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UNITE.1 – Il sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla ed in altre malattie…
cata e pre-purificata mediante cromatografia su SiO 2
e successivamente analizzata
mediante un sistema di cromatografia liquida accoppiato a spettrometria
di massa (LC-ESI-MS). AEA, 2AG e PEA, nella loro forma protonata
(M+), verranno identificati e quantificati attraverso diluizione isotopica [Giuffrida
et al. (2000) Eur J Pharmacol 408:161-168].
Dosaggi delle attività enzimatiche
Le attività degli enzimi coinvolti nei meccanismi di sintesi e di degradazione
degli endocannabinoidi verranno valutate su omogenati cellulari o tissutali,
attraverso metodiche radioisotopiche in cromatografia liquida ad alta
prestazione (HPLC). L’idrolisi di [ 3 H]AEA da parte dell’idrolasi delle ammidi
degli acidi grassi (FAAH; E.C.3.5.1.4) verrà misurata testando i livelli di
[ 3 H]-etanolamina prodotta e l’attività enzimatica verrà espressa come pmoli
di [ 3 H]etanolamina rilasciata per milligrammo di proteine in un minuto
[Maccarrone et al. (2005) J Cell Sci 118:4393-4404]. L’attività della fosfolipasi
D specifica per la sintesi di AEA (NAPE-PLD; E.C. 3.1.4.4) sarà dosata
misurando il rilascio di [ 3 H]AEA a partire da N-[ 3 H]arachidonoilfosfatidiletanolammina
(N-[ 3 H]ArPE). I valori di attività enzimatica saranno
espressi come pmoli di [ 3 H]AEA prodotta per milligrammo di proteine in un
minuto [Fezza et al. (2005) Anal Biochem 339:113-120]. Per misurare l’attività
degli enzimi diacilglicerolo lipasi (DAGL) e monoacilglicerololipasi
(MAGL), responsabili della sintesi e degradazione del 2-AG, verranno usati
rispettivamente i radioligandi sn-1-stearoil-2-[ 14 C]-AG e 2-[ 3 H]-
oleoