (FAOSTAT, 2003), è stato determinato il valore medio <strong>del</strong>le cellule<br />
somatiche nel campione di <strong>latte</strong> di massa che è risultato pari a 1.389.000 cell./ml come<br />
media aritmetica e a 1.133.000 cell./ml come media geometrica.<br />
Nello stesso lavoro è stato anche determinato il valore discriminante <strong>del</strong>le cellule<br />
somatiche tra mammelle sane ed affette da mastite che è risultato di 265.000 cell./ml,<br />
molto più basso rispetto a valori riscontrati nei campioni <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di massa. Sulla scorta di<br />
tali informazioni, appare evidente quindi l’elevata diffusione <strong>del</strong>le mastiti negli allevamenti<br />
ovini, ed in particolare <strong>del</strong>le mastiti subcliniche, come dimostrato da numerosi studi a<br />
livello nazionale ed internazionale.<br />
2.2.2. MATERIALI E METODI<br />
Negli anni 2005-2006 sono stato monitorati campioni di <strong>latte</strong> di massa provenienti da 425<br />
allevamenti ovini e 5 allevamenti caprini dislocati nelle province di Roma, Viterbo e Latina.<br />
Durante il corso di due lattazioni sono stati analizzati in totale 2291 campioni di <strong>latte</strong> di<br />
massa ovino e 46 campioni di <strong>latte</strong> di massa caprino rappresentativi, in media, di 4<br />
mungiture.<br />
I campioni di <strong>latte</strong>, addizionati di Bronopol (0,03% nel <strong>latte</strong>), sono stati analizzati entro 24-<br />
36 ore dal prelievo per il contenuto in cellule somatiche mediante metodo opto-fluorometrico<br />
(Fossomatic 5000).<br />
2.2.3. RISULTATI<br />
Ovini<br />
Nel presente studio, durante il primo anno, il valore medio più basso è stato registrato ad<br />
aprile (1.557.000 cell./ml) mentre il valore massimo a giugno (1.933.000 cell./ml).<br />
Nel secondo anno tale parametro ha oscillato tra 1.318.000 cell./ml e 2.407.000 cell./ml,<br />
valori riscontrati rispettivamente nei mesi di novembre 2005 e settembre 2006 (Fig. 1).<br />
7
3000<br />
2500<br />
2280<br />
2407<br />
2000<br />
1788<br />
1653 1761 1557 1631 1933 1751<br />
1562<br />
1829<br />
1611 1676<br />
1861<br />
2117<br />
1500<br />
1000<br />
1502 1318<br />
1495<br />
1414 1318 1270 1252 1208<br />
1077<br />
1551<br />
1444 1349<br />
1200<br />
1098 1087<br />
1271 1288<br />
1365<br />
1568<br />
500<br />
0<br />
gen- feb- m apr- m<br />
05 05 ar- 05 ag-<br />
05 05<br />
giu- lug- . n dic- gen- feb- m<br />
05 05 ov- 05 06 06 ar-<br />
05<br />
06<br />
apr- m giu- lug- set- C.S. med. Arit.<br />
06 ag- 06 06 06<br />
C.S. med.geo.<br />
06<br />
Figura 1 - Andamento <strong>del</strong> valore medio <strong>del</strong>le cellule somatiche per il<br />
periodo 2005/2006<br />
Dividendo i campioni di <strong>latte</strong> in classi in base al contenuto in cellule somatiche (Fig. 2), il<br />
48,23% dei campioni è risultato compreso tra 501.000 cell./ml e 1.500.000 cell./ml e il<br />
30,25% si colloca nella classe oltre 2.000.000 cell./ml. Solo il 4,9% dei campioni ha fatto<br />
registrare valori inferiori a 500.000 cell./ml.<br />
40,00<br />
30,00<br />
20,00<br />
10,00<br />
0,00<br />
2000<br />
% camp. CS 4,89 22,96 25,27 16,67 30,25<br />
Figura 2. Distribuzione dei campioni di <strong>latte</strong> in base alle classi di<br />
contenuto in cellule somatiche nel periodo 2005/2006.<br />
Distribuendo il totale dei campioni, in base ai valori determinati per il <strong>latte</strong> di massa da<br />
Rosati et al. (2004) risulta che il 51,9% ed il 64,6% di questi, rispettivamente per la media<br />
aritmetica e per la media geometrica, supera questi limiti (Fig. 3).<br />
Considerando il totale dei campioni analizzati in tutto il periodo di studio, emerge un valore<br />
di cellule somatiche pari a 1,38 . 10 3 cel./ml, espresso come media geometrica, e di 1.718<br />
. 10 3 cell./ml, espresso come media aritmetica.<br />
8
%<br />
ca<br />
mp<br />
ion<br />
i<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
64,6<br />
48,1<br />
51,9<br />
35,4<br />
1133 1389<br />
Medie<br />
Figura 3. Distribuzione dei campioni in base ai valori medi di<br />
riferimento di cellule somatiche<br />
Caprini<br />
Per le cinque aziende oggetto di studio, è emersa una media geometrica pari a 1.508.000<br />
cell./ml e una media aritmetica pari a 1.745.000 cell./ml (Tab. 2).<br />
Tabella 2 - Valori medi di cellule somatiche per il <strong>latte</strong> carpino di massa <strong>del</strong>le aziende<br />
considerate (cell. x 10 3 /ml)<br />
N° aziende N° Campioni Media Geometrica M. Aritmetica ± D.S.<br />
5 46 1.508 1.745 ±988<br />
Nella Figura 4 è riportato l’andamento medio mensile <strong>del</strong>le cellule somatiche durante<br />
l’intera lattazione oggetto di studio. I valori più elevati si sono evidenziati all’inizio ed alla<br />
fine <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione rispettivamente con 2.367.000 cell./ml in gennaio e con 2.379.000<br />
cell./ml nel mese di settembre. Il valore più basso, pari a 1.150.000 cell./ml, si è registrato<br />
nel mese di luglio.<br />
9
Figura 4. Andamento medio mensile <strong>del</strong>le Cellule Somatiche<br />
Cellule Somatiche (x1000 /ml)<br />
2500<br />
2250<br />
2000<br />
1750<br />
1500<br />
1250<br />
1000<br />
750<br />
500<br />
250<br />
0<br />
2367<br />
2379<br />
1612 1728<br />
1341 1235<br />
1329<br />
1310 1150<br />
Gen Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Set<br />
Media Geom etrica<br />
Figura 4 - Andamento <strong>del</strong> valore medio (media geometrica) <strong>del</strong>le<br />
cellule somatiche nel <strong>latte</strong> caprino di massa per il periodo 2005/2006<br />
2.2.4. CONCLUSIONI<br />
Il valore medio <strong>del</strong> contenuto di cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di massa ovino è risultato pari<br />
a 1.380.000 cell./ml (media geometrica) e di 1.718.000 cell./ml (media aritmetica). In<br />
accordo con quanto asserito nella letteratura consultata, sono stati evidenziati valori più<br />
elevati di cellule somatiche nelle fasi iniziali ed in quelle finali <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione. Per quanto<br />
riguarda l’allevamento caprino, è stato ottenuto un valore medio di cellule somatiche nel<br />
<strong>latte</strong> di massa pari a 1.508.000 cell./ml, considerando la media geometrica, e 2.004.000<br />
cell./ml. espresso come media aritmetica. Anche per l’allevamento caprino nella fase<br />
iniziale e finale di lattazione si osserva un incremento <strong>del</strong> contenuto cellulare.<br />
Malgrado l’esiguità <strong>del</strong> campione considerato i valori ottenuti, sono risultati in linea con<br />
quanto altri precedenti lavori evidenziato. Il conteggio <strong>del</strong>le cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di<br />
massa rappresenta anche per i piccoli ruminanti un valido ausilio per la valutazione e il<br />
monitoraggio <strong>del</strong>lo stato sanitario <strong>del</strong> gregge.<br />
10
2.3. Studio sperimentale: qualità <strong>igienico</strong> <strong>sanitaria</strong> <strong>del</strong> <strong>latte</strong> caprino<br />
2.3.1. PREMESSE<br />
Le problematiche relative all’individuazione di un valore soglia di CCS nel <strong>latte</strong> di capra<br />
sono legate a diversi fattori non infettivi che contribuiscono a determinare un maggiore<br />
contenuto cellulare, fisiologico in questa specie, rispetto a quella bovina e ovina. La<br />
presenza di percentuali elevate di granulociti neutrofili polimorfonucleati nel <strong>latte</strong> di capra<br />
(45%-74%) suggerisce che la migrazione leucocitaria sia più sostenuta rispetto alle due<br />
specie di riferimento (2%-28%).<br />
La secrezione <strong>latte</strong>a nella capra è apocrina, e ciò conduce all’eliminazione nel <strong>latte</strong> di<br />
elevate quantità di particelle citoplasmatiche che costituiscono, sul piano qualitativo, la<br />
principale specificità citologica. Questo ha creato notevoli problemi di natura metodologica<br />
ed interpretativa <strong>del</strong> conteggio cellulare. Fattori di variazione non infettivi (stadio di<br />
lattazione, estro, vaccinazioni) causano ulteriori difficoltà nell’interpretazione corretta nel<br />
conteggio <strong>del</strong>le cellule somatiche.<br />
2.3.2. MATERIALI E METODI<br />
La prova sperimentale è stata realizzata presso un allevamento, sito in Provincia di<br />
Viterbo, di circa 70 capre di razza Saanen al loro primo anno di attività. Gli animali sono<br />
allevati con sistema intensivo a stabulazione fissa in strutture coperte in muratura.<br />
L’alimentazione è rappresentata da foraggi misti di produzione aziendale, concentrati<br />
(micronizzati misti, polpe di barbabietola, mangime composto integrato <strong>del</strong> commercio)<br />
integrazione minerale e vitaminica.<br />
Gli animali sono stati sottoposti con regolarità a interventi di profilassi vaccinale e<br />
antiparassitaria raccomandati per tale sistema di allevamento. La mungitura, eseguita due<br />
volte al giorno, è di tipo meccanico con impianto lineare a 12 posti a linea bassa;<br />
l’impianto è controllato con regolarità dai tecnici <strong>del</strong> settore. Al termine <strong>del</strong>le operazioni di<br />
mungitura la sala e l’impianto sono sottoposti a rigorose operazioni di pulizia e<br />
disinfezione.<br />
11
Per lo studio, sono stati selezionati 30 soggetti e monitorati da aprile a luglio. I prelievi di<br />
<strong>latte</strong> sono stati effettuati ogni tre settimane per un totale di 5 controlli. Per ogni soggetto<br />
sono stati prelevati campioni di <strong>latte</strong> di massa individuale e di emimammelle. Per i<br />
campioni di <strong>latte</strong> individuale sono stati determinati i seguenti parametri: produzione,<br />
grasso, proteine, lattosio, residuo magro (RM), urea, caseina, pH, °SH, cellule somatiche<br />
con metodo automatico e microscopico. Plasmina, plasminogeno e frazioni proteiche sono<br />
stati determinati dal Dipartimento di Produzioni Animali. Per i campioni di emimammelle<br />
sono stati eseguiti esami batteriologici per la ricerca di agenti mastidogeni e conteggio<br />
<strong>del</strong>le cellule somatiche con metodo automatico.<br />
Prelievo dei campioni<br />
Prima di procedere al prelievo ogni emimammella è stata pulita con garza sterile imbevuta<br />
di alcol etilico denaturato. Per i campioni di emimammelle, si è proceduto alla raccolta di<br />
circa 10 ml di <strong>latte</strong>, utilizzando contenitori sterili monouso, dopo l’eliminazione dei primi<br />
getti di <strong>latte</strong>. Per i campioni di <strong>latte</strong> individuale sono stati utilizzati lattoprelevatori e<br />
registrate le produzioni. I campioni prelevati sempre durante la mungitura <strong><strong>del</strong>la</strong> mattina,<br />
sono stati trasportati in laboratorio entro le 4 ore dalla raccolta in contenitori refrigerati.<br />
Esame batteriologico<br />
L’esame batteriologico è stato eseguito secondo quanto raccomandato dal National<br />
Mastitis Council (National Mastitis Council, 1987). Ciascun campione, in ragione di 10 µl , è<br />
stato seminato per strisciamento con ansa monouso calibrata su terreno Agar Sangue<br />
defibrinato sterile di montone al 5% (AS) e su terreno Edward’s medium modified (EMM).<br />
I terreni sono stati incubati a 37°C in aerobiosi con lettura <strong>del</strong>le piastre dopo 24 e 48 ore.<br />
Grasso, proteine, lattosio, caseina, urea e punto crioscopico<br />
La determinazione <strong>del</strong> contenuto di grasso, proteine, lattosio, caseina, urea, punto<br />
crioscopico è eseguita con Milko Scan FT 6000. Lo strumento usa un sistema infrarosso<br />
compatto a singolo raggio basato sulla tecnica FTIR (Fourier Transform Infrared<br />
Spectroscopy).<br />
12
Conteggio in automatico <strong>del</strong>le cellule somatiche<br />
Il conteggio <strong>del</strong>le cellule somatiche viene effettuato con Fossomatic 5000, mediante<br />
citometria di flusso. Le cellule somatiche, colorate con bromuro di etidio, sono inviate<br />
all’interno <strong><strong>del</strong>la</strong> cella di flusso e sottoposte ad eccitazione luminosa. La luce fluorescente<br />
emessa è registrata e trasformata in valore numerico per 1000ml.<br />
Attitudine alla coagulazione <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora e di capra<br />
Il metodo lattodinamografico (Annibaldi et al., 1977; Zannoni & Annibaldi, 1981) permette<br />
la determinazione <strong>del</strong>l’attitudine alla coagulazione presamica <strong>del</strong> <strong>latte</strong> intero crudo,<br />
mediante la determinazione di tre parametri lattodinamometrici che misurano: il tempo di<br />
coagulazione <strong>del</strong> <strong>latte</strong>, la velocità di formazione <strong>del</strong> coagulo, la consistenza <strong>del</strong> coagulo. I<br />
campioni di <strong>latte</strong> termostatati a 35 °C vengono addizionati di caglio (200µl <strong><strong>del</strong>la</strong> soluzione<br />
consigliata secondo la specie) e posti nel modulo di registrazione per un tempo di 30<br />
minuti. Come campione di riferimento è consigliato <strong>latte</strong> standard (FIL-IDF 110-87) come<br />
prova in bianco, per controllare il titolo <strong>del</strong> caglio e come riferimento nelle letture<br />
lattodinamografiche. La metodica permette la determinazione dei seguenti parametri:<br />
r: tempo di coagulazione o durata <strong><strong>del</strong>la</strong> reazione primaria tra presame e caseina,<br />
espresso in minuti primi, visualizzato in verticale fino all’aperture <strong><strong>del</strong>la</strong> forcella;<br />
k20: velocità di formazione <strong>del</strong> coagulo o tempo, espresso in minuti primi, che<br />
impiega la cagliata a raggiungere una resistenza meccanica tale da produrre uno<br />
spostamento di 20 mm. iniziare a misurare dall’apertura <strong><strong>del</strong>la</strong> forcella di 1 mm fino<br />
a quando la stessa apertura raggiunge i 20 mm;<br />
a30: consistenza <strong>del</strong> coagulo a 30 minuti, espresso in mm, come misura<br />
<strong>del</strong>l’ampiezza <strong><strong>del</strong>la</strong> forcella a 30 minuti dall’introduzione <strong>del</strong> caglio.<br />
Determinazione <strong>del</strong> numero di cellule somatiche per microscopia<br />
Il principio <strong>del</strong> metodo si basa sulla colorazione differenziale di una quantità prefissata di<br />
<strong>latte</strong> distesa su vetrino. Il film colorato con Pyronin-Y Methyl-Green è osservato mediante<br />
13
microscopio a 1000 ingrandimenti. Tale colorazione permette di distinguere le cellule<br />
somatiche dai frammenti citoplasmatici per la specificità <strong>del</strong> Verde- Metile nei confronti <strong>del</strong><br />
DNA cellulare.<br />
Il nucleo <strong>del</strong>le cellule somatiche appare di colore verde-bluastro, mentre i frammenti<br />
citoplasmatici assumono il colore rosso <strong><strong>del</strong>la</strong> Pyronin-Y. Nella lettura dei vetrini vanno<br />
contate solo le cellule con un nucleo colorato in verde-bluastro, ben identificabile e<br />
integro. Per i polimorfonucleati sono contate solo cellule che presentano due o più lobi.<br />
Per la parte di preparazione <strong>del</strong> vetrino, determinazione <strong>del</strong> campo microscopico, metodo<br />
di conteggio, calcolo <strong>del</strong> numero in cellule, si fa riferimento alla Gazzetta Ufficiale <strong>del</strong><br />
16/04/1992 n.90 – Attuazione <strong><strong>del</strong>la</strong> decisione n.91/180/CEE concernente la fissazione di<br />
metodi di analisi e prova relativi al <strong>latte</strong> crudo e al <strong>latte</strong> trattato termicamente-. Per quanto<br />
riguarda le modalità di colorazione e lettura microscopica si fa riferimento alla Food and<br />
Drug Administration : Direct Microscopic Somatic Cell Count (FDA 2400d).<br />
2.3.3. RISULTATI<br />
Caratterizzazione <strong>del</strong> contenuto in cellule somatiche mediante lettura microscopica<br />
Nella caratterizzazione <strong>del</strong> contenuto in cellule somatiche, i leucociti polimorfonucleati<br />
(PMN) rappresentano la componente maggiore in tutti i controlli, oscillando dal 73 all’85%<br />
(Tab. 3).<br />
Tabella 3 - Medie stimate <strong>del</strong>le componenti cellulari durante l’arco <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
sperimentazione.<br />
Controllo<br />
CCS<br />
x10³/ml<br />
PMN<br />
x10³/ml<br />
%<br />
Linf/macr<br />
x10³/ml<br />
% Residui<br />
Citoplasm.<br />
x10³/ml<br />
1° 381 304 79% 77 21% 407<br />
2° 423 360 85% 97 15% 713<br />
3° 567 434 76% 133 24% 1006<br />
4° 713 536 75% 90 25% 936<br />
