Rapporto annuale 2007 - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario ...

IRFMN
conclusione del progetto sarà quindi prodotto un database contenente informazioni sulla risposta
al trattamento con un numero ristretto di farmaci, ma ricco di informazioni sulle dipendenze
degli effetti dal tempo e dalla dose, che consentirà un’intercomparazione diretta tra i più comuni
farmaci utilizzati nel trattamento del carcinoma ovarico.
Disregolazione del ciclo cellulare indotta da erlotinib
Gli inibitori del recettore dell’Epidermal growth factor (EGFR) sono una delle più promettenti
classi di nuovi composti antitumorali, e alcuni di essi, come l’erlotinib, sono già entrati nella
pratica clinica. La ricerca su questi composti a oggi si è focalizzata sulle interazioni molecolari
di questi composti, trascurando lo studio della dinamica delle perturbazioni del ciclo cellulare e
l’uso di tali informazioni nell’ottimizzazione delle terapie, siano esse basate su un singolo
farmaco o su combinazioni di più farmaci. L’Unità di Biofisica ha attivato un progetto di studio
dettagliato delle dipendenza dal tempo e dalla dose delle perturbazioni del ciclo cellulare indotte
dal principale degli inibitori dell’EGFR, l’erlotinib, applicando le metodologie multidisciplinari
e gli strumenti di riproduzione al computer del trattamento sviluppati all’interno dell’unità.
Ci si aspetta che il riconoscimento e la misura di tali effetti fornirà un importante contributo alla
comprensione delle modalità di azione dell’erlotinib da solo ed in combinazione, e dell’origine
degli insuccessi del trattamento.
Decodificazione degli effetti dei farmaci antitutmorali osservati mediante
Time-Lapse Imaging e Citometria a Flusso con un unico modello
matematico
Scopo del progetto è l’uso combinato di tecniche citofluorimetriche a flusso (analisi di
popolazioni cellulari) e di time-lapse imaging (analisi di “lineages” di discendenza di single
cellule) per generare dati utili a predire la risposta ai farmaci antitumorali in termini delle due
principali azioni: gli effetti citostatici, legati a specifiche perturbazioni del ciclo cellulare, e gli
effetti citotossichi, legati ai meccanismi che inducono la morte cellulare.
Nel progetto verrà utilizzata una linea cellulare ingegnerizzata a esprimere un gene di fusione
tra la ciclina B1 e un marker fluorescente (GFP). In tale linea è possibile seguire
l’attraversamento del ciclo cellulare delle cellule mediante microscopia “time-lapse”.
L’ipotesi di lavoro è che l’analisi quantitativa dei dati di time-lapse possa essere integrata con le
informazioni fornite dalla citometria a flusso, e si possa effettuare un’interpretazione congiunta
di entrambi gli esperimenti mediante un comune modello matematico interpretativo del
fenomeno, Scopo finale è raggiungere nuovi livelli di comprensione degli effetti farmacologici
e la creazione di nuovi strumenti di simulazione da mettere a disposizione della comunità
scientifica.
Misura delle variazioni del contenuto cellulare di specifiche proteine,
durante la progressione nella fase G1, in cellule in crescita esponenziale
E’ stato sviluppato un metodo per misurare il contenuto di particolari proteine in singole cellule
durante l’attraversamento della fase G1. Nello studio sono stati misurati i livelli di Ciclina E, ma
la procedura è applicabile a qualsiasi proteina rilevabile in modo specifico con tecniche di
immunoistochimica. La sequenza degli eventi in G1 è misurata in cellule in crescita
esponenziale, evitando le problematiche e gli artefatti indotti dalle procedure di
sincronizzazione.
Il metodo si basa su: i) esposizione delle cellule per pochi minuti a bassissime concentrazioni di
bromodeoxyuridina (BrdUrd), seguita da raccolta e fissazione delle cellule a diversi tempi; ii)
misura contemporanea del contenuto di DNA, BrdUrd e Ciclina E mediante citometria a flusso
multiparametrica; iii) analisi dei dati basata sulla teoria della proliferazione di popolazioni
asincrone, con durata della fase variabile.
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RAPPORTO ATTIVITA’ 2007