5° 720 531 73% 189 27% 680<br />
Medie totali 556 433 77% 119 23% 745<br />
14
Considerazione le classi di ampiezza di CCS superiore ad 10 6 cell./ml e inferiore a<br />
10 6 cell./ml la percentuale di PMN tende ad aumentare nella classe di CCS maggiore a<br />
10 6 cell./ml. La presenza in quest’ultima classe di soggetti con infezioni intramammaria può<br />
spiegare questo incremento poiché nelle emimammelle infette si ha un notevole richiamo<br />
di PMN dal circolo ematico in sede mammaria. Conseguentemente la percentuale di<br />
linfociti e macrofagi, che in questo studio sono stati considerati globalmente, tendono a<br />
diminuire nella classe di CCS maggiore a 10 6 cell./ml.<br />
Tabella 4 - Medie stimate <strong>del</strong>le componenti cellulari suddivise nelle due classi<br />
di ampiezza (1.000.000)<br />
CCSc<br />
CCs<br />
x10³<br />
/ml<br />
PMF<br />
x10³<br />
/ml<br />
%<br />
Linf./macrof<br />
x10³/ml %<br />
Residui<br />
citoplasmatici<br />
x10³/ml<br />
%<br />
1.000.000<br />
1707 1436 84 21 16 909 53<br />
Dalla Tab. 4 si può osservare come i residui citoplasmatici (di colore fucsia)(Figura 5), che<br />
costituiscono una specificità fisiologica di questa specie, sono maggiormente presenti nella<br />
classe di CSS inferiore a 10 6 cell./ml. Infatti, in quest’ultima classe rappresentano circa il<br />
doppio <strong>del</strong> contenuto totale, mentre nella classe con CCS maggiori a 10 6 cell./ml<br />
costituiscono il 53%.<br />
Figura 4 - Caratterizzazione microscopica <strong>del</strong>le cellule somatiche<br />
<strong>del</strong> <strong>latte</strong> di capra(1000 x)<br />
15
Variazioni <strong>del</strong> contenuto cellulare in relazione allo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella<br />
Il contenuto medio di cellule somatiche (CCS) durante l’arco <strong><strong>del</strong>la</strong> sperimentazione ha<br />
mostrato un valore di 669.000 cell./ml, facendo registrare un aumento <strong>del</strong> CCS con<br />
l’avanzare <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione. L’esame batteriologico condotto sui campioni di emimammella<br />
ha evidenziato la presenza di S.aureus, S.coagulasi negativo e germi minori quali<br />
Aerococcus viridans, Enterococcus durans, Bacillus cereus, Streptococcus spp. non β-<br />
emolitico(fig.2). Gli SCN sono stati i microrganismi maggiormente isolati durante la<br />
sperimentazione.<br />
0,02<br />
0,22<br />
S.aureus<br />
S.coag.neg<br />
pat.minori<br />
sane<br />
0,03<br />
0,73<br />
Figura 5 - Prevalenza percentuale degli isolati batterici nel corso <strong><strong>del</strong>la</strong> prova<br />
Nella valutazione <strong>del</strong>le variazioni <strong>del</strong> CCS, sono state considerate le medie CCS divise per<br />
classi di animali:<br />
1) capra sana in assenza di isolamento batterico nel <strong>latte</strong> <strong>del</strong>le due emimammelle;<br />
2) capra infetta in caso di isolamento batterico in almeno una <strong>del</strong>le due emimammelle.<br />
Fra le capre infette sono state distinte, secondo l’origine <strong>del</strong>l’infezione:<br />
- le infezioni dovute a germi patogeni maggiori, S. aureus;<br />
16
- le infezioni dovute a stafilococchi coagulasi negativi (SCN);<br />
- le infezioni dovute a patogeni minori.<br />
Considerando i contenuti medi di cellule somatiche e gli isolamenti batteriologici sono state<br />
individuate tre diverse classi, distinte da un differente grado di infiammazione mammaria.<br />
contenuti cellulari medi in funzione <strong>del</strong>lo stato<br />
sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella<br />
3000<br />
2500<br />
2573<br />
x 1000 cell/ml<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
422 396<br />
615<br />
sane<br />
Patogeni minori<br />
SCN<br />
S.aureus<br />
0<br />
1<br />
Figura 5 - contenuti cellulari medi in funzione <strong>del</strong>lo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella di capra<br />
Nella prima classe (Fig. 5) che comprende soggetti sani e soggetti positivi a patogeni<br />
minori, i contenuti medi cellulari hanno fatto registrare valori al di sotto di 400.000<br />
cell./ml. Nella seconda classe, che comprende soggetti positivi a SCN, i contenuti medi<br />
cellulari sono stati più alti con un valore di 615.000 cell./ml. In ultimo, nella terza classe,<br />
che comprende gli animali positivi a S. aureus, sono stati osservati valori medi di CCS di<br />
2.573.000 cell./ml.<br />
La Tabella 5 mostra come i CCS in presenza di S. aureu si mantengono elevati con forti<br />
oscillazioni durante il periodo di studio. Le variazioni di CCS nella classe di animali sani e<br />
positivi a patogeni minori hanno mostrato contenuti bassi nel corso dei 5 controlli.<br />
17
Tabella 5 - Contenuti cellulari medi (x 10 3 ) in funzione <strong>del</strong>lo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
mammella nel tempo.<br />
Stato sanitario 1° 2° 3° 4° 5°<br />
Sane 327 269 411 936 170<br />
Patogeni minori 299 281 379 623 397<br />
SCN 365 704 464 645 896<br />
S. aureus 3560 1415 2329 3404 3158<br />
Caratteristiche chimico-fisiche e produzione <strong>del</strong> <strong>latte</strong> in funzione <strong>del</strong> contenuto in cellule<br />
somatiche<br />
Nella valutazione degli effetti <strong>del</strong> CCS sui parametri produttivi e quali-quantitativi <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
sono state considerate due classi di ampiezza di CCS: inferiore ad 1.000.000 cell./ml e<br />
superiore ad 1.000.000 cell./ml. Sono di seguito riportati i valori medi dei parametri<br />
misurati durante il periodo considerato.<br />
Tabella 6 - Medie stimate (± SE) di alcuni parametri chimico-fisici <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di tutto il periodo<br />
considerato<br />
Grasso % Proteine % Lattosio % Caseina % pH °SH/50 ml<br />
2,39 ± 0,055 2,59±0,016 4,42±0,02 2,08±0,024 6,72±0,008 2,78±0,042<br />
Influenza <strong>del</strong> CCS sulla produzione<br />
La produzione media di <strong>latte</strong> per capo relativa alla mungitura <strong><strong>del</strong>la</strong> mattina nel periodo<br />
considerato è stata di 1707 g. Il minimo <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione ha coinciso con il massimo<br />
contenuto cellulare registrato (Tabella 7).<br />
Tabella 7 - Produzione di <strong>latte</strong> di capra nel corso dei cinque<br />
controlli eseguiti duralte la lattazione e CCS<br />
1° 2° 3° 4° 5°<br />
Prod. kg 1,747 1,808 1,718 1,529 1,838<br />
10 3 cell./ml 571 632 557 833 782<br />
18
Se si considera la produzione in funzione <strong>del</strong>le due classi di ampiezza di CCS risulta una<br />
differenza di circa 50 g di <strong>latte</strong> (1712 g vs 1661 g). Anche se la produzione di <strong>latte</strong> in<br />
funzione <strong>del</strong> CCS non è risultata statisticamente significativa, occorre evidenziare che se<br />
rapportata ad un intero ciclo di produzione la perdita produttiva può risultare rilevante.<br />
Influenza <strong>del</strong> CCS sulle caratteristiche chimico-fisiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
Il confronto dei parametri qualitativi in funzione <strong>del</strong> CCS nelle due classi di ampiezza<br />
hanno mostrato significative differenze per il contenuto in lattosio, e in grasso (Tabella<br />
8).<br />
Tabella 8 - Valore medio (± ES) di alcune caratteristiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di capra in relazione alla classe di CCS.<br />
Classe di CCS<br />
(10 3 cell./ml)<br />
Grasso % Proteine % Lattosio % Caseina % pH °SH/50 ml<br />
1.000 2,54*±0,17 2,60±0,04 4,34*±0,05 2,07±0,04 6,69±0,022 2,79±0,096<br />
Per quanto riguarda le frazioni caseiniche riduzioni significative <strong><strong>del</strong>la</strong> α s - caseina e ß-<br />
caseina si osservano nel <strong>latte</strong> con CCS maggiori a 10 6 cell./ml (Tabella 9) mentre aumenti<br />
significativi si evidenziano nella stessa classe a carico dei proteoso-peptoni (prodotti <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
degradazione caseinica). Anche l’indice caseinico (I-CN), ottenuto dal rapporto tra caseina<br />
totale e proteine totali, tende a diminuire significativamente con l’aumentare <strong>del</strong> contenuto<br />
cellulare.<br />
Tabella 9 - Valore medio frazioni caseiniche (α-, β- e γ-caseine), indice caseinico, prodotti <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
degradazione caseinica (proteso peptonei, PP) <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di capra in relazione con la classe di<br />
CCS.<br />
Classe di CCS<br />
(10 3 cell./ml)<br />
α s -CN (g/l) ß-CN (g/l) γ-CN (g/l) PP (g/l) I-CN (%)<br />
1.000 8,1 14,3 0,9 0,84 79<br />
19
Influenza <strong>del</strong> CCS sulle caratteristiche lattodinamografiche<br />
In funzione <strong>del</strong> tempo di cogulazione, suddiviso in tre classi ( rr>10<br />
min’; r>20 min’) sono stati elaborati i valori medi di: K 10 , A 30 , pH, SH, α-CN%, β-CN%, κ-<br />
CN%, CCS e produzione. Dal confronto tra classi (Tab. 10) è emerso che i campioni di<br />
<strong>latte</strong> con r inferiore a 10 minuti, hanno dato una risposta significativamente migliore alla<br />
coagulazione avendo tra l’altro una più veloce formazione <strong>del</strong> coagulo (K 10 ), un maggior<br />
contenuto in α-CN ed un valore di pH più basso. Nei campioni di <strong>latte</strong> con valori di r<br />
superiori a 20 minuti, si sono avute differenze significative e un peggioramento qualiquantitativo<br />
<strong>del</strong> <strong>latte</strong>.<br />
Tabella 10 - Valori medi ± ES di alcune caratteristiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di capra e <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione<br />
quantitativa in funzione dei valori <strong>del</strong> tempo di coagulazione r. Significatività statistica <strong>del</strong>le<br />
differenze: A,B,C =P
Tabella 11 – Valori medi <strong>del</strong> contenuto in plasmina e<br />
plasminogeno <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di capra in funzione <strong><strong>del</strong>la</strong> classe di<br />
CCS.<br />
CCS (cell./ml) Plasmina Plasminogeno<br />
< 1.000.000 19,33 3,09<br />
> 1.000.000 20,35 3,23<br />
Come riportato da altri autori lo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella influenza l’attività <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
plasmina e <strong>del</strong> plasminogeno, che aumenta durante i processi infiammatori-infettivi.<br />
2.3.4. CONCLUSIONI<br />
I risultati ottenuti in questa sperimentazione hanno evidenziato un valore medio di CCS di<br />
669.000 cell./ml. I granulaciti polimorfonucleati rappresentano la principale componente<br />
cellulare presente nel <strong>latte</strong> di capra (oltre il 70%). L’esame batteriologico ha evidenziato<br />
una maggiore prevalenza di SCN confermando quanto è emerso da altri studi. L’incidenza<br />
di S.aureus è stata bassa e ciò in accordo con altri studi circa la minore capacità di<br />
trasmissione che lo S.aureus ha negli allevamenti caprini. Gli animali positivi a S. aureus,<br />
oltre a presentare i più alti contenuti cellulari, hanno mostrato un notevole incremento<br />
<strong>del</strong>l’attività <strong><strong>del</strong>la</strong> plasmina e <strong>del</strong> plasminogeno. Pur essendo stata effettuata una adeguata<br />
terapia antibiotica, si è costantemente riscontrata nel <strong>latte</strong> la presenza di S. aureus. Da ciò<br />
si può dedurre l’estrema difficoltà nella lotta terapeutica contro tali infezione mammaria e<br />
la convenienza ad eliminare i soggetti positivi, quale presidio fondamentale per il<br />
risanamento <strong>del</strong>l’allevamento. Va ricordata inoltre la capacità che hanno alcuni ceppi di S.<br />
aureus di produrre enterotossine e di causare quindi tossinfezioni alimentari. In particolare<br />
un punto critico potrebbe essere l’utilizzo di <strong>latte</strong> crudo infetto per la trasformazione<br />
casearia.<br />
Per quanto riguarda le infezioni da SCN non sempre si sono osservati variazioni <strong>del</strong> CCS,<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> produzione e <strong>del</strong>l’attività <strong><strong>del</strong>la</strong> plasmina e <strong>del</strong> plasminogeno. Gli studi fatti fino ad<br />
oggi, non sono ancora in grado di chiarire il ruolo degli SCN come patogeni intramammari.<br />
21
La presenza di altri microrganismi (minori) non ha fatto registrare variazioni significative<br />
<strong>del</strong> CCS e degli altri parametri, mostrando valori simili ai soggetti sani. Si conferma che il<br />
<strong>latte</strong> di capre non infette possono contenere fino a 2x10 6 cell./ml. Emerge che contenuti<br />
cellulari superiori a 10 6 cell./ml sono correlati con perdita produttiva, riduzione <strong>del</strong> lattosio<br />
e aumento degli enzimi caseinolitici i quali possono causare una degradazione <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
componente caseinica con conseguente peggioramento <strong>del</strong>l’attitudine alla caseificazione.<br />
L’indicazione di un valore soglia di CCS inferiore a 750.000 cell./ml può essere utilizzato<br />
per definire lo stato di sanità <strong><strong>del</strong>la</strong> ghiandola mammaria. Il livello di 1,5 x 10 6 cell./ml per il<br />
<strong>latte</strong> di massa sembra essere un limite appropriato per migliorare la condizione degli<br />
allevamenti di capre da <strong>latte</strong>.<br />
2.4. Studio sperimentale: qualità <strong>igienico</strong> <strong>sanitaria</strong> <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino<br />
2.4.1. PREMESSE<br />
Come per la specie caprina, anche nella specie ovina, l’Unione Europea, non ha ancora<br />
stabilito un limite legale circa il contenuto di cellule somatiche (CCS) nel <strong>latte</strong> di massa.<br />
Nonostante le indicazioni reperibili dalla letteratura internazionale e nazionale ancora oggi<br />
non è chiaro quali siano i livelli di cellule somatiche a cui fare riferimento in condizioni di<br />
campo che possano dare informazioni sulla qualità totale <strong>del</strong> <strong>latte</strong> e quella tecnologica in<br />
particolare.<br />
2.4.2. MATERIALI E METODI<br />
La prova sperimentale è stata realizzata presso un allevamento di tipo semintensivo<br />
costituito da 400 pecore di razza sarda sito in provincia di Viterbo. L’alimentazione è<br />
rappresentata da pascolo su erbai e prati, con integrazione di mangimi semplice al<br />
momento <strong><strong>del</strong>la</strong> mungitura. La mungitura, eseguita due volte al giorno, è di tipo meccanico<br />
con impianto lineare a 24 posti.<br />
Per tale prova sono stati selezionati 30 animali sani (sia primipare che pluripare) e<br />
monitorati per l’intera lattazione. I prelievi di <strong>latte</strong> sono stati effettuati ogni 4 settimane,<br />
durante la mungitura <strong><strong>del</strong>la</strong> mattina per un totale di 5 controlli. In ogni controllo è stata<br />
valutata la morfologia <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella. Per ogni soggetto sono stati prelevati, dapprima,<br />
22
campioni di emimammella per l’esame batteriologico e citologico. Subito dopo è stata<br />
misurata la produzione di ogni emimammella, mediante cilindri graduati, ed eseguito un<br />
prelievo di <strong>latte</strong> rappresentativo di ciascuna emimammella. Su tali campioni sono stati<br />
determinati i seguenti parametri: produzione, grasso, proteine, lattosio, residuo magro<br />
(RM), urea, caseina, pH, °SH, cellule somatiche con metodo automatico e microscopico. I<br />
parametri quali plasmina, plasminogeno e frazioni proteiche sono stati determinati dal<br />
Dipartimento di Produzioni Animali. Le metodiche d’analisi dei parametri sopra citati sono<br />
già descritte nel paragrafo riferito all’analisi <strong>del</strong> <strong>latte</strong> caprino, al quale si rimanda per le<br />
specifiche.<br />
2.4.3. RISULTATI<br />
Variazioni <strong>del</strong> contenuto cellulare in relazione allo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella<br />
Il contenuto medio di cellule somatiche durante l’arco <strong><strong>del</strong>la</strong> sperimentazione ha mostrato<br />
un valore di 648 cell./ml. La percentuale di emimammelle infette, nel periodo considerato,<br />
è stata <strong>del</strong> 24,2%. I principali patogeni isolati sono risultati gli Stafilococchi coagulasi<br />
negativi (SCN) (Fig. 6).<br />
18,8%<br />
5,5%<br />
75,7%<br />
CNS Other bacteria Negative<br />
Figura 6 - prevalenza percentuale di isolati batterici durante la lattazione<br />
Durante l’intera lattazione il 67,7% <strong>del</strong>le emimammelle infette sono risultate positive<br />
all’esame batteriologico in tre o più campionamenti consecutivi. La prevalenza di mastiti<br />
subcliniche è stata maggiore nei soggetti dalla terza lattazione in avanti rispetto agli<br />
animali in prima o seconda lattazione.<br />
Il 66,2% dei soggetti ha mostrato una infezione unilaterale. Confrontando emimammelle<br />
di soggetti con infezione unilaterale e bilaterale non sono state osservate differenze<br />
significative dei parametri produttivi e qualitativi, anche se i soggetti con infezione<br />
23
ilaterale hanno mostrato una minore produzione di <strong>latte</strong> e un maggiore CCS rispetto ai<br />
soggetti con infezione unilaterale (Tabella 12).<br />
Tabella 12 - Media stimata e DS <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione di <strong>latte</strong> nell’ovino e <strong>del</strong> CCS di emimammelle<br />
con infezione unilaterale e bilaterale<br />
Infezione unilaterale<br />
Infezione bilaterale<br />
CCS (log 10 ) 5,80±0,73 6,04±0,74<br />
Produzione (Kg/mungitura) 0,302±0,138 0,250±0,149<br />
Le emimammelle infette hanno mostrato un CCS significativamente superiore rispetto a<br />
quelle sane (871.000 cell./ml Vs 204.000 cell./ml), mentre per quanto riguarda la<br />
produzione si è osservata una riduzione di circa il 30% <strong><strong>del</strong>la</strong> quantità di <strong>latte</strong>. In termini<br />
quantitativi un’emimammella sana mediamente produce 410 g di <strong>latte</strong> per singola<br />
mungitura contro i 284 g prodotti da una emimammella infetta. Considerando una<br />
lattazione di 200 giorni, si avrebbe una perdita produttiva stimata di circa 45,4 litri di <strong>latte</strong><br />
per animale corrispondente ad una perdita economica di ca. 34 Euro (prezzo <strong>del</strong> <strong>latte</strong> 0,75<br />
euro/l).<br />
Tabella 13 - Medie <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione, CCS e caratteristiche chimico-fisiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino in<br />
base allo stato <strong>igienico</strong>.sanitario <strong>del</strong>le emimammelle. Significatività statistica <strong>del</strong>le differenze:<br />
A,B,C =P
egistrare una elevata percentuale di campioni con scarsa attitudine alla coagulazione<br />
presamica.<br />
Nell’ambito dei soggetti che hanno presentato infezione unilaterale, sono state confrontate<br />
le emimammelle infette con le rispettive controlaterali sane. Dal confronto è emerso che le<br />
prime hanno mostrato un maggiore CCS, un aumento di pH e una minore acidità titolabile.<br />
Tuttavia non sono state osservate differenze significative per quanto riguarda la<br />
produzione e gli altri componenti. Per verificare l’effetto <strong><strong>del</strong>la</strong> emimammella infetta sulla<br />
controlaterale non infetta sono stati confrontati i parametri analizzati di emimammelle<br />
sane di soggetti con infezioni unilaterale e emimamelle sane di soggetti completamente<br />
sani. Risulta che le emimammelle di animali completamente sani hanno presentato una<br />
produzione significativamente maggiore e un minore CCS rispetto alle emimammelle sane<br />
di animali con mastiti unilaterali (Tabella 14). Ciò potrebbe significare un effetto<br />
sistemico <strong><strong>del</strong>la</strong> emimammella infetta sulla controlaterale sana.<br />
Tabella 14 - Medie <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione, CCS e caratteristiche chimico-fisiche di emimammelle sane di<br />
soggetti con infezione unilaterale e di emimammelle di soggetti completamente sani. Significatività<br />
statistica <strong>del</strong>le differenze: A,B,C =P
Caratteristiche chimico-fisiche e produzione <strong>del</strong> <strong>latte</strong> in funzione <strong>del</strong> contenuto in cellule<br />
somatiche.<br />
Nella valutazione <strong>del</strong>l’influenza che ha il CCS sui parametri produttivi e di composizione <strong>del</strong><br />
<strong>latte</strong> di emimammella, sono state considerate quattro classi di cellule somatiche come di<br />
seguito riportate:<br />
1) contenuto inferiore a 200.000 cell./ml<br />
2) contenuto tra 200.000 e 400.000 cell./ml<br />
3) contenuto tra 400.000 e 800.000 cell./ml<br />
4) contenuto maggiore a 800.000 cell./ml<br />
La produzione media di <strong>latte</strong> per capo per giorno è di 1,149 Kg/die. Nella Figura 7 è<br />
riportata la variazione <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione nel corso <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione.<br />
kg/dì<br />
1,600<br />
1,400<br />
1,200<br />
1,000<br />
0,800<br />
0,600<br />
0,400<br />
0,200<br />
0,000<br />
1,400<br />
1,351<br />
1,156<br />
1,173<br />
0,827<br />
30 58 86 114 142<br />
gg dal parto<br />
Figura 7 - Variazione <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione nel corso <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione.<br />
Considerando la produzione in funzione <strong>del</strong> CCS si può osservare che all’aumentare <strong>del</strong><br />
contenuto cellulare corrisponde una riduzione significativa <strong><strong>del</strong>la</strong> quantità di <strong>latte</strong> prodotto<br />
(Figura 8). In particolare la riduzione risulta essere più marcata quando si passa dalla<br />
classe 1° alla classe 2° e dalla 2° alla 3°, mentre non si osservano differenze tra la classe<br />
con contenuti cellulari tra 400 e 800 x 10 3 e tra la classe con contenuti cellulari maggiori a<br />
800 x 10 3 .<br />
26
0,450<br />
0,400<br />
0,350<br />
0,300<br />
0,250<br />
0,200<br />
0,150<br />
0,100<br />
0,050<br />
0,000<br />
0,404 A<br />
0,335 B<br />
0,278 C 0,273 C<br />
=200 ;=400;800<br />
Figura 8 - Produzione media (kg) di emimammella nell’ovino in funzione<br />
<strong>del</strong>le classi di CCS considerate. A,B,C P
stretta sintesi mammaria, risulta essere un indicatore molto sensibile <strong><strong>del</strong>la</strong> funzionalità<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> ghiandola mammaria.<br />
5,60<br />
=200 ;=400;800<br />
7<br />
% grasso, proteine , lattosio<br />
5,40<br />
5,20<br />
5,00<br />
4,80<br />
4,60<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
4,40<br />
=200 ;=400;800<br />
0<br />
grasso proteine lattosio<br />
Figura 9 - Contenuto in grasso, proteine e lattosio in funzioni <strong>del</strong>le classi di ampiezza di SCC.<br />
Influenza <strong>del</strong> CCS sulle caratteristiche lattodinamografiche<br />
L’attitudine <strong>del</strong> <strong>latte</strong> alla coagulazione presamica risulta influenzata dal contento cellulare.<br />
Infatti si può osservare (Tabella 16) un aumento significativo <strong>del</strong> tempo di coagulazione<br />
in campioni di <strong>latte</strong> con contenuti cellulari maggiori a 800 x 10 3 cell./ml e negli stessi una<br />
riduzione significativa <strong><strong>del</strong>la</strong> consistenza <strong>del</strong> coagulo.<br />
Tabella 16 - Parametri lattodinamografici in funzione <strong>del</strong>le classi di CCS. Significatività<br />
statistica <strong>del</strong>le differenze: a,b,c P
Inoltre si assiste all’aumentare <strong>del</strong> contenuto cellulare un aumento dei campioni non<br />
reattivi alla prova <strong><strong>del</strong>la</strong> coagulazione (Figura 10). In particolare il 49% dei campioni con<br />
contenuti cellulari maggiori a 800 x 10 3 cell./ml non hanno reagito all’aggiunta <strong>del</strong> caglio<br />
nelle condizioni sperimentali (30 min).<br />
% campioni non reattivi<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
7%<br />
28% 29%<br />
49%<br />
0%<br />
=200 ;=400;800<br />
Figura 10 - Percentuale di campioni di <strong>latte</strong> ovino non reattivi in funzione <strong>del</strong>le classi<br />
di CCS<br />
Influenza <strong>del</strong> CCS sull’indice caseinico, pH, °SH<br />
Anche i parametri più strettamente tecnologici quali l’indice caseinico il pH e i gradi °SH<br />
sono influenzati <strong>del</strong> CCS. Per quanto riguarda l’indice caseinico una riduzione significativa<br />
si osserva nella classe di campioni con cellule somatiche maggiori a 800 x 10 3 cell./ml<br />
(Figura 11) mentre non si osservano differenze significative nelle altre classi considerate.<br />
% indice caseina<br />
79,20<br />
79,00<br />
78,80<br />
78,60<br />
78,40<br />
78,20<br />
78,00<br />
77,80<br />
77,60<br />
77,40<br />
77,20<br />
78,97 A<br />
78,65 A<br />
78,52 A<br />
77,81 B<br />
=200 ;=400;800<br />
Figura 11 - Indice caseinico <strong>del</strong> <strong>latte</strong> ovino in funzione <strong>del</strong>le classi di CCS (10 3<br />
cell./ml). A,B P
Riguardo l’acidità attuale (pH) un aumento significativo si registra in emimammelle con<br />
contenuti cellulari maggiori a 800 x 10 3 cell./ml ( 6,49 Vs 6,65) in corrispondenza l’acidità<br />
titolabile (°SH) tende a diminuire significativamente ( 10,20 Vs 8.64) (Figura 12).<br />
10,5<br />
6,7<br />
10<br />
6,65<br />
9,5<br />
6,6<br />
°SH<br />
9<br />
6,55<br />
pH<br />
8,5<br />
6,5<br />
8<br />
6,45<br />
7,5<br />
=200 ;=400;800<br />
6,4<br />
°SH<br />
pH<br />
Figura 12 – Andametop <strong>del</strong> pH e di °SH nel <strong>latte</strong> ovino in funzione <strong>del</strong>le classi<br />
di SCC (10 3 cell./ml).<br />
Morfologia <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella e parametri produttivi e di composizione <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
Ad ogni controllo prima <strong><strong>del</strong>la</strong> mungitura è stata eseguita la palpazione <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella e<br />
valutata la morfologia come descritto nella Figura 13. Le mammelle definite come A<br />
presentavano circonferenza in corrispondenza degli attacchi ampia, simmetria <strong>del</strong>le<br />
emimammelle e angolazione dei capezzoli inferiore a circa 45°. Le mammelle classificate<br />
come C presentavano attacchi medi, pendenza <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella e angolazione dei capezzoli<br />
maggiori a circa 45°. In ultimo le mammelle E, presentavano attacchi piccoli, asimmetria<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> mammella e capezzoli con angolazione maggiore a circa 45°.<br />
Sono stati confrontati i valori medi dei parametri produttivi e <strong>del</strong>le caratteristiche chimicofisiche<br />
e sanitarie (Tabella 17) <strong>del</strong> <strong>latte</strong> appartenente alle tre classi di mammelle. I<br />
risultati mostrano una riduzione <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione di <strong>latte</strong> <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella tipo C e tipo E<br />
rispetto alla mammella A. In particolare la mammella tipo E produce circa 0,300<br />
Kg/mungitura in meno rispetto alla mammella tipo A, con una perdita percentuale di circa<br />
il 34,3%.<br />
30
Figura 13 - Classificazione <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella in base alla morfologia<br />
Da un punto di vista tecnologico il <strong>latte</strong> prodotto dalla mammella E presenta un minore<br />
contenuto in lattosio, un indice caseinico inferiore, una maggiore acidità attuale (pH) e<br />
una minore. Anche se i parametri determinati per valutare l’attitudine alla coagulazione<br />
non presentano differenze tra le tre classi, si osserva che il 22,8% <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di mammelle<br />
tipo C e il 50% tipo E non coagulano dopo l’aggiunta di caglio.<br />
Tabella 18 - Produzione, composizione e caratteristiche lattodinamografiche in funzione <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
morfologia <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella.<br />
Classe A Classe C Classe E<br />
kg/mungitura 0,874 0,684 0,574<br />
Grasso (%) 4,35 5,08 4,84<br />
Proteine (%) 5,35 6,05 5,96<br />
Lattosio (%) 5,19 5,07 4,65<br />
Caseina (%) 4,22 4,77 4,66<br />
Ind.caseina (%) 78,95 79,09 77,68<br />
Tempo coagulaz. (min’) 20,95 20,64 20,70<br />
Consistenza coagulo (mm) 41,52 45,47 41,22<br />
Velocità formaz. coag. (min’) 1,65 1,61 1,72<br />
pH 6,50 6,53 6,60<br />
°SH 10,04 10,20 8,68<br />
CCS m.geom. (10 3 cell./ml) 204 295 617<br />
% emimam. infette 21,05 22,8 45,65<br />
% campioni non coag. 12,28 26,31 50<br />
31
Per quanto riguarda lo stato sanitario il 45,65% <strong>del</strong>le mammelle E sono risultate positive<br />
all’esame batteriologico facendo registrare un contento cellulare di 617 x 10 3 cell./ml.<br />
Mentre la percentuale di mammelle tipo A e tipo C risultate positive all’esame<br />
batteriologico è stato rispettivamente <strong>del</strong> 21,05% e 22,8% con contenuti cellulari di 204 x<br />
10 3 cell./ml per il tipo A e 295 x 10 3 cell./ml per il tipo E.<br />
2.4.4. CONCLUSIONI<br />
I risultati ottenuti da questo studio permettono di fare le seguenti considerazioni. In prima<br />
analisi si evidenzia che elevati contenuti cellulari sono associati ad una notevole riduzione<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> produzione e ad un peggioramento <strong>del</strong>le caratteristiche chimico- fisiche e di<br />
coagulazione <strong>del</strong> <strong>latte</strong>. La riduzione <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione di <strong>latte</strong> si osserva in emimammelle<br />
con contenuti cellulari superiori a 200 x 10 3 ( 17% al 33%). Anche il lattosio subisce una<br />
riduzione nel <strong>latte</strong> prodotto da emimammelle con contenuti cellulari >200 x 10^3,<br />
risultando un indicatore sensibile <strong>del</strong>lo stato infiammatorio <strong><strong>del</strong>la</strong> ghiandola mammaria.<br />
Spostando l’attenzione sui parametri più tecnologici, quali indice caseinco, pH, °SH e indici<br />
lattodinamografici, peggioramenti <strong><strong>del</strong>la</strong> caratteristiche casearie si osservano nel <strong>latte</strong> di<br />
emimammelle con contenuti cellulari superiori a 800 x 10³. Riguardo allo stato sanitario<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> ghiandola mammaria, emerge che le forme di mastiti sub cliniche determinano un<br />
peggioramento <strong><strong>del</strong>la</strong> qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong>. In questo studio risulta come valore discriminante<br />
tra emimammella sana e infetta 200 x 10³ cell./ml, valore in linea con quanto riportato da<br />
nostri precedenti studi (Rosati et al., 2004). Tuttavia occorre considerare che un<br />
peggioramento <strong><strong>del</strong>la</strong> qualità tecnologica <strong>del</strong> <strong>latte</strong> si evidenzia quando i contenuti cellulari<br />
sono superiori a 800 x 10³.<br />
Di particolare importanza risulta essere il grado di persistenza <strong>del</strong>l’infezione, infatti<br />
contenuti cellulari elevati si osservano in emimammelle con tre o più isolamenti<br />
batteriologici. Inoltre sembra evidenziarsi un effetto sistemico <strong>del</strong>l’emimammella infetta<br />
sulla corrispondente sana. Il conteggio <strong>del</strong>le cellule somatiche rappresenta anche per i<br />
piccoli ruminanti un valido indicatore <strong>del</strong>lo stato sanitario <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella. Il fatto che<br />
questo parametro non venga per ora contemplato da alcuna specifica normativa non ne<br />
diminuisce a nostro avviso l’importanza alla luce <strong><strong>del</strong>la</strong> preoccupante diffusione di mastiti<br />
subcliniche da noi e da altri autori riscontrata. Per il controllo <strong>del</strong>le forme di mastite sub<br />
32
clinica la determinazione ripetuta <strong>del</strong> contenuto in cellule somatiche e la conformazione<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> mammella può essere un valido strumento di screening per la selezione di soggetti<br />
da campionare per l’identificazione degli agenti eziologici di infezione e per indirizzare<br />
misure profilattiche e terapeutiche idonee.<br />
Le applicazioni dei controlli suddetti deve andare di pari passo con un miglioramento <strong>del</strong>le<br />
condizioni <strong>igienico</strong>-sanitarie <strong>del</strong>l’allevamento e <strong>del</strong>le operazioni di mungitura, con controlli<br />
periodici degli impianti di mungitura e con una maggiore attenzione agli aspetti nutrizionali<br />
e gestionali.<br />
3. ANALISI DELLE FRAZIONI CASEINICHE DEL LATTE OVINO<br />
4.1. Premesse<br />
4.1.1. Il <strong>latte</strong> ovino<br />
La sintesi <strong>del</strong>le proteine avviene nella ghiandola mammaria a partire da aminoacidi<br />
veicolati dal torrente circolatorio. La componente proteica è costituita da due principali<br />
frazioni con caratteristiche diverse e di fondamentale importanza sia per la caseificazione<br />
che per il valore nutrizionale <strong>del</strong> <strong>latte</strong>: le caseine, che rappresentano circa l'80% <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
proteina totale nel <strong>latte</strong> di pecora, e le sieroproteine (o proteine solubili).<br />
Le caseine sono le proteine preponderanti nel <strong>latte</strong> di quasi tutte le specie di mammiferi e<br />
sono quelle che, sotto l’azione <strong>del</strong>l’enzima chimosina contenuto nel caglio, si addensano<br />
costituendo la "cagliata", complesso precipitativo che include anche i globuli lipidici. Le<br />
caseine sono un gruppo eterogeneo di proteine fosforilate presenti nel <strong>latte</strong> come<br />
complessi stabili fosfoproteici di calcio, denominati “micelle”. Nel caso <strong><strong>del</strong>la</strong> pecora, come<br />
in altri ruminanti, esse si compongono di 4 diverse frazioni complesse (α s1 -, α s2 -, β-, k-), La<br />
loro importanza è quindi fondamentale nel processo di caseificazione determinando la<br />
velocità di formazione <strong>del</strong> coagulo <strong><strong>del</strong>la</strong> cagliata e la sua consistenza. Il tenore in k-<br />
caseina, in particolare, gioca un ruolo determinante nel meccanismo di coagulazione<br />
presamica <strong>del</strong> <strong>latte</strong>; tale frazione caseinica ha un effetto marcato sulla velocità di<br />
aggregazione <strong><strong>del</strong>la</strong> micelle. Infatti, il diametro medio <strong>del</strong>le micelle è inversamente<br />
proporzionale alla quantità di k-caseina presente nel <strong>latte</strong>.<br />
33
Le sieroproteine, le cosiddette proteine solubili (β-lattoglobulina, α-lattoalbumina e siero<br />
albumina), presentano peso molecolare inferiore alle caseine, non hanno la capacità di<br />
coagulare per azione <strong>del</strong> caglio e rimangono così in soluzione nel siero residuo. Per<br />
provocare la coagulazione di tali proteine occorrono temperature elevate. Riscaldando il<br />
siero, esse si separano sotto forma di flocculi che, affiorando, possono essere raccolti per<br />
la produzione <strong><strong>del</strong>la</strong> ricotta. Le sieroproteine sono presenti nel <strong>latte</strong> di pecora in<br />
percentuale più elevata rispetto al <strong>latte</strong> caprino e vaccino ed essendo ricche di<br />
amminoacidi essenziali, conferiscono al <strong>latte</strong> un alto valore biologico. In generale, la<br />
quantità <strong><strong>del</strong>la</strong> proteina risulta meno variabile rispetto al tenore in grasso, ma risente<br />
ugualmente <strong>del</strong> periodo <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione seguendo dinamica simile. Con il procedere <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
lattazione, il <strong>latte</strong> si osserva un arricchimento in caseina e proteine solubili (Fig. 13) a<br />
scapito <strong>del</strong>le forme azotate non proteiche. Nel <strong>latte</strong> di pecora il rapporto tra le proteine e<br />
la materia azotata totale è molto elevato (pari al 95%) ad indicare un contenuto in azoto<br />
non proteico molto basso. Importanti sono i fattori genetici e ambientali, in primis<br />
l'alimentazione.<br />
Figura 13 – Latte di pecora. Andamento <strong>del</strong> contenuto di proteine totali e<br />
caseine durante la lattazione (adattato da: Pugliese et al., 1998)<br />
Tabella 19 - Composizione media percentuale (p/p) <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora.<br />
Componenti % Frazioni %<br />
Acqua 81,75<br />
Grasso 7,09<br />
Proteine 5,75<br />
Caseina 4,42 α s1 + α s2 29,60<br />
β 55,10<br />
34
k 8,90<br />
γ 6,50<br />
Proteine solubili 1,06 β–lattoglobuline 51,40<br />
α -lattoalbumine+sieroalbumine 25,10<br />
proteosi-peptoni 5,60<br />
globulina 17,90<br />
Azoto non proteico 0,265 urea 44,80<br />
aminoacidi 15,70<br />
creatinina 1,70<br />
creatina 2,40<br />
ammoniaca 0,10<br />
ac. urico 2,10<br />
n.d. 33,30<br />
Tabella 20 – Dati <strong><strong>del</strong>la</strong> letteratura sulle frazioni caseiniche per varie specie da <strong>latte</strong>.<br />
Latte<br />
α s2 -cas<br />
(%)<br />
Frazione caseinica Minore Caseina Riff.<br />
α s1 -cas<br />
(%)<br />
β-cas<br />
(%)<br />
κ-cas<br />
(%)<br />
Mora-Gutierrez et al.<br />
Bovino 12,1 39,5 37,2 11,2 - -<br />
(1991)<br />
9,3 37,6 33,4 19,7 - 85,7 Bobe et al. (1998)<br />
10,1 38,6 38,7 12,7 - 84,3 Walstra et al. (1984)<br />
Cordeiro et al. (2001)<br />
7,8 38,1 44,6 9,5 - 81,6<br />
Bordin et al. (2001)<br />
10,5 38,4 36,5 12,5 - - Zicarelli (2004)<br />
7,1 37,6 41,4 8,6 - - Bramanti et al. (2003)<br />
11,9 a 38,1 37,2 11,4<br />
12,8 b 29,1 39,7 16,3<br />
Mariani et al. (1993)<br />
Bufalino 17,6 30,2 33,9 15,4 - - Zicarelli (2004)<br />
12,9 31,1 27,9 6,5 - - Bramanti et al. (2003)<br />
Caprino a 13,6 18,4 54,0 12,4 1,6 - Tziboula & Home (1999)<br />
11,0 21,0 48,0 15,0 5,0 - Pierre et al. (1995)<br />
Caprino b 19,3 1,9 58,5 14,9 5,4 - Tziboula & Home (1999)<br />
- 10,3 63,3 8,3 - - Bramanti et al. (2003)<br />
14,0 0,0 60,0 20,0 6,0 - Pierre et al. (1995)<br />
Ovino 8,0 35,0 38,0 17,0 - -<br />
Calavia & Burgos (1998)<br />
Dall’Olio et al. (1990)<br />
Papoff et al. (1993)<br />
13,7 33,1 30,1 14,3 - - Bramanti et al. (2003)<br />
a genotipo “α s1 alta”<br />
b genotipo “α s1 bassa”<br />
La differenziale presenza <strong>del</strong>le frazioni caseiniche ha diverse importanti implicazioni sulla qualità in<br />
senso lato <strong>del</strong> <strong>latte</strong>. Infatti, a seconda <strong><strong>del</strong>la</strong> maggiore o i minore quantità di alcune frazioni rispetto<br />
ad altre (Tabb. 19 e 20), le proprietà ci caseificazione <strong>del</strong> <strong>latte</strong> possono essere molto variabili.<br />
35
Anche sotto il profilo <strong>del</strong>l’immunogenicità, la minore o maggiore presenza <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione α s1 -cas,<br />
riveste un ruolo importantissimo. Tale variabilità e di origine genetica. Nella capra, infatti, è noto<br />
che il locus genico per questa caseina è fortemente polimorfico con almeno 5 varianti alleliche cui<br />
corrispondo diverse capacità di sintesi <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione α s1 -cas: A, B e C 100%, E ca. 44%, D ed F ca.<br />
17%, etc.). Anche per la vacca sono riportati in letteratura dati sulla variabilità di sintesi <strong>del</strong>le<br />
frazioni caseiniche su basi genetiche: ad es. il locus per la κ-caseina che presenta 2 varianteo<br />
alleliche (A e B) (Mariani & Pecorari, 1991) oppure la presenza di differenti genotipi per livello (ca.<br />
10%) di sintesi <strong>del</strong>l’α s1 -cas in vacche di razza bruna (Mariani et al., 1993).<br />
4.1.2. Metodi cromatografici per l’analisi <strong>del</strong>le proteine <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
I metodi cromatografici, consentono la separazione e la quantificazione di composti di<br />
varia natura. Nello specifico, la cromatografia di proteine viene di norma condotta con la<br />
tecnica HPLC (High Pressare Liquid Chromatography) impiegando un fase stazionaria<br />
apolare (di norma resine o silice come supporto rivestite di molecole alifatiche a 4, 8 o 18<br />
atomi di carbonio con o senza presenza di doppi legami). Una tipica fase stazionaria<br />
inversa è la C18 alchene legata a microsfere silicee di 5 µm di dimetro, nota anche come<br />
Octa-Decyl-Silane 2 - ODS2). Nel caso <strong>del</strong>l’analisi <strong>del</strong>le proteine <strong>del</strong> <strong>latte</strong>, in letteratura<br />
sono riportate altre tecniche cromatografiche d’analisi come il metodo ottimizzato da<br />
Bramanti et al. (2003) che sfrutta la capacità separativa di particolari colonne con fase<br />
stazionaria parzialmente idrofobia (Propyl HIC, 10 x 4,6 cm, 6,5 µm – 300 Å) e fase<br />
mobile a forza ionica decrescente in gradiente d’eluizione (Hydrophobic Interaction<br />
Chromatography – HIC). Sebbene questo tipo di tecnica offra buoni risultati con minimo<br />
pre-trattamento <strong>del</strong> campione, l’impiego di tamponi ad elevata forza ionica e ad elevata<br />
concentrazione di urea (8,0 M), rende l’approccio problematico da un lato per la<br />
preparazione dei tamponi (filtrazione e degasaggio) me soprattutto dall’altro per le<br />
complicazioni che insorgono con l’impiego in HPLC di tali tamponi che richiedono<br />
un’attenzione esecutiva piani di manutenzione particolarmente impegnativi.<br />
D’atro canto, le tecniche a fase inversa che impiegano fasi mobili più semplici e meno<br />
“aggressive” per le parti in movimento (valvole e pompe) e per le colonne, sono state con<br />
successo impiegate per l’analisi <strong>del</strong>le frazioni caseiniche e per le proteine <strong>del</strong> siero. Ad<br />
esempio Bordin e collaboratori (2001) hanno messo a punto e valicato un metodo in RP-<br />
36
HPLC per la separazione e quantificazione <strong>del</strong>le proteine <strong>del</strong> <strong>latte</strong> a partire da campione<br />
sgrassato sottoposto ad un trattamento minimo.<br />
4.2. Materiali e metodi<br />
4.2.2. Campionamento<br />
I prelievi di <strong>latte</strong> ovino sono stati condotti mensilmente in un allevamento di pecore di<br />
razza Sarda in Provincia di Viterbo. Sono state considerate 30 pecore primipare in buone<br />
condizioni generali di salute senza, evidenti segni clinici di mastite. Il prelievo dei campioni<br />
individuali d’emimammella, è stato effettuato con cadenza mensile durante la mungitura<br />
mattutina. Il periodo di controllo ha avuto durata di 5 mesi, da Febbraio 2006 fino Giugno<br />
2006. In totale 586 campioni di <strong>latte</strong> sono stati raccolti entro tubi da centrifuga in<br />
polietilene da 10 ml e conservati alla temperatura di -20°C fino al memento <strong>del</strong>l’analisi.<br />
Per l’analisi causale <strong><strong>del</strong>la</strong> variabilità <strong>del</strong> profilo caseinico sono stati considerati 107<br />
campioni d’emimammella selezionati in base ai seguenti criteri:<br />
Criterio di selezione<br />
N. campioni<br />
Emimmelle affette bilateralmente 44<br />
Emimammelle controlaterali sane 31<br />
Emimammelle sotto 100000 SCC /ml 9<br />
Emimammelle oltre 500000 SCC /ml 23<br />
4.2.3. Metodo RP-HPLC per le caseine <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora<br />
I metodi cromatografici, consentono la separazione e la quantificazione di composti di<br />
varia natura. Nello specifico, la cromatografia di proteine viene di norma condotta con la<br />
tecnica HPLC (High Pressare Liquid Chromatography) impiegando un fase stazionaria<br />
apolare (di norma resine o silice come supporto rivestite di molecole alifatiche a 4, 8 o 18<br />
atomi di carbonio con o senza presenza di doppi legami). Una tipica fase stazionaria<br />
inversa è la C18 alchene legata a microsfere silicee di 5 µm di dimetro, nota anche come<br />
Octa-Decyl-Silane 2 - ODS2). Nel caso <strong>del</strong>l’analisi <strong>del</strong>le proteine <strong>del</strong> <strong>latte</strong>, in letteratura<br />
sono riportate altre tecniche cromatografiche d’analisi come il metodo ottimizzato da<br />
Bramanti et al. (2003) che sfrutta la capacità separativa di particolari colonne con fase<br />
37
stazionaria parzialmente idrofobia (es. Propyl HIC, 10 x 4,6 cm, 6,5 µm – 300 Å) e fase<br />
mobile a forza ionica decrescente in gradiente d’eluizione (Hydrophobic Interaction<br />
Chromatography – HIC). Sebbene questo tipo di tecnica offra buoni risultati con minimo<br />
pre-trattamento <strong>del</strong> campione, l’impiego di tamponi ad elevata forza ionica e ad elevata<br />
concentrazione di urea (8,0 M), rende l’approccio problematico da un lato per la<br />
preparazione dei tamponi (filtrazione e dagasaggio) e soprattutto, dall’altro, per le<br />
complicazioni che insorgono con l’impiego in HPLC di tali tamponi che richiedono<br />
un’attenzione esecutiva e piani di manutenzione particolarmente impegnativi e gravosi.<br />
D’atro canto, le tecniche a fase inversa, che impiegano fasi mobili più semplici e meno<br />
“aggressive” per le parti in movimento (valvole e pompe) e per le colonne, sono state con<br />
successo impiegate per l’analisi <strong>del</strong>le frazioni caseiniche e per le proteine <strong>del</strong> siero.<br />
Per la specifica applicazione al presente programma di ricerca, al fine di valutare lo studio<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> variabilità <strong>del</strong>le frazioni caseiniche in campioni di <strong>latte</strong> di pecora, è stato messo a<br />
punto un metodo con determinazione in RP-HPLC e fluorimetria, adattando il protocollo già<br />
sviluppato da Viesser e collaboratori (1986). Nella presente sperimenatazione, pertanto, si<br />
è preferito rivolgerci a tali tecniche per il loro grado di risoluzione e per la semplicità di<br />
gestione <strong>del</strong> sistema pompa-colonna <strong>del</strong>l’apparato HPLC:<br />
Il metodo prevede due fasi principali (Viesser et al., 1986):<br />
• preparazione <strong>del</strong>le caseine (pretarattamento <strong>del</strong> campione);<br />
• analisi cromatografia per RP-HPLC con rivelazion UV o fluorimetrica.<br />
Pretrattamento <strong>del</strong> campione<br />
Per la preparazione <strong>del</strong>le caseine, il campione di <strong>latte</strong> viene sgrassato per centrifugazione<br />
a 3500 rpm alla temperatura di 4°C per 10 min’. Dopo lo sgrassaggio, il campione<br />
preventivamente diluito 1:2 con acqua distillata, viene sottoposto ad acidificazione con<br />
l’aggiunta di acido acetico glaciale al 10% v/v fino a pH 4,6 (ca. 9 ml di acido per 50 ml di<br />
<strong>latte</strong>).<br />
In seguito all’acidificazione si osserva la precipitazione <strong>del</strong>le caseine. Per agevolare le fasi<br />
successive di trattamento <strong>del</strong> campione, la procedura viene eseguita entro tubi da 10 ml in<br />
polietilene come segue:<br />
38
1. a 3 ml di <strong>latte</strong> sgrassato vengono aggiunti 3 ml d’acqua, ca. 0,7 g di glass beds<br />
(diametro nominale: 2 mm) e 0,5 ml di acido acetico al 10%;<br />
2. il campione viene centrifugato a 1500 rpm per 3 min’ e, dopo aver scartato il<br />
surnatante, vengono aggiunti 5 ml d’acqua distillata tiepida (ca. 40-50°C);<br />
3. al vortex viene spappolato e ri-sospeso il coagulo e nuovamente centrifugato a<br />
1500 rpm per 3 min’;<br />
4. eliminato il surnatante si procede ad effettuare due lavaggi come sopra (punti 2 e<br />
3) con 5 ml di etanolo, due lavaggi con 5 ml acetone e due lavaggi con 5 ml di<br />
etere di petrolio;<br />
5. al termine <strong><strong>del</strong>la</strong> procedura di purificazione, il campione viene essiccato sotto azoto a<br />
40°C fino a completa eliminazione <strong>del</strong>l’etere (caseine inodori).<br />
Per la preparazione <strong>del</strong>le caseine e l’analisi in RP-HPLC sono necessari i seguenti tamponi<br />
e solventi:<br />
Solventi per HPLC<br />
Tampone bis-tris propane<br />
Tampone Urea 8 M<br />
MetCN (HPLC, Gradient Grade); H 2 O (ASTM Type I); TFA 1% in H 2 O<br />
0,5646 g di BIS-TRIS-PROPANE (Sigma) vengono pesati e posti in un<br />
matraccio da 100 ml con 24 g d’Urea e 0,24 ml di β-mercaptoetanolo. Si<br />
porta a volume con acqua ultrapura e si aggiusta il pH a 7.0 con HCl (37%)<br />
24 g d’Urea vengono pesati in matraccio da 50 ml portando a volume con<br />
miscela MetCN/H 2 O/TFA (9,95:89,95:0,1) (90:10 + TFA 0,1%), e filtrati su<br />
microfibra o filtri a membrana da 0,45 µm<br />
Preparazione <strong>del</strong> campione purificato<br />
Dieci grammi di caseine sono pesati entro tubi da 15 ml (falcon) e disciolti in 2 ml di<br />
tampone BIS-TRIS-PROPANE, vortexando per 1-2 min’ fino a completamento dissoluzione<br />
<strong>del</strong>le caseine. Si lascia riposare per 40-60 min’ e quindi si aggiungono 8 ml di TAMPONE<br />
UREA 8M. Infine 5 µl vengono iniettati in HPLC e la detezione dei picchi è ottenuta per<br />
confronto con i tempi di ritenzione di standard commerciali di α-, β- e k-caseina bovina<br />
(Sigma-Aldrich, Germany)<br />
39
Sistema cromatografico e settaggi<br />
Il sistema HPLC impiegato per l’analisi <strong>del</strong>le frazioni caseiniche nel <strong>latte</strong> ovino, pretrattato<br />
come sopra riportato, è così composto e settato come segue:<br />
• Dispositivo di degasaggio dei solventi per la fase mobile: Thermo Finnigan Vaccum<br />
Degaser<br />
• Pompa quaternaria a gradiente: ThermoFinnigan Spectrasystem P4000<br />
• Colonna separativa: Vydac C18 25 cm, 5 µm, 4,6 mmID 300 Å Cod 218TP54 (con<br />
blocco filtro precolonna da 0,2 µm)<br />
• Solventi: H 2 O, MetCN e TFA 1% (tutti di grado gradiente per HPLC o equivalenti,<br />
Sigma, Germany)<br />
• Programmazione <strong>del</strong> gradiente: MetCN/H 2 O/TFA1% da 32:48:20 fino a 44:36:20 in<br />
17,4 min’, poi fino a 60:20:20 in 5 min’ e quindi ritorno alla fase iniziale a in 9,5<br />
min’. Durata <strong><strong>del</strong>la</strong> corsa: 32 min’.<br />
• Fluorimetro: ThermoFinnigan Spectrasystem FL3000; λ ex =280 nm, λ em =364 nm<br />
• Autocampionatore con settaggi tray/forno: T tray = 4°C; T oven = 28°C<br />
• Software di gestione e calcolo: ChromQuest 3.0<br />
4.2.4 Metodo per la produzione <strong><strong>del</strong>la</strong> γ-caseina<br />
Per la preparazione <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione γ-caseinica si procede come <strong>del</strong>ineato in Urech et al.<br />
(1998). Il metodo prevede l’idrolisi mediata da plasmina (PL) secondo il seguente schema<br />
di reazione:<br />
• α-cas: 20 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A<br />
questo sono aggiunti 900 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino<br />
alla parziale dissoluzione <strong>del</strong>lo standard. Si aggiungono 100 µl di plasmina [1<br />
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato<br />
per 18 ore a 37°C.<br />
• β-cas: 10 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A<br />
questo sono aggiunti 900 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino<br />
alla parziale dissoluzione <strong>del</strong>lo standard. Si aggiungono 100 µl di plasmina [1<br />
40
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato<br />
per 18 ore a 37°C.<br />
• k-cas: 3,8 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A<br />
questo sono aggiunti 200 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino<br />
alla parziale dissoluzione <strong>del</strong>lo standard. Si aggiungono 800 µl di plasmina [1<br />
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato<br />
per 18 ore a 37°C.<br />
Dopo l’incubazione i tre preparati per la γ-cas sono equalizzati a 3,8 mg cas equivalenti<br />
(titolo nominale <strong><strong>del</strong>la</strong> k-cas prima <strong>del</strong>l’idrolisi) portando 190 µl e 380 µl degli idrolizzati<br />
rispettivamente per l’α-cas e la β-cas a 1000 µl con NaCl 0,85% (p/v).<br />
200 µl di idrolizzato <strong><strong>del</strong>la</strong> k-cas, degli idrolizzati diluiti <strong>del</strong>l’α-cas e <strong><strong>del</strong>la</strong> β-cas, 200 µl di<br />
PL (1mg/ml) preventivamente diluita ½ con NaCl 0,85% (p/v) e 200 µl di NaCl 0,85%<br />
(p/v) sono posti in vials da HPLC, essiccati in debole corrente d’azoto a 37°C e quindi<br />
risospesi 200 µl di tampone bis-tri-propane. Dopo 45 min’ d’incubazione si aggiungono<br />
800µl di tampone Urea 8 M. Il volume d’iniezione, per mantenere la comparabilità con<br />
la normale procedura d’analisi <strong>del</strong>le caseine (compresi gli standard commerciali alla<br />
concentrazione d’iniezione di 1mg/ml), dovrà essere pari a:<br />
5*5/3,8= 6,6 µl<br />
4.3. Risultati e discussioni<br />
Sualla scorta d’informazioni relative allo stato di salute <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella ottenuti dall’Istituto<br />
Zooprofilattico Sperimentale per le Ragioni Lazio e Toscana – Centro Latte, sono stati<br />
selezionati campioni di <strong>latte</strong> d’emimamella su cui effettuare lo screening cromatografico<br />
per le frazioni caseiniche.<br />
Per la valutazione <strong><strong>del</strong>la</strong> composizione percentuale <strong>del</strong>le frazioni caseiniche, s’è ricorso<br />
all’analisi <strong><strong>del</strong>la</strong> risposta strumentale (fluorimetro) per le frazioni commerciali assumendo<br />
analogo comportamento per le omonime frazioni <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora. Per tale motivo sono<br />
41
stati analizzati standard cromatografici a titolo noto (1 mg/ml per le tre frazioni<br />
commerciali α sx -, β- e κ-caseina) e per ogni frazione è stato determinato il valore <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
risposta strumentale rispetto alla frazione con risposta maggiore (area somma dei picchi<br />
cromatografici, valore maggiore):<br />
β-caseina = 0,50<br />
κ-caseina = 0,78<br />
α-caseina = 1,00<br />
Nella tabella successiva (Tab. 21) sono riportati, in percentuale, i contenuti per le diverse<br />
frazioni caseiniche nei campioni di <strong>latte</strong> ovino mentre in Tabella 22 sono riportate le<br />
statistiche di base.<br />
In termini percentuali, le frazioni caseiniche mediamente riscontrate nella popolazione<br />
campionaria saggiata, risultano in linea con quanto riportato in letteratura (cfr. ad es.<br />
l’esauriente rassegna in Bramanti et al., 2003). Tuttavia è da osservare come nei<br />
campioni saggiati sia risultata mediamente più elevata la presenza <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione α s2<br />
rispetto a quanto riportato in letteratura e mediamente inferiore, invece, il contenuto in κ-<br />
caseina. Per questa componente caseinica, inoltre, la variabilità (CV%= 39,5) è risultata<br />
sensibilmente superiore alle altre frazioni a denotare probabilmente una maggiore<br />
dipendenza di tale frazione da condizioni quali, ad esempio, lo stato fisiologico <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
mammella e <strong>del</strong>l’individuo.<br />
In relazione alla k-caseina, va detto che proprio tale frazione risulta particolarmente<br />
suscettibile all’azione enzimatica indotta dal complesso plasmina-plaminogeno e che da<br />
tale azione ne risulta la formazione <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione γ-cas, la cui presenza nei<br />
cromatogrammi acquisiti è tutt’ora in fase di accertamento. La presenza di questa<br />
componente, in quantità variabili da campione a campione, potrebbe giustificare il<br />
minorre contenuto medio <strong><strong>del</strong>la</strong> κ-cas rispetto a quanto rinvenuto in letteratura e<br />
soprattutto può contribuire a definire un plausibile quadro di riferimento per la casistica<br />
minus-variante.<br />
42
Nel tentativo di indiduare eventuali fattori il cui effetto si esplica nel diverso assortimento<br />
<strong>del</strong>le frazioni caseiniche, su dati è stata condotta l’analisi <strong><strong>del</strong>la</strong> varianza per testare i<br />
seguenti fattori:<br />
1) mese di campionamento; febbraio, marzo, aprile, maggio, giugno;<br />
2) ordine di parto;<br />
3) salute <strong><strong>del</strong>la</strong> mammella: positiva ai patogeni e negativa;<br />
4) contenuto in cellule somatiche: 1.000.000<br />
Nelle successive Figg. 14-16 sono riportati i grafici ottenuti attraverso l’impiego <strong>del</strong><br />
pacchetto Statistica 6.0 (StatSoft Inc.).<br />
L’analisi statistica ha consentito di evidenziare una riduzione <strong><strong>del</strong>la</strong> frazione corrispondente<br />
alla k-cas con il procedere <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione a vantaggio <strong>del</strong>le frazioni α s2 ed α s1 . Va detto<br />
che all’aumento <strong><strong>del</strong>la</strong> feazione α s1 (fig. 17) corrisponde, molto probabilmente, anche<br />
l’aumento di prodotti di degradazione (γ-cas e PP) che coeluiscono.<br />
43
Tabella 21 - Dati <strong>del</strong>l’analisi cromatoagrafica per le frazioni caseiniche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecora. Titolo nominale <strong>del</strong> purificato all’iniezione: 1000±50 µg/ml.<br />
Area % (Fluorimetro)<br />
Caso Progr. Matricola col_odp Emim. κ αs 2 αs 1 β tot<br />
7 13 A097823 VERDE sx 9,3 19,8 12,8 15,2 57,1<br />
3 6 VG354 ROSSO dx 8,9 16,0 24,4 15,1 64,4<br />
10 19 A098530 BLU sx 10,8 18,1 11,2 14,2 54,3<br />
2 4 VG359 BLU dx 11,0 19,6 10,4 15,0 56,0<br />
8 15 A0144325 BLU sx 8,3 15,6 35,7 13,7 73,3<br />
4 8 VG313 ROSSO dx 8,4 17,3 24,0 13,3 63,0<br />
3 5 VG354 ROSSO sx 8,1 17,3 40,0 15,4 80,8<br />
7 14 A097823 VERDE dx 8,8 18,2 12,5 14,8 54,3<br />
4 7 VG313 ROSSO sx 6,2 15,5 49,6 13,6 84,9<br />
1 2 MA2261 VERDE dx 10,0 15,2 11,3 21,2 57,7<br />
18 35 A097678 VERDE sx 8,4 16,5 8,9 17,3 51,1<br />
18 36 A097678 VERDE dx 9,7 16,1 12,1 20,3 58,2<br />
14 27 933487 ROSSO sx 7,9 15,4 30,2 11,4 64,9<br />
15 29 996582 ROSSO sx 9,2 14,1 29,7 13,9 66,9<br />
21 42 A0191248 ROSSO dx 9,1 14,3 39,2 16,5 79,1<br />
15 30 996582 ROSSO dx 10,3 16,1 32,6 9,5 68,5<br />
14 28 933487 ROSSO dx 10,4 15,0 32,2 15,9 73,5<br />
16 31 MA2251 VERDE sx 8,8 20,2 32,2 11,5 72,7<br />
12 23 A0144267 VERDE sx 8,3 22,5 34,6 14,6 80,0<br />
10 20 A098530 BLU dx 7,0 17,0 10,8 14,4 49,2<br />
24 47 A0227634 VERDE sx 5,3 17,6 35,9 14,9 73,7<br />
23 46 822715 ROSSO dx 11,9 20,2 7,6 15,8 55,5<br />
20 39 GR113 VERDE sx 9,6 20,7 6,8 22,0 59,1<br />
24 48 A0227634 VERDE dx 10,5 16,7 33,2 14,8 75,2<br />
26 51 VG031 ROSSO sx 5,0 18,8 6,6 15,9 46,3<br />
28 55 A098527 BLU sx 8,4 19,7 7,2 14,9 50,2<br />
25 49 A0227467 BLU sx 7,4 15,8 35,7 15,1 74,0<br />
23 45 822715 ROSSO sx 9,4 16,6 33,7 13,7 73,4<br />
25 50 A0227467 BLU dx 8,4 18,1 36,3 14,1 76,9<br />
28 56 A098527 BLU dx 7,8 20,9 9,9 12,0 50,6<br />
29 58 VG465 VERDE dx 10,5 15,6 8,5 14,5 49,1<br />
10 19 A097678 VERDE sx 8,1 10,1 12,0 17,8 48,0<br />
1 2 A0227634 VERDE dx 7,7 10,1 23,1 13,9 54,8<br />
1 1 A0227634 VERDE sx 9,9 17,3 8,4 14,5 50,1<br />
Concentrazione corretta per la risposta strumentale<br />
(µg/ml all’iniezione)<br />
Concentrazione relativa %<br />
κ αs 2 αs 1 β tot κ αs 2 αs 1 β<br />
119 198 128 304 749 16% 26% 17% 41%<br />
114 160 244 302 820 14% 20% 30% 37%<br />
138 181 112 284 715 19% 25% 16% 40%<br />
141 196 104 300 741 19% 26% 14% 40%<br />
106 156 357 274 893 12% 17% 40% 31%<br />
108 173 240 266 787 14% 22% 31% 34%<br />
104 173 400 308 985 11% 18% 41% 31%<br />
113 182 125 296 716 16% 25% 17% 41%<br />
79 155 496 272 1002 8% 15% 49% 27%<br />
128 152 113 424 817 16% 19% 14% 52%<br />
108 165 89 346 708 15% 23% 13% 49%<br />
124 161 121 406 812 15% 20% 15% 50%<br />
101 154 302 228 785 13% 20% 38% 29%<br />
118 141 297 278 834 14% 17% 36% 33%<br />
117 143 392 330 982 12% 15% 40% 34%<br />
132 161 326 190 809 16% 20% 40% 23%<br />
133 150 322 318 923 14% 16% 35% 34%<br />
113 202 322 230 867 13% 23% 37% 27%<br />
106 225 346 292 969 11% 23% 36% 30%<br />
90 170 108 288 656 14% 26% 16% 44%<br />
68 176 359 298 901 8% 20% 40% 33%<br />
153 202 76 316 747 20% 27% 10% 42%<br />
123 207 68 440 838 15% 25% 8% 53%<br />
135 167 332 296 930 14% 18% 36% 32%<br />
64 188 66 318 636 10% 30% 10% 50%<br />
108 197 72 298 675 16% 29% 11% 44%<br />
95 158 357 302 912 10% 17% 39% 33%<br />
121 166 337 274 898 13% 18% 38% 31%<br />
108 181 363 282 934 12% 19% 39% 30%<br />
100 209 99 240 648 15% 32% 15% 37%<br />
135 156 85 290 666 20% 23% 13% 44%<br />
104 101 120 356 681 15% 15% 18% 52%<br />
99 101 231 278 709 14% 14% 33% 39%<br />
127 173 84 290 674 19% 26% 12% 43%<br />
44
2 4 A098530 BLU dx 10,4 13,0 9,9 32,4 65,7<br />
8 15 MA2251 VERDE sx 7,1 9,9 6,3 46,0 69,3<br />
9 17 A098636 ROSSO sx 6,5 12,2 28,5 16,4 63,6<br />
8 16 MA2251 VERDE dx 8,9 23,8 34,7 18,0 85,4<br />
22 43 A098527 BLU sx 5,8 11,1 29,0 16,4 62,3<br />
22 44 A098527 BLU dx 8,8 13,4 27,7 34,5 84,4<br />
10 20 A097678 VERDE dx 7,8 13,6 28,7 19,9 70,0<br />
3 6 A0144311 BLU dx 7,0 9,1 25,0 20,3 61,4<br />
29 57 A0227382 BLU sx 7,0 9,5 20,5 17,5 54,5<br />
28 56 A098522 BLU dx 6,6 8,6 20,5 14,6 50,3<br />
27 54 A0227467 BLU dx 7,7 15,5 27,1 15,4 65,7<br />
27 53 A0227467 BLU sx 5,3 7,5 8,3 12,0 33,1<br />
13 26 VG354 ROSSO dx 6,4 8,0 21,0 16,6 52,0<br />
17 33 A097823 VERDE sx 7,3 10,2 21,4 17,1 56,0<br />
15 30 A0191248 ROSSO dx 5,8 9,2 27,2 15,0 42,2<br />
13 25 VG354 ROSSO sx 6,7 7,5 17,4 15,0 46,6<br />
30 60 A098527 BLU dx 5,0 14,0 27,1 15,0 61,1<br />
27 54 933526 ROSSO dx 9,0 15,5 20,2 16,6 44,7<br />
22 43 822715 ROSSO sx 8,2 13,1 20,5 24,3 66,1<br />
22 44 822715 ROSSO dx 9,0 14,6 22,4 17,5 46,0<br />
14 27 A097678 VERDE sx 7,6 11,4 22,8 18,0 59,8<br />
15 29 A0191248 ROSSO sx 8,3 10,3 22,3 17,4 58,3<br />
17 34 A097823 VERDE dx 8,5 10,3 21,9 16,2 56,9<br />
1 2 VG313 ROSSO dx 7,5 11,3 22,7 15,0 41,5<br />
1 1 VG313 ROSSO sx 6,8 11,2 21,2 14,7 53,9<br />
2 3 VG359 BLU sx 7,6 12,6 18,8 16,1 55,1<br />
24 47 VG031 ROSSO sx 6,5 22,0 31,7 17,9 78,1<br />
27 53 A098527 BLU sx 6,6 22,8 38,0 18,2 85,6<br />
21 41 A0191388 BLU sx 6,5 24,1 27,9 10,6 69,1<br />
3 6 VG359 BLU dx 6,4 21,5 29,2 16,9 74,0<br />
24 48 VG031 ROSSO dx 8,6 20,7 36,4 15,1 80,8<br />
25 49 A098522 BLU sx 10,3 17,5 32,1 14,8 74,7<br />
2 3 VG465 VERDE sx 8,0 25,1 33,6 18,8 85,5<br />
3 5 VG359 BLU sx 5,3 23,4 31,7 19,0 79,4<br />
9 18 MA2251 VERDE dx 8,4 25,5 34,6 16,8 85,3<br />
29 58 VG313 ROSSO dx 3,4 23,8 31,8 14,8 73,8<br />
13 26 MA2254 VERDE dx 7,0 21,5 33,3 22,2 84,0<br />
2 4 VG465 VERDE dx 6,9 24,2 34,5 20,7 86,3<br />
133 130 99 648 1010 13% 13% 10% 64%<br />
91 99 63 920 1173 8% 8% 5% 78%<br />
83 122 285 328 818 10% 15% 35% 40%<br />
114 238 347 360 1059 11% 22% 33% 34%<br />
74 111 290 328 803 9% 14% 36% 41%<br />
113 134 277 690 1214 9% 11% 23% 57%<br />
100 136 287 398 921 11% 15% 31% 43%<br />
90 91 250 406 837 11% 11% 30% 49%<br />
90 95 205 350 740 12% 13% 28% 47%<br />
85 86 205 292 668 13% 13% 31% 44%<br />
99 155 271 308 833 12% 19% 33% 37%<br />
68 75 83 240 466 15% 16% 18% 52%<br />
82 80 210 332 704 12% 11% 30% 47%<br />
94 102 214 342 752 12% 14% 28% 46%<br />
74 92 272 300 438 17% 21% 62% 0%<br />
86 75 174 300 635 14% 12% 27% 47%<br />
64 140 271 300 775 8% 18% 35% 39%<br />
115 155 202 332 472 24% 33% 43% 0%<br />
105 131 205 486 927 11% 14% 22% 52%<br />
115 146 224 350 485 24% 30% 46% 0%<br />
97 114 228 360 799 12% 14% 29% 45%<br />
106 103 223 348 780 14% 13% 29% 45%<br />
109 103 219 324 755 14% 14% 29% 43%<br />
96 113 227 300 436 22% 26% 52% 0%<br />
87 112 212 294 705 12% 16% 30% 42%<br />
97 126 188 322 733 13% 17% 26% 44%<br />
83 220 317 358 978 9% 22% 32% 37%<br />
85 228 380 364 1057 8% 22% 36% 34%<br />
83 241 279 212 815 10% 30% 34% 26%<br />
82 215 292 338 927 9% 23% 31% 36%<br />
110 207 364 302 983 11% 21% 37% 31%<br />
132 175 321 296 924 14% 19% 35% 32%<br />
103 251 336 376 1066 10% 24% 32% 35%<br />
68 234 317 380 999 7% 23% 32% 38%<br />
108 255 346 336 1045 10% 24% 33% 32%<br />
44 238 318 296 896 5% 27% 36% 33%<br />
90 215 333 444 1082 8% 20% 31% 41%<br />
88 242 345 414 1089 8% 22% 32% 38%<br />
45
18 36 933487 ROSSO dx 6,0 23,1 33,3 18,0 80,4<br />
4 7 A0191248 ROSSO sx 7,6 22,3 33,0 18,8 81,7<br />
18 35 933487 ROSSO sx 2,6 25,0 22,5 16,2 66,3<br />
19 37 MA2290 VERDE sx 6,3 24,4 34,6 21,3 86,6<br />
10 20 822715 ROSSO dx 6,6 23,8 31,8 3,6 65,8<br />
29 57 VG313 ROSSO sx 6,8 24,4 18,8 16,4 66,4<br />
14 28 A0143509 BLU dx 7,5 23,5 31,8 13,3 76,1<br />
13 25 MA2253 VERDE sx 8,0 22,3 34,3 17,5 82,1<br />
27 54 A098527 BLU dx 9,6 25,0 35,5 19,0 89,1<br />
1 2 VG465 VERDE dx 10,6 19,5 41,9 18,0 90,0<br />
22 43 VG313 ROSSO sx 5,1 20,8 28,9 19,1 73,9<br />
16 31 A098530 BLU sx 5,3 24,3 43,8 14,0 87,4<br />
3 5 MA2251 VERDE sx 6,0 21,7 40,2 15,8 83,7<br />
26 52 VG359 BLU dx 7,7 24,6 31,2 16,2 79,7<br />
12 24 A0191388 BLU dx 3,7 24,3 44,5 15,1 87,6<br />
29 57 933526 ROSSO sx 6,1 29,0 33,1 16,5 84,7<br />
29 58 933526 ROSSO dx 9,4 25,5 32,1 2,4 69,4<br />
26 51 VG359 BLU sx 5,2 27,3 35,6 16,8 84,9<br />
10 20 VG354 ROSSO dx 4,8 21,7 44,2 19,0 89,7<br />
1 1 VG465 VERDE sx 4,8 23,8 35,5 13,9 78,0<br />
10 19 VG354 ROSSO sx 3,4 22,8 42,8 18,9 87,9<br />
27 53 A0227634 VERDE sx 5,3 18,4 37,9 21,0 82,6<br />
16 32 A098530 BLU dx 6,1 26,6 37,9 13,7 84,3<br />
12 23 A0191388 BLU sx 3,8 23,5 44,2 17,8 89,3<br />
27 54 A0227634 VERDE dx 5,1 20,7 38,5 21,7 86,0<br />
14 27 A0191248 ROSSO sx 1,2 19,1 47,7 19,1 87,1<br />
20 40 822715 ROSSO dx 5,6 27,3 33,1 18,3 84,3<br />
28 56 A098527 BLU dx 3,6 24,7 36,2 18,9 83,4<br />
22 44 VG313 ROSSO dx 3,2 19,9 42,3 16,6 82,0<br />
5 10 996582 ROSSO dx 4,2 21,8 41,8 16,0 83,8<br />
5 9 996582 ROSSO sx 3,3 30,5 34,6 15,0 83,4<br />
77 231 333 360 1001 8% 23% 33% 36%<br />
97 223 330 376 1026 9% 22% 32% 37%<br />
33 250 225 324 832 4% 30% 27% 39%<br />
81 244 346 426 1097 7% 22% 32% 39%<br />
85 238 318 72 713 12% 33% 45% 10%<br />
87 244 188 328 847 10% 29% 22% 39%<br />
96 235 318 266 915 11% 26% 35% 29%<br />
103 223 343 350 1019 10% 22% 34% 34%<br />
123 250 355 380 1108 11% 23% 32% 34%<br />
136 195 419 360 1110 12% 18% 38% 32%<br />
65 208 289 382 944 7% 22% 31% 40%<br />
68 243 438 280 1029 7% 24% 43% 27%<br />
77 217 402 316 1012 8% 21% 40% 31%<br />
99 246 312 324 981 10% 25% 32% 33%<br />
47 243 445 302 1037 5% 23% 43% 29%<br />
78 290 331 330 1029 8% 28% 32% 32%<br />
121 255 321 48 745 16% 34% 43% 6%<br />
67 273 356 336 1032 6% 26% 35% 33%<br />
62 217 442 380 1101 6% 20% 40% 35%<br />
62 238 355 278 933 7% 26% 38% 30%<br />
44 228 428 378 1078 4% 21% 40% 35%<br />
68 184 379 420 1051 6% 18% 36% 40%<br />
78 266 379 274 997 8% 27% 38% 27%<br />
49 235 442 356 1082 5% 22% 41% 33%<br />
65 207 385 434 1091 6% 19% 35% 40%<br />
15 191 477 382 1065 1% 18% 45% 36%<br />
72 273 331 366 1042 7% 26% 32% 35%<br />
46 247 362 378 1033 4% 24% 35% 37%<br />
41 199 423 332 995 4% 20% 43% 33%<br />
54 218 418 320 1010 5% 22% 41% 32%<br />
42 305 346 300 993 4% 31% 35% 30%<br />
46
Tabella 22 – Statistiche di base <strong>del</strong>le frazioni caseiniche dei campioni di emimammella saggiati<br />
Concentrazione corretta per la risposta<br />
strumentale (µg/ml all’iniezione)<br />
Concentrazione relativa (%)<br />
κ αs 2 αs 1 β Tot. κ αs 2 αs 1 β<br />
Media 93,3 183,3 276,8 322,0 875,4 11,3% 21,1% 31,3% 36,3%<br />
DS 26,8 54,7 109,0 117,7 169,4 4,5% 5,6% 10,4% 11,8%<br />
SDR% 29% 30% 39% 37% 19% 39,5% 26,3% 33,3% 32,5%<br />
Min 15,4 75,0 63,0 0,0 436,2 1,4% 8,4% 5,4% 0,0%<br />
Max 152,6 305,0 496,0 920,0 1213,8 24,4% 34,3% 62,0% 78,4%<br />
Mediana 96,2 184,0 312,0 320,0 900,9 11,1% 21,6% 32,6% 36,5%<br />
25* p.le 76,9 144,5 207,5 290 747,9 7,9% 17,4% 28,1% 31,9%<br />
75° p.le 112,8 229,5 351 360 1011,1 14,0% 25,2% 37,9% 42,6%<br />
Figura 14 – Effetto <strong>del</strong> mese di campinamento e <strong>del</strong>l’ordine di parto sul valore <strong><strong>del</strong>la</strong> k:caseina nel <strong>latte</strong> ovino<br />
abc P
Figura 15 – Effetto <strong>del</strong> mese di campionamento e <strong>del</strong>l’Ordine di Parto sulla percentuale di α s2 caseina nel <strong>latte</strong> ovino<br />
abc P
Figura 16 – Effetto <strong>del</strong> mese di campionamento e <strong>del</strong>l’Ordine di Parto sulla percentuale di α s2 caseina nel <strong>latte</strong> ovino<br />
abc P
Figura 17 – analisi elettroforetica <strong>del</strong>l frazioni caseiniche isolate per HPLC effettuata su due campioni di <strong>latte</strong> ovino<br />
relativa ai mesi di marzo (cromatogramma a sinistra) e giugno (cromatogramma a destra).<br />
Dei due campioni saggiati, il cromatogramma <strong>del</strong> primo campione (marzo) è risultato<br />
nettamente migliore rispetto al secondo (mese di giugno) nel quale i picchi risultano poco<br />
risolti rispetto alla linea di base. Per quanto riguarda la frazione f1 (tempo d’eluizione<br />
caratteristico <strong><strong>del</strong>la</strong> κ-cas nelle condizioni cromatografiche utilizzate) l’elettroforesi mostra<br />
una sola banda evidente per entrambi i campioni (B17 e B19) con, tuttavia, differenze per<br />
quanto riguarda il peso molecolare. Per quanto riguarda invece le due frazioni f2 ed f3<br />
(corrispondenti rispettivamente alle frazioni α s2 ed α s1- cas) i pattern elettroforetici appaio<br />
relativamente differenti solo per la frazione α s2 che presenta due bande ravvicinate ma<br />
comunque con peso molecolare superiore a 30 kDa per il campione B17 e due bande<br />
caratterizzate da una migrazione elettroforetica nettamente differente per il campione B19<br />
dove compare una banda a meno di 20,1 kDa che potrebbe rappresentare un prodotto di<br />
50
degradazione (ad es. γ1-cas). Stessa valutazione può essere fatta per la quarta frazione<br />
(fl4) che analizzata elettroforeticamente produce nel campione B17 due bande distinte di<br />
cui una a meno di 14,4 kDa (peso molecolare compatibile con i proteoso peptoni) mentre<br />
nel campione B19 si osserva una sola banda attorno a 30 kDa.<br />
In conclusione si può affermare che una certa variabilità nella composizione in frazioni<br />
caseiniche è osservabile nel <strong>latte</strong> ovino in base al periodo <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione ed all’ordine di<br />
parte. Tali variazioni tendono a ridurre percentualmente soprattutto la frazione k-caseinica<br />
con un aumento <strong>del</strong>l’alfa caseina, con prbabili effetti diretti ed indiretti sulle caratteristiche<br />
reologiche. E’ probabile che diversi fattori concorrano a tale variazione, alcuni dei quali (ad<br />
esempio il management aziendale) dovranno essere attentamente valutati in occasione di<br />
ulteriori studi.<br />
51
4. VALUTAZIONE DELLA QUALITA’ DEL LATTE DI BUFALA<br />
3.1. Messa a punto conta differenziata cellule somatiche<br />
E’ stata affinata la messa a punto di metodi già in uso presso il laboratorio (conta<br />
differenziata <strong>del</strong>le cellule somatiche) confrontando i risultati <strong>del</strong>l’utilizzo di diversi tipi di<br />
colorazione. Inoltre, è stata curata la messa a punto di nuovi metodi (attività genetica).<br />
3.1.1. Metodo conta differenziata cellule somatiche<br />
Le diverse classi di cellule somatiche nel <strong>latte</strong> si evidenziano mediante osservazione<br />
microscopica di strisci sottili, colorati, comunemente , secondo la metodica di May-<br />
Grunwald o di Wright. Si tratta di colorazioni “panottiche”, basate, entrambe, sulla<br />
reazione di Sali di Eosina/Blu di Metilene con i vari costituenti acidi e basici <strong>del</strong>le cellule<br />
stesse (detti pertanto acidofili, basofili, policromatofili). Dette colorazioni consentono di<br />
distinguere con chiarezza sia le diverse classi di granulociti (cellule polinucleate), sia i<br />
linfociti (cellule mononucleate). Inequivocabili e oramai universalmente accettati, infatti,<br />
sono i parametri per il loro riconoscimento, basati su caratteristiche tintoriali e morfologiche<br />
ben evidenziabili con le metodiche di colorazione suddette. D’altro canto, tali cellule <strong>del</strong><br />
bufalo non si differenziano molto da quelle analoghe, presenti nel sangue umano, per le<br />
quali la conoscenza e la pratica di laboratorio sono consolidate da anni.<br />
Granulociti Neutrofili<br />
Nucleo plurilobato, citoplasma rosato con granulazioni rosa-lilla. Il nome è dato dal fatto che i<br />
granuli hanno affinità per i Sali neutri (esempio eosinato di blu di metilene, Fig. 18).<br />
Figura 18 – Granulociti neutrofili. Immagini acquisite presso i laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
52
Granulociti Eosinofili<br />
Polinucleati, con granuli citoplasmatici giallo-arancione ( affinità per l’eosina, Fig. 19).<br />
Figura 19 – Granulociti eosinofili. Immagine<br />
acquisita presso i laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
Linfociti<br />
Cellule rotonde, dimetro 7-9-micron, nucleo intensamente colorato, con cromatina a volte a zolle,<br />
citoplasma scarsissimo (Fig. 20).<br />
Figura 20 – Linfociti. Immagini acquisite presso i laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
Diverso è il caso, invece <strong>del</strong>le ultime due classi di cellule somatiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino: il macrofagi e<br />
le cellule epiteli. I dati esistenti in bibliografia per queste due ultime linee cellulari nel bufalo sono<br />
molto contraddittori e la loro morfologia è scarsamente descritta in letteratura. Nel nostro lavoro<br />
abbiamo fatto riferimento alla pubblicazione che ci è sembrata più completa in ordine alla<br />
descrizione morfologica <strong>del</strong>le cellule: Guarino et al. (1994), Valutazione quali-quantitativa <strong>del</strong>le<br />
cellule presenti nel <strong>latte</strong> di bufala, Atti <strong><strong>del</strong>la</strong> Società italiana <strong>del</strong>le scienze veterinarie , Volume XLVI<br />
In essa si afferma che i macrofagi rappresentano la grande maggioranza <strong>del</strong>le cellule somatiche <strong>del</strong><br />
<strong>latte</strong> sano di bufala nelle diverse fasi <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione. Essi sono descritti come cellule di diversi<br />
aspetti morfologici, soprattutto <strong>del</strong> citoplasma:<br />
53
• aspetto schiumoso : molteplici goccioline di grasso nel citoplasma;<br />
• aspetto ad anelo con castone: i globuli di grasso confluiscono in una cavità unica: il<br />
citoplasma è molto ridotto ed anche il nucleo di distingue difficilmente;<br />
• aspetto semplice: cellule prive di inclusioni lipidiche, con nucleo reniforme e<br />
citoplasma di colore azzurro chiaro.<br />
Figura 21 – Macrofagi nel <strong>latte</strong>. Immagini acquisite presso i laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
Per quanto riguarda le cellule epiteliali, esse sono descritte di forma ovale, circolare o poligonale, a<br />
limiti netti; citoplasma rosato, diametro 14-18 µm. Isolate o in gruppi di 2 o 3, nucleo centrale e<br />
sferico. Si esclude, quindi, la presenza di vacuoli nel citoplasma.<br />
L’evidenza scaturita dalle analisi effettuate, tuttavia, non concorda perfettamente con quella<br />
sopradescritta. Si rilevano infatti, quali cellule epiteliali, cellule analoghe a quelle descritte nel lavoro<br />
suddetto, ma con citoplasma vacuolato, nucleo non centrale, sempre isoalte e mai in gruppi.<br />
Cellule di tale specie, inoltre, si presentano in quantità assolutamente ridotta.<br />
Le loro caratteristiche non sono spiccatamente dissimili da quelle dei macrofagi, con possibilità di<br />
essere classificate facilmente come tali. In Figuta 22 è riportata un’immagine “tipo” di probabile<br />
cellula epiteliale, rilevata nei nostri strisci di <strong>latte</strong>.<br />
Figura 22 – Cellula epiteliale di bufala. Immagine<br />
acquisita presso i laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
54
Per tale motivo s’è proceduto ad effettuare una colorazione citochimica, che si basa<br />
sull’evidenziazione di esterasi specifiche presenti nel citoplasma dei macrofagi, ma non in quello<br />
<strong>del</strong>le cellule epiteliali <strong>del</strong> <strong>latte</strong>. La colorazione utilizzata è quella che evidenzia l”α-naftil acetato<br />
esterasi”, enzima presente in prevalenza nel citoplasma dei macrofagi. Il principio consiste nel<br />
fornire il substrato specifico per l’esterasi (naftil-acetato) e un sale di diazonio; l’azione <strong>del</strong>l’esterasi<br />
sul substrato libera naftolo, che, in presenza di sali di diazonio, precipita sotto forma di granuli neri.<br />
L’intento era di verificare la presenza o l’assenza di granuli neri nelle cellule di tipologia dubbia.<br />
La tecnica sperimentata ha dato risultati insufficienti alla risoluzione <strong>del</strong> problema (Fig. 23). La<br />
colorazione, infatti, evidenzia con chiarezza la presenza di macrofagi per le granulazioni nere <strong>del</strong><br />
citoplasma; tuttavia (forse a causa di un trattamento che risulta più aggressivo) le restanti cellule<br />
sono deformate, rotte, a volte con solo piccoli lembi di citoplasma, con difficoltà ad evidenziarne<br />
l’esatta morfologia.<br />
Figura 23 – Macrofagi nel <strong>latte</strong> alla colorazione selettiva per l’α-naftil acetato esterasi. Immagini acquisite presso i<br />
laboratori <strong>del</strong> CRA-ISZ.<br />
Per questo motivo, macrofagi e cellule epiteliali costituiscono un unico gruppo nelle nostre analisi.<br />
Sulla tipologia <strong>del</strong>le cellule somatiche in bibliografia sono riportati dati contraddittori. Il tipo cellulare<br />
dominante nel <strong>latte</strong> di bufala proveniente da mammelle sane sembra essere rappresentato dalle<br />
cellule epiteliali per Dhakal & Kapur (1991) o dai neutrofili per Silva & Silva (1994) o dai macrofagi<br />
secondo Guarino et al. (1994) o ancora dai linfociti seguiti immediatamente dai neutrofili (Piccinini<br />
et al., 2006). In caso di mastite, invece, è stato sempre osservato un aumento <strong><strong>del</strong>la</strong> percentuale dei<br />
neutrofili (Ranucci et al., 1988; Dhakal & Kapur, 1991; Guarino et al., 1994; Piccinini et al., 2006).<br />
I risultati ottenuti, come illustrato nelle tabelle riportate successivamente confermano i risultati<br />
ottenuti da Piccinini et al. (2006) e vale a dire che in caso di bufale non affette da mastite i linfociti<br />
sono il gruppo più numeroso, seguito a poca distanza dai neutrofili. Se le mammelle sono ammalate<br />
prevalgono i neutrofili.<br />
55
3.2. Analisi di qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino<br />
3.2.1. Materiali e metodi<br />
Individuazione allevamenti bufalini<br />
Sono stati individuati gli allevamenti di bufali rispondenti alle esigenze <strong><strong>del</strong>la</strong> sperimentazione:<br />
distribuzione <strong>del</strong>le aziende scelte su tutto il territorio <strong><strong>del</strong>la</strong> regione, per rispondere alla richiesta<br />
d’elevata variabilità genetica e presenza di un elevato numero di bufale partorite nello stesso<br />
periodo <strong>del</strong>l’anno.<br />
Allo scopo, sono state scelte quattro aziende bufaline localizzate nelle province di Latina, Frosinone,<br />
Viterbo e Rieti. I gruppi d’animali individuati per la prova, omogenei per stadio di lattazione e ordine<br />
di parto, sono stati sottoposti a prelievo di sangue per l’estrazione <strong>del</strong> DNA (attività genetica) e a a<br />
prelievi di <strong>latte</strong> a partire da 30±10 giorni di lattazione.<br />
Tabella 23 – Parametri e metodiche impiegate per la valuta\zione <strong>del</strong> qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino<br />
Parametri<br />
Grasso, proteina e lattosio<br />
Caseina<br />
Urea<br />
Acidità<br />
Attitudine alla coagulazione<br />
Conta totale cellule somatiche<br />
Conta differenziale cellule<br />
somatiche<br />
Esame batteriologico<br />
Cloruri<br />
Carica batterica totale<br />
Infrarosso<br />
Kjeldhal<br />
Metodiche<br />
pHmetria differenziale<br />
pHmetria<br />
Lattodinamografia<br />
Metodo microscopico, citometria di flusso optofluoroelettronica e<br />
metodo CCD camera<br />
Metodo microscopico<br />
Metodo microbiologico e tipizzazione fenotipica<br />
Metodo titrimetrico<br />
Citometria di flusso optofluoroelettronica<br />
Piano sperimentale per la valutazione <strong><strong>del</strong>la</strong> qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino<br />
L’ndagine condotta presso quattro aziende bufaline (province di Frosinone, Latina, Rieti e Viterbo)<br />
su gruppi di animali partoriti nell’arco di 38 giorni ha previsto:<br />
tre controlli durante la lattazione di cui il primo a 30±9 giorni di lattazione, il secondo a a 113±9<br />
giorni di lattazione ed il terzo controllo a 174±9 giorni dall’inizio <strong><strong>del</strong>la</strong> lattazione. Il prelievo è stato<br />
effettuato durante la mungitura de <strong>del</strong> mattino ed è stata misurata la quantità di <strong>latte</strong> prodotto.<br />
56
Analisi effettuate<br />
Sui campioni di <strong>latte</strong> bufalino sono state effettute le seguenti determinazioni (Tab. 23) sono<br />
indicati anche i metodi)<br />
Le analisi chimico-fisiche, la carica batterica e la lattodinamografia sono state eseguite dall’ISZ in<br />
collaborazione con il Laboratorio Standard Latte (LSL) <strong>del</strong>l’AIA, come previsto, la conta <strong>del</strong>le cellule<br />
somatiche con il metodo optofluorometrico è stata effettuata dal LSL, mentre la conta microscopica<br />
totale e quella differenziata sono state eseguite dall’ISZ. L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale<br />
(IZS) ha effettuato l’analisi batteriologica per la ricerca dei microrganismi responsabili di patologie<br />
<strong><strong>del</strong>la</strong> mammella.<br />
3.2.2. Risultati<br />
Nelle Tabelle 24 - 39, riportate di seguito, si possono osservare i risultati <strong>del</strong>le analisi effettuate.<br />
Di seguito vengono riassunti sinteticamente i risultati ottenuti.<br />
Stadio di lattazione<br />
A fine lattazione, oltre alla diminuzione <strong><strong>del</strong>la</strong> produzione ed all’incremento <strong>del</strong> contenuto di grasso e<br />
proteina, sono da evidenziare:<br />
• Diminuzione <strong>del</strong>l’indice di caseina, ma aumento <strong>del</strong> contenuto totale di caseina<br />
• Diminuzione <strong>del</strong> pH<br />
• Aumento <strong><strong>del</strong>la</strong> consistenza <strong>del</strong> coagulo<br />
• Incremento <strong>del</strong>le cellule somatiche<br />
• Non varia il contenuto di neutrofili<br />
• Leggero decremento <strong>del</strong> contenuto di lattosio<br />
• La positività agli agenti mastitogeni non è elevata (11%) e prevalgono i patogeni<br />
Aziende<br />
Elevata variabilità <strong>del</strong> contenuto di cellule somatiche che si ripercuote sulle caratteristiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong>;<br />
i tempi di coagulazione e di rassodamento <strong>del</strong> coagulo si allungano quando il contenuto di cellule<br />
somatiche è elevato<br />
In concomitanza <strong>del</strong> maggior numero di cellule somatiche si osserva anche la più elevata % di<br />
neutrofili e la maggiore presenza di patogeni<br />
57
Tabella 24 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).<br />
Prelievo N.<br />
Giorni di<br />
lattazione<br />
Produzione<br />
(mungitura<br />
mattina, l)<br />
Grasso (%) Proteina (%) Caseina (%)<br />
Indice caseina<br />
(%)<br />
Lattosio (%)<br />
resa stimata<br />
mozzarella<br />
( kg)<br />
1°,2°,3° 140 102 ± 60 5,4 ± 2,0 7,47 ± 1,54 4,51 ± 0,42 3,62 ± 0,43 81,43 ± 4,31 4,78 ± 0,31 1,27 ± 0,42<br />
1° 50 30 ± 9 6,5 ± 2,2 6,57 ± 1,10 4,47 ± 0,47 3,52 ± 0,58 81,16 ± 2,84 4,85 ± 0,23 1,45 ± 0,44<br />
2° 46 113 ± 9 5,6 ± 1,6 7,53 ± 1,44 4,31 ± 0,32 3,58 ± 0,29 83,14 ± 2,99 4,88 ± 0,20 1,28 ± 0,43<br />
3° 44 174 ± 9 3,9 ± 1,1 8,44 ± 1,50 4,74 ± 0,35 3,77 ± 0,38 79,54 ± 5,74 4,62 ± 0,40 1,03 ± 0,30<br />
Tabella 25 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).<br />
Prelievo<br />
Cellule somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(citometria di<br />
flusso)<br />
Cellule<br />
somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(microscopia)<br />
Neutrofili (%) Linfociti (%) Macrofagi (%)<br />
Esame<br />
batteriologico<br />
(% campioni<br />
analizzati)<br />
Carica batterica<br />
totale<br />
(ufc*10 3 /ml)<br />
1°, 2°, 3° 259 ± 666 314 ± 717 49 ± 20 38 ± 18 13 ± 12 22 409 ± 646<br />
1° 135 ± 345 218 ± 276 48 ± 22 38 ± 20 15 ± 12 34* 326 ± 397<br />
2° 206 ± 426 195 ± 223 52 ± 20 37 ± 18 11 ± 9 18** 237 ± 298<br />
3° 449 ± 1016 516 ±1143 46 ±19 39 ± 18 15 ± 13 11** 677 ± 972<br />
*nel primo prelievo prevalgono gli agenti mastitogeni ambientali (~ 90%).<br />
**nel secondo e terzo prelievo prevalgono gli agenti mastitogeni patogeni (~ 80%).<br />
58
Tabella 26 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).<br />
Prelievo<br />
pH<br />
Tempo di<br />
coagulazione<br />
r (min)<br />
Tempo di<br />
rassodamento<br />
k20 (min)<br />
Consistenza<br />
coagulo a 30'<br />
A30 (mm)<br />
Consistenza coagulo<br />
al doppio di r<br />
A2r (mm)<br />
Urea<br />
(mg/dl)<br />
Indice<br />
crioscopico (°C)<br />
1°, 2°, 3° 6,67 ± 0,10 20,64 ± 6,01 2, 26 ± 1, 25 41,49 ± 10,85 50,163 ± 7,83 40,04 ± 9,73 -0,523 ± 0,027<br />
1° 6,73 ± 0,10 19,71 ± 5,33 2,51 ± 0,87 38,82 ± 9,17 46,04 ± 5,78<br />
37,47 ±<br />
10,52<br />
-0,509 ± 0,074<br />
2° 6,68 ± 0,08 20,97 ± 5,56 2,36 ± 1,43 39,72 ± 10,95 48,50 ± 6,40 40,03 ± 9,76 -0,526 ± 0,006<br />
3° 6,61 ± 0,10 21,05 ± 7,04 1,92 ± 1,25 45,51 ± 11,05 55,364 ± 8,04 41,99 ± 8,81 -0,524 ± 0,006<br />
Tabella 27- Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).<br />
Azienda N.<br />
Produzione<br />
mungitura<br />
mattina (l)<br />
Grasso<br />
(%)<br />
Proteina<br />
(%)<br />
Caseina<br />
(%)<br />
Indice caseina<br />
(%)<br />
Lattosio<br />
(%)<br />
Resa stimata<br />
mozzarella<br />
( kg)<br />
1 25 6,2 ± 1,9 7,35 ± 1,32 4,28 ± 0,32 3,52 ± 0,31 82,88 ± 3,37 4,88 ± 0,21 1,35 ± 0,46<br />
2 36 5,2 ± 2,0 7,19 ± 1,13 4,56 ± 0,55 3,65 ± 0,63 83,05 ± 3,04 4,90 ± 0,23 1,21 ± 0,41<br />
3 43 5,1 ± 1,3 8,25 ± 1,22 4,62 ± 0,30 3,77 ± 0,22 80,99 ± 3,55 4,77 ± 0,12 1,28 ± 0,27<br />
4 36 5,3 ± 2,6 6,92 ± 2,01 4,46 ± 0,42 3,55 ± 0,40 79,53 ± 5,44 4,60 ± 0,44 1,22 ± 0,57<br />
59
Tabella 28 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).<br />
Azienda<br />
Cellule<br />
somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(citometria di<br />
flusso)<br />
Cellule somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(microscopia)<br />
Neutrofili<br />
(%)<br />
Linfociti<br />
(%)<br />
Macrofagi<br />
(%)<br />
Esame<br />
batteriologico<br />
(% campioni<br />
analizzati)<br />
Cloruri<br />
(mg/ml)<br />
Carica batterica<br />
totale<br />
(ufc*103/ml)<br />
1 175 ± 172 204 ± 193 52 ± 18 32 ± 15 16 ± 13 8* 0,695 ± 0,158 1065 ± 1205<br />
2 68 ± 119 142 ± 118 36 ± 17 53 ± 17 12 ± 8 30* 0,613 ± 0,135 155 ± 245<br />
3 56 ± 72 128 ± 66 43 ± 17 41 ± 14 16 ± 18 19* 0,585 ± 0,107 278 ± 310<br />
4 761 ± 1175 708 ± 1245 61 ± 18 29 ± 16 11 ± 6 31** 1,066 ± 0,421 401 ± 412<br />
* nelle prime tre aziende sono presenti solo agenti mastitogeni ambientali.<br />
** nella quarta azienda sono presenti solo agenti mastitogeni patogeni.<br />
Tabella 29 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).<br />
Azienda<br />
pH<br />
Tempo di<br />
coagulazione<br />
r (min)<br />
Tempo di<br />
rassodamento<br />
k20 (min)<br />
Consistenza<br />
coagulo a 30'<br />
A30 (mm)<br />
Consistenza<br />
coagulo al<br />
doppio di r<br />
A2r (mm)<br />
Urea (mg/dl)<br />
Indice<br />
crioscopico (°C)<br />
1 6,66 ± 0,13 17,84 ± 5,61 2,12 ± 0, 51 40,08 ± 9,48 44,14 ± 4,40 32,44 ± 8,18 -0,524 ± 0,005<br />
2 6,64 ± 0,11 18,94 ± 3,29 2,14 ± 0,73 44,40 ± 7,79 49,10 ± 5,91 44,83 ± 11,98 -0,525 ± 0,009<br />
3 6,67 ± 0,05 21,66 ± 2,55 1,75 ± 0,53 44,21 ± 10,43 57,70 ± 5,20 39,81 ± 5,27 -0,525 ± 0,006<br />
4 6,71 ± 0,10 23,74 ± 8,70 2,94 ± 2,06 36,33 ± 13,67 49,07 ± 8,84 40,29 ± 7,84 -0,518 ± 0,052<br />
60
Tabella 30 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).<br />
Classi di<br />
cellule<br />
somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
N. (%)<br />
Giorni di<br />
lattazione<br />
Produzione<br />
mungitura<br />
mattina (l)<br />
Grasso<br />
(%)<br />
Proteina<br />
(%)<br />
Caseina<br />
(%)<br />
Indice caseina<br />
(%)<br />
Lattosio<br />
(%)<br />
Resa stimata<br />
mozzarella<br />
( kg)<br />
< 200 71 99 5,5 7,49 4,54 3,66 81,79 4,87 1,31<br />
200 ÷ 399 15 111 5,5 7,43 4,35 3,52 81,39 4,73 1,27<br />
≥ 400 14 109 4,3 7,42 4,49 3,58 79,90 4,39 1,00<br />
Tabella 31 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).<br />
Classi di<br />
cellule<br />
somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
Cellule<br />
somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(citometria di<br />
flusso)<br />
Cellule somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(microscopia)<br />
Neutrofili<br />
(%)<br />
Linfociti<br />
(%)<br />
Macrofagi<br />
%)<br />
Esame<br />
batteriologico<br />
(% campioni<br />
analizzati)<br />
Cloruri<br />
(mg/ml)<br />
Carica batterica<br />
Totale<br />
(ufc*10 3 /ml)<br />
< 200 48 119 41 45 14 22* 0,611 307<br />
200 ÷ 399 300 304 58 30 11 26** 0,760 648<br />
≥ 400 1524 1210 71 16 13 28** 1,154 734<br />
* nelle prima classe sono presenti circa il 5% di agenti mastitogeni patogeni.<br />
** nelle seconda e terza classe sono presenti il 100% di agenti mastitogeni patogeni.<br />
61
Tabella 32 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).<br />
Classi di<br />
cellule<br />
somatiche<br />
(*103/ml)<br />
pH<br />
Tempo di<br />
coagulazione<br />
r (min)<br />
Tempo di<br />
rassodamento<br />
k20 (min)<br />
Consistenza<br />
coagulo a 30'<br />
A30 (mm)<br />
Consistenza<br />
coagulo al<br />
doppio di r<br />
A2r (mm)<br />
Urea<br />
(mg/dl)<br />
Indice<br />
crioscopico<br />
(°C)<br />
< 200 6,66 19,81 2,03 43,56 50,99 39,73 -0,524<br />
200 ÷ 399 6,66 21,32 2,80 36,13 46,34 41,15 -0,527<br />
≥ 400 6,72 24,25 2,84 36,05 50,16 40,31 -0,530<br />
Tabella 33 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).<br />
Classi di carica<br />
atterica totale<br />
ufc*10 3 /ml)<br />
N. (%)<br />
Giorni di<br />
lattazione<br />
produzione<br />
mungitura<br />
mattina (l)<br />
Grasso<br />
(%)<br />
Proteina<br />
(%)<br />
Caseina<br />
(%)<br />
Indice<br />
caseina<br />
(%)<br />
Lattosio<br />
(%)<br />
Resa stimata<br />
mozzarella<br />
( kg)<br />
< 100 31 103 5,9 7,22 4,47 3,67 82,31 4,90 1,36<br />
100 ÷ 199 22 102 5,4 7,60 4,51 3,95 89,33 4,83 1,27<br />
200 ÷ 499 24 87 5,0 7,42 4,53 3,60 81,98 4,78 1,15<br />
≥ 500 22 118 5,0 7,78 4,53 3,62 80,18 4,53 1,23<br />
62
Tabella 34 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).<br />
Classi di carica<br />
batterica totale<br />
(ufc*10 3 /ml)<br />
Cellule somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(citometria di<br />
flusso)<br />
Neutrofili<br />
(%)<br />
Linfociti<br />
(%)<br />
Macrofagi<br />
(%)<br />
Cloruri<br />
(mg/ml)<br />
Carica batterica totale<br />
(ufc*10 3 /ml)<br />
< 100 158 42 45 14 0,629 48<br />
100 ÷ 199 110 50 41 9 0,626 137<br />
200 ÷ 499 143 53 32 15 0,611 324<br />
≥ 500 725 56 29 15 0,830 1382<br />
Tabella 35 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).<br />
Classi di carica<br />
atterica totale<br />
ufc*10 3 /ml)<br />
pH<br />
Tempo di<br />
coagulazione<br />
r (min)<br />
Tempo di<br />
rassodamento<br />
k20 (min)<br />
Consistenza<br />
coagulo a 30'<br />
A30 (mm)<br />
Consistenza<br />
coagulo al<br />
doppio di r<br />
A2r (mm)<br />
Urea<br />
(mg/dl)<br />
< 100 6,66 19,06 2,17 43,53 49,73 41,17<br />
100 ÷ 199 6,68 20,93 2,16 41,43 52,10 39,83<br />
200 ÷ 499 6,70 22,85 2,68 37,39 50,59 38,95<br />
≥ 500 6,64 20,61 2,04 42,35 48,02 39,52<br />
Indice<br />
crioscopico °C<br />
-0,526<br />
-0,524<br />
-0,525<br />
-0,526<br />
63
Tabella 36 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie ±<br />
deviazione standard).<br />
Agenti<br />
mastitogeni<br />
N. (%)<br />
Giorni di<br />
lattazione<br />
Produzione<br />
mungitura<br />
mattina (l)<br />
Grasso<br />
(%)<br />
Proteina<br />
(%)<br />
Caseina<br />
(%)<br />
Indice caseina<br />
(%)<br />
Lattosio<br />
(%)<br />
Negativi 78 108 ± 63 5,3 ± 1,9 7,64 ± 1,54 4,55 ± 0,40 3,66 ± 0,42 81,79 ± 3,93 4,79 ± 0,24<br />
Ambientali (S.<br />
uberis, S. coag.<br />
neg.)<br />
Patogeni (S. aureus,<br />
S. agalactiae)<br />
13 43 ± 32 5,6 ± 2,0 6,78 ± 1,18 4,44 ± 0,54 3,57 ± 0,53 81,03 ± 2,95 4,84 ± 0,28<br />
9 122 ± 56 4,9 ± 3,0 7,51 ± 2,45 4,43 ± 0,51 3,43 ± 0,49 76,90 ± 7,13 4,32 ± 0,54<br />
Tabella 37 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie<br />
± deviazione standard).<br />
Agenti mastitogeni<br />
cellule somatiche<br />
(*10 3 /ml)<br />
(citometria di flusso)<br />
Neutrofili<br />
(%)<br />
Linfociti<br />
(%)<br />
Macrofagi<br />
(%)<br />
Cloruri<br />
mg/ml)<br />
Carica batterica<br />
Totale<br />
(ufc*10 3 /ml)<br />
Negativi 204 ± 435 49 ± 20 37 ± 17 14 ± 13 0,678 ± 0,206 448 ± 717<br />
Ambientali (S. uberis, S. coag. neg. ) 25 ± 25 33 ± 12 54 ± 10 14 ± 12 0,608 ± 0,129 3701 ± 404<br />
Patogeni (St. aureus, Str. agalactiae) 1279 ± 1705 65 ± 11 24 ± 10 10 ± 4 1,226 ± 0,476 601 ± 510<br />
64
Tabella 38 - Caratteristiche chimico-fisiche, <strong>igienico</strong>-sanitarie e tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie ±<br />
deviazione standard).<br />
Agenti mastitogeni<br />
pH<br />
Tempo di<br />
Coagulazione<br />
r (min’)<br />
Tempo di<br />
assodamento<br />
k20 (min)<br />
Consistenza<br />
coagulo a 30'<br />
A30 (mm)<br />
Consistenza<br />
coagulo al<br />
doppio di r<br />
A2r (mm)<br />
Urea<br />
(mg/dl)<br />
Indice<br />
rioscopico °C<br />
Negativi 6,66 ± 0,10 20,38 ± 5,37 2,18 ± 1,24 42,02 ± 11,54 51,09 ± 7,52 38,78 ± 8,59 -0,521 ± 0,031<br />
Ambientali (S. uberis, S.<br />
coag. neg.)<br />
Patogeni (S. aureus, S.<br />
agalactiae)<br />
6,71 ± 0,11 19,73 ± 3,50 2,37 ± 0,64 39,46 ± 7,34 48,00 ± 7,57 42,30 ± 15,15 -0,528 ± 0,008<br />
6,73 ± 0,12 27,89 ± 11,64 3,14 ± 2,09 34,89 ± 11,62 48,16 ± 14,07 40,24 ± 7,45 -0,529 ± 0,005<br />
Tabella 39 - Produzione, caratteristiche chimico-fisiche e tempo di coagulazione <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala a fine lattazione e con diversi contenuti di cellule somatiche.<br />
Produzione<br />
mungitura<br />
mattina (l)<br />
Lattosio<br />
(%)<br />
Indice caseina<br />
(%)<br />
pH<br />
tempo di<br />
coagulazione<br />
r (min)<br />
Neutrofili<br />
(%)<br />
Cloruri<br />
(mg/ml)<br />
Positività<br />
3° prelievo 3,9 ± 1,1 4,62 ± 0,40 79,54 ± 5,74 6,61 ± 0,10 21,05 ± 7,04 46 ±19 0,832 ± 0,332 11*<br />
Cellule somatiche<br />
200 ÷ 399 (*10 3 /ml)<br />
5,5 4,73 81,39 6,66 21,32 58 0,760 26**<br />
Cellule somatiche<br />
≥ 400 (*10 3 /ml)<br />
* 80% di agenti mastitogeni patogeni.<br />
**100% di agenti mastitogeni patogeni.<br />
4,3 4,39 79,90 6,72 24,25 71 1,154 28**<br />
65
Cellule somatiche<br />
Quando le cellule somatiche sono tra 200.000 e 400.000/ml (15% dei campioni) non ci sono<br />
effetti rilevanti sulla produzione e sulla qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
Indicatori<br />
• Gli agenti mastitogeni presenti (26% dei campioni) sono tutti patogeni<br />
• La % di neutrofili è superiore al 50%<br />
• Il contenuto di lattosio e cloruri varia rispetto ai campioni contenenti meno di 200.000<br />
cellule somatiche/ml<br />
Quando le cellule somatiche sono superiori a 400.000/ml (14% dei campioni) si hanno i<br />
seguenti effetti sulla produzione e qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong>:<br />
• La produzione di <strong>latte</strong> diminuisce di circa un quarto rispetto a quella osservata per contenuti<br />
di cellule somatiche inferiori<br />
• La resa giornaliera stimata in mozzarella è inferiore di circa un quarto<br />
• L’indice di caseina è inferiore all’80%<br />
• Il tempo di coagulazione si allunga di circa quattro minuti<br />
Indicatori<br />
• Gli agenti mastitogeni presenti (28% dei campioni) sono tutti patogeni<br />
• Il pH è maggiore di 6,7<br />
• Il lattosio è inferiore a 4,5%<br />
• Il contenuto di cloruri è superiore a 1 mg/ml<br />
• Il contenuto di neutrofili è superiore al 60%<br />
Esame batteriologico<br />
In presenza di agenti mastitogeni patogeni si osserva che:<br />
• La produzione di <strong>latte</strong> è inferiore<br />
• L’indice di caseina è inferiore all’80%<br />
• Il tempo di coagulazione è più elevato<br />
• Il pH è maggiore di 6,7<br />
• Il lattosio è inferiore a 4,5%<br />
• Il contenuto di cloruri è superiore a 1 mg/ml<br />
• Il contenuto di neutrofili è superiore al 60%<br />
66
In concomitanza di un’elevata carica batterica (> 500.000/ml) si osserva anche un elevato<br />
numero di cellule somatiche (725.000/ml). Il numero medio di giorni di lattazione è più elevato<br />
e quindi si tratta prevalentemente dei campioni <strong>del</strong> terzo prelievo, che è stato effettuato in<br />
estate, quando le temperature elevate concorrono all’innalzamento <strong><strong>del</strong>la</strong> carica batterica.<br />
3.2.3. Conclusioni<br />
Le caratteristiche <strong>igienico</strong>-sanitarie <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di bufala variano, come atteso, in funzione <strong>del</strong>lo<br />
stadio di lattazione e <strong>del</strong>l’azienda. Il contenuto di cellule somatiche si conferma come indicatore<br />
attendibile per valutare la presenza di mastiti subcliniche nel <strong>latte</strong> di bufala.<br />
Sono state individuate due soglie di criticità per le cellule somatiche: >200.000/ml e<br />
>400.000/ml<br />
>200.000/ml<br />
• Alcuni indicatori di mastite sono positivi<br />
• Produzione e qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> non variano<br />
>400.000/ml<br />
• Tutti gli indicatori sono positivi<br />
• Produzione e qualità <strong>del</strong> <strong>latte</strong> variano<br />
Tali risultati suggeriscono come sia auspicabile effettuare controlli più accurati sulla mammella<br />
quando il contenuto di cellule somatiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> supera 200.000/ml, mentre, per il pagamento<br />
secondo qualità, dagli effetti osservati sulla produzione e sulle caratteristiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong>, è<br />
consigliabile adottare una franchigia di 400.000/ml<br />
3.3. Analisi genetica<br />
L’identificazione il genotipo <strong>del</strong>le bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova è stato effettuao in due regioni <strong>del</strong> gene<br />
NRAMP1 - (natural-resistance-associated macrophage protein), gene che condiziona la fase<br />
iniziale <strong>del</strong>le infezioni cellulari batteriche, in quanto controlla la proliferazione microbica negli<br />
organi reticolo-endoteliali attraverso una serie di effetti pleiotropici che regolano l'attivazione dei<br />
macrofagi e quindi la suscettibilità alle malattie infettive. Il gene è stato sequenziato da autori<br />
67
diversi nel cervo, nella pecora, nel bovino e nella bufala. Nella regione 3’ non codificante la<br />
proteina (cioè trascritta nell’mRNA ma non tradotta) il gene ha una particolarità: è presente una<br />
sequenza microsatellite ripetuta (GT)n altamente polimorfa e informativa che è stata<br />
evidenziata nella pecora e nel cervo. Nel bovino e nel bufalo, nella stessa regione, i microsatelliti<br />
(GT)n sono tre, lontani l’uno dall’altro rispettivamente di 63 e di 24 nucleotidi. Un recente<br />
lavoro di Borriello & Iannelli (2006) afferma che i bufali per presentano nel genoma un numero<br />
maggiore di ripetizioni (GT)n sono resistenti alla brucellosi.<br />
Approfondimento <strong><strong>del</strong>la</strong> struttura genomica <strong><strong>del</strong>la</strong> regione 3’ contenente i<br />
microsatelliti.<br />
Questa regione è stata sequenziata in 12 buufale. Si è evidenziato che il primo microsatellite<br />
(MIC-1) contiene una seqeunza di (GT)12 oppure (GT)16; il secondo di (GT) 6; il terzo (MIC-<br />
2) di (GT)14 oppure (GT)15. Prima di avere a disposizione i campioni di DNA <strong>del</strong>le bufale <strong>del</strong><br />
PRAL, poichè il sequenziamento diretto comporta un’ analisi lunga e costosa, e poichè il<br />
sequenziatore <strong>del</strong> nostro laboratorio è dotato di una procedura veloce (GeneScan) per<br />
determinare la dimensione di ogni frammento, prima di sequenziarlo, abbiamo analizzato con<br />
quest’ultima 76 bufale di Tor Mancina ai due microsatelliti che si erano mostrati polimorfi al<br />
punto 1, cioè MIC-1 e MIC-2. E’ risultato che:<br />
• gli animali omozigoti con (GT)16 al MIC-1 erano sempre omozigoti (GT)14 al MIC-2;<br />
• gli animali omozigoti con (GT)12 al MIC-1 erano sempre omozigoti (GT)15 al MIC-2;<br />
• gli animali eterozigoti (GT)12 (GT)16 al MIC-1 erano sempre eterozigoti (GT)14<br />
(GT)15 al MIC-2.<br />
Di tre soggetti (uno per ogni genotipo MIC-1 MIC-2) sono stati sequenziati tutti gli esoni (15) e<br />
parte <strong>del</strong>le rispettive regioni fiancheggianti (circa 5400 nucleotidi sequenziati) fino alla regione<br />
promotrice 5’. Sono state evidenziate le seguenti 8 mutazioni puntiformi:<br />
Tabella 40 – mutazioni evidenziate per bufale di genotipo MIC-1 e MIC-2<br />
Porzione <strong>del</strong> gene N. mutazioni Posizione nel gene<br />
regione 5’ (promotore) 2 87 nt a monte <strong>del</strong>l’ATG.<br />
introne 1 3<br />
esone 3 1 non cambia aa<br />
esone 4 1 non cambia aa<br />
introne 6 1<br />
introne 7 1<br />
68
Le sequenze <strong>del</strong> gene NRAMP1 nella bufala sono state pubblicate su GeneBank (NCBI) con i<br />
seguenti numeri di accessione:<br />
• DQ390205S1 (esoni 1 e 2 e parziale cds)<br />
• DQ441408 (esoni 7 e 8 e parziale cds)<br />
• DQ390205S2 (esoni 14 e 15 e parziale cds)<br />
Si è deciso quindi di genotipizzare tutte le bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova PRAL per la mutazione <strong><strong>del</strong>la</strong><br />
regione 5’ in quanto le altre mutazioni trovate sono localizzate negli introni oppure in posizioni<br />
nell’esone che non comportano la codifica di un diverso amino acido. Sono state sequenziate<br />
tutte le bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova, con l’obiettivo di fare un’analisi statistica di associazione tra i<br />
polimorfismi individuati nel promotore <strong>del</strong> gene e la conta <strong>del</strong>le cellule somatiche, nonché<br />
l'insorgere di patologie (mastiti in particolare) e gli altri parametri fenotipici rilevati. Tutte le<br />
bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova PRAL sono state tipizzate anche al microsatellite MIC1 al fine di procedere<br />
come sopra, correlando i genotipi trovati con i parametri fenotipici. E’ stata messa a punto una<br />
procedura veloce sul DHPLC per identificare i genotipi al MIC-1, senza così dovere ricorrere al<br />
sequenziamento diretto. Questo sistema utilizza una tecnica separativa in grado di risolvere,<br />
separandoli, i componenti di una miscela (nel caso specifico molecole di DNA). La separazione si<br />
basa sulle diverse velocità che le molecole hanno in una specifica colonna cromatografica: tale<br />
velocità è data dall’effetto combinato di temperatura, tamponi e tipo di sequenza. Il DHPLC<br />
permette di avere una grande precisione analitica – cioè di evidenziare, in una sequenza anche<br />
sconosciuta, la presenza di almeno un allele allo stato eterozigote. Abbiamo disegnato i primer<br />
per amplificare le due regioni <strong>del</strong> gene NRAMP1 contenenti i due polimorfismi già da noi<br />
identificati nella specie bufalina: 1. polimorfismo A/G nella regione 5’ <strong>del</strong> gene; 2. dimensione<br />
<strong>del</strong> microsatellite MIC1 nella regione 3’ <strong>del</strong> gene. Di seguito sono riportati i profili dei diversi<br />
genotipo ottenuti da analisi in DHPLC.<br />
Figura 24 – Regione 5’, omozigote AA (bufala 2507, azienda Tor mancina)<br />
69
Figura 25 – Regione 5’, omozigote GG (bufala 3001, azienda Tor mancina)<br />
Figura 26 – Regione 5’, eterozigote AG (bufala 2777, azienda Tor mancina)<br />
Gli omozigoti AA e GG hanno un picco d’eluizione identico. Per tipizzare tutti i soggetti<br />
omozigoti, l’analisi è stata ripetuta mescolando i prodotti di PCR di ciascun omozigote con<br />
ciascuno dei due omozigoti noti; in questo modo si otteneva un profilo uguale a quello<br />
<strong>del</strong>l’omozigote quando i due campioni avevano lo stesso genotipo, uguale a quello<br />
<strong>del</strong>l’eterozigote quando i campioni avevano genitipo diverso.<br />
Figura 27 – Regione 3’, microsatelliti con 12 ripetizioni o 16 ripetizioni (alleli 12 e 16) allo stato omozigote<br />
I due alleli, allo stato omozigote, sono distinguibili dal diverso tempo di eluizione in quanto il<br />
70
frammento più corto eluisce prima <strong>del</strong> frammento lungo.<br />
Figura 28 – Regione 3’, campione eterozigote al microsatellite (genotipo 1216)<br />
Figura 29 – Regione 3’, campione eterozigote al microsatellite (genotipo 912)<br />
Di tutte le bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova PRAL è stato individuato il genotipo ai due loci indicati: gtyp-5'<br />
egtyp-mic1 con la tecnica DHPLC sopra descritta, e con conferma <strong>del</strong> genotipo di una parte dei<br />
campioni tramite sequenziamento diretto; i genotipi sono riportati nella seguente Tabella 37.<br />
Sono state fatte analisi di associazione utilizzando un’ analisi di regressione per stimare l’effetto<br />
di ciascun allele sulla conta di cellule somatiche risultate dai due controlli <strong>del</strong> <strong>latte</strong> effettuati<br />
sulle bufale <strong><strong>del</strong>la</strong> prova. L’analisi è stata fatta per i due loci separatamente. Nel caso <strong>del</strong><br />
genotipo al locus 3’ (microsatellite), l’effetto <strong>del</strong>l’allele 9, non potendo essere stimato da solo<br />
per la bassa numerosità rilevata e perchè sempre solo presente allo stato eterozigote, è stato<br />
equiparato all’allele 12, come indicato da Borriello et al. (2006) che attribuiscono un diverso<br />
effetto immunitario alla dimensone <strong>del</strong> locus nel suo complesso.<br />
71
Tabella 41 – Genotipi <strong>del</strong>le bufale impiegate per la sperimentazione<br />
Matricola gtyp-5' gtyp-mic1<br />
Matricola gtyp-5' gtyp-mic1<br />
azienda<br />
azienda<br />
1190 1 gg 1616 83 3 - 1216<br />
5090 1 gg 1216 89 3 gg 1216<br />
5964 1 ag 1216 110 3 gg 1216<br />
6517 1 gg 912 113 3 gg 1216<br />
6542 1 gg 1616 137 3 gg 1616<br />
32617 1 gg 912 141 3 - -<br />
34830 1 ag 1212 146 3 gg 1216<br />
42627 1 ag 1212 157 3 gg 1216<br />
12310 1 ag 912 41816 3 ag 1212<br />
23919 2 gg 1216 41830 3 gg 916<br />
35786 2 ag 1216 83414 3 ag 1212<br />
44147 2 ag 912 140 3 - -<br />
44163 2 gg 1212 5061 4 gg 1616<br />
44164 2 ag 1212 5117 4 gg 1216<br />
75037 2 ag 1216 5141 4 ag 1216<br />
75044 2 ag 1216 5179 4 ag 1212<br />
85939 2 ag 1212 5203 4 ag 1212<br />
85941 2 gg 1212 5204 4 ag 1212<br />
85954 2 ag 1212 5207 4 ag 1216<br />
85961 2 gg 1216 5211 4 gg 1216<br />
21956 2 gg 1216 5215 4 ag 1216<br />
80352 2 gg 1212 5221 4 ag 1212<br />
13 3 ag 1212 5228 4 gg 1212<br />
19 3 ag 1212 5148 4 gg 1616<br />
63 3 gg 1212 5348 4 gg 1216<br />
Dalla tabella risulta evidente che i due loci, distanti oltre 8000 bp l’uno dall’altro, non sono in<br />
disequilibio di linkage, pertanto l’analisi è stata fatta separatamente per ciascun locus.<br />
Non è risultato un effetto significativo <strong>del</strong> genotipo al locus <strong>del</strong> promotore (regione 5’) sulle<br />
cellule somatiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong>. E’ risultato un effetto negativo significativo <strong>del</strong>l’allele 16 <strong>del</strong><br />
microsatellite sulle cellule somatiche sia al primo controllo che al secondo controllo, e molto più<br />
accentuato al secondo controllo; precisamente, l’aumento di cellule somatiche dovuto alla<br />
presenza <strong>del</strong>l’allele 16 è risultato +10.710 (P=0.07) al primo controllo e +223.640 (P=0.03) al<br />
secondo controllo. Non si sono trovati in letteratura lavori in cui viene associato il genotipo al<br />
microsatellite alle cellule somatiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong>; questo allele viene invece associato generalmente<br />
alle suscettibilità alle malattie causate da batteri. Ci sembra interessante approfondire la<br />
questione, anzitutto perchè l’allele 16 è risultato molto meno frequente <strong>del</strong>l’allele 12, non solo<br />
nella popolazione oggetto di sperimentazione <strong>del</strong>l’ambito <strong>del</strong> programma PRAL, ma anche nelle<br />
76 bufale <strong>del</strong>l’azienda di Tor Mancina che erano state tipizzate precedentemente. Si potrebbe<br />
72
ipotizzare quindi che le bufale portatrici <strong>del</strong>l’allele 16 vengano più facilmente eliminate a causa<br />
di mastiti. Riteniamo pertanto che sarebbe utile, prima di produrre risultati definitivi, analizzare<br />
una popolazione più numerosa. Stiamo cercando di individuare altri soggetti, nelle stesse<br />
aziende o in altre aziende, che abbiano genotipo omozigote per l’allele 16.<br />
Per verificare la diversa espressione <strong>del</strong> gene NRAMP1 nei soggetti con l’allele 16 e 12, oppure<br />
nei soggetti con genotipi diverso nella regione 5’ UTR, è già messa a punto la tecnica di<br />
estrazione di RNA da sangue ed è stata fatta una analisi di espressione semiquantitativa,<br />
tramite PCR e analisi <strong>del</strong>l’amplificato sul gel con densitometro. Sono stati analizzati inizialmente<br />
3 animali con differente genotipo:<br />
matricola Bufala 5’UTR microsatellite<br />
3651 gg 12/12<br />
3662 aa 12/12<br />
137 gg 16/16<br />
L’RNA totale è stato estratto da sangue usando il kit.PureLink Total RNA Blood purification Kit.<br />
(INVITROGEN), la concentrazione e la qualità <strong>del</strong>l’RNA è stata determinata determinata sia<br />
mediante caricamento su gel di agarosio all’ 1% che con il fluorimetro: Qubit Quantitation<br />
INVITROGEN), utilizzando il Quant-iT RNA Assay Kit (INVITROGEN)<br />
L’RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando il ImProm-IITM Riverse Transcription<br />
System per RT-PCR (Promega) in un volume di reazione di 20µl. La qualità <strong>del</strong>l’ cDNA prodotto<br />
è stato valutata tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1%.. E’ stata poi fatta<br />
un’amplificazione mediante PCR semiquantitativa (capace di valutare una differente quantità di<br />
amplificato fra animali di diverso genotipo) di una partre <strong>del</strong> gene di NRAMP, e per normalizzare<br />
i risultati attesi sono stati usati quattro housekeeping bovino (geni che si esprimono con la<br />
stessa intensità in tutti gli individui, indipendentemente dal genotipo): Glyceraldehyde-3-<br />
Phosphate Dehydrogenase, GAPDH; ribosomal protein large P0, RPLPO; β-Actin e 18S ribosomal<br />
RNA component. I primer per amplificare il cDNA <strong>del</strong> gene NRAMP1 sono stati disegnati tra gli<br />
esoni 1 e 4. Con gli stessi primer è stata fatta anche un’amplificazione su DNA genomico per<br />
verificare che l’amplificato era di diversa grandezza rispetto all’amplificato ottenuto con il cDNA.<br />
73
PCR Semiquantitativa<br />
Il cDNA è stato amplificato ottimizzando le condizioni PCR in modo tale da trovare il giusto<br />
numero di cicli che ci permettesse di evidenziare differenze quantitative <strong>del</strong>l’amplificato. La foto<br />
mostra l’amplificato dopo 30 cicli di PCR per NRAMP e 20 per il 18 S dove il genotipo 16/16-GG<br />
esprime di più rispetto al 12/12-GG, che a sua volta esprime di più rispetto al 12/12 AA.<br />
NRAMP<br />
MARKER 12/12-GG 12/12-AA 16/16-GG 12/12-GG 12/12-AA 16/16-GG<br />
18S<br />
Figura 30 – Amplificati di NRAMP e 18s per tre genotipi differenti.<br />
I risultati preliminari ottenuti con la PCR semiquantitativa dovranno essere confermati dalla<br />
analisi <strong>del</strong>l’espressione quantitativa <strong>del</strong>l’RNA con PCR Real Time, ma già ad una prima analisi<br />
visiva si può notare come ci siano differenze di espressione tra i vari genotipi. Inoltre è<br />
opportuno effettuare l’analisi <strong>del</strong>l’espressione quantitativa <strong>del</strong>l’RNA con PCR Real Time, in<br />
quanto la conferma <strong>del</strong>l’effetto negativo <strong>del</strong>l’allele 16 sulla resistenza alle mastiti necessita di<br />
essere giustificata scientificamente da una differenza di espressione nell’RNA tra i due genotipi .<br />
74
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI<br />
Bramanti E., Sortino C., Onor M., Beni F., Raspi G., 2003. Separation and determination of<br />
denaturated α s1 -, α s2 , β- and k-casein by hydrophobic interaction chrimatography in cows’,<br />
ewes’ and goats’ milk mixtures and cheeses. J Chrom. A; 994: 59-74.<br />
Guarino A., (1994). Valutazione quali-quantitativa <strong>del</strong>le cellule presenti nel <strong>latte</strong> di bufala,<br />
Atti <strong><strong>del</strong>la</strong> Società italiana <strong>del</strong>le scienze veterinarie, Volume XLVI<br />
Mariani P., Pecorari M., 1991. Il ruolo <strong>del</strong>le varianti genetiche <strong><strong>del</strong>la</strong> κ-caseina nella<br />
produzione <strong>del</strong> formaggio. Sci. Tecn. Latt.-Cas.; 42:255-258.<br />
Mariani P., Anghiretti A., Seventi P., Fossa E., 1993. Frazionamento <strong><strong>del</strong>la</strong> caseina mediante<br />
RP-HPLC: sulla osservazione di alcuni latti individuali caratterizzati da una bassa<br />
proporzione di αs1-caseina in vacceh di razza bruna. L’industria <strong>del</strong> <strong>latte</strong>; 3-4:75-84.<br />
Pugliese C., Rapaccini S., Acciaioli A., Malvezzi R., Lucifero M., 1997. Caratteristiche<br />
tecnologiche <strong>del</strong> <strong>latte</strong> di pecore Massesi. Atti XII Congr. Naz. ASPA, Pisa, pp. 265-266.<br />
Zicarelli L., 2004. Buffalo milk: its properties, dairy yield and mozzarella production. Vet.<br />
Res. Comm.; 28:127-135.<br />
Urech, E., Puhan, Z., Schallibaum, M., 1998. Changes in milk protein fraction as effected by<br />
subclinical mastitis. J. Dairy Sci.; 12:2402-2411.<br />
Viesser S, Slangen K. J., Rollema H. S., 1986. High performance liquid chromatography of<br />
bovine caseins with the application of various stationary phases. Milchwissenschaft; 41:559-<br />
562.<br />
75
Allegato 1<br />
Lista <strong>del</strong>le pubblicazioni<br />
G. Giacinti, A. Tammaro, R. Rosati, S. Amatiste, U. Bernabucci, B. Ronchi, 2007. Changes of<br />
milk yield and composition as affected by subclinical mastitis in sheep. Proc. of the 5 th<br />
International Symposium of The International Dairy Federation (IDF) “Challenge to Sheep<br />
and Goats Milk Sectors”. Alghero - Sardinia, 18 th –20 th April (Poster).<br />
B. Moioli, L. Orrù, G. DeMatteis, M.C. Scatà, M.C. Savarese, F.Napolitano, 2007. Studio dei<br />
geni che influenzano la resistenza alle mastiti. Convegno “Caratteristiche <strong>igienico</strong> – sanitarie<br />
<strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino, ovino e caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”.<br />
Viterbo - 5 Ottobre 2007.<br />
S. Orlandini, M. Catta, M. Miarelli, L. Lattanzi, 2007. Metodi di routine<br />
per la determinazione <strong>del</strong>le cellule somatiche nel <strong>latte</strong> di bufala. Citometria di flusso & CCD<br />
camera. Convegno “Caratteristiche <strong>igienico</strong> – sanitarie <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino, ovino e caprino -<br />
Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5 Ottobre 2007.<br />
U. Bernabucci, G. Giacinti, B. Ronchi, 2007. Studio dei fattori che influenzano le<br />
caratteristiche <strong>del</strong> a<strong>latte</strong> di capra. Convegno “Caratteristiche <strong>igienico</strong> – sanitarie <strong>del</strong> <strong>latte</strong><br />
bufalino, ovino e caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5<br />
Ottobre 2007.<br />
C. Tripaldi, G. Paolocci, M. Miarelli, M. Catta, S. Orlandini, S. Amatiste, G. Giacinti, A.<br />
Tammaro, 2007. Aspetti <strong>igienico</strong>-sanitari e loro effetti sulla produzione quanti-qualitativa<br />
<strong>del</strong> a<strong>latte</strong> di bufala. Convegno “Caratteristiche <strong>igienico</strong> – sanitarie <strong>del</strong> <strong>latte</strong> bufalino, ovino e<br />
caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5 Ottobre 2007.<br />
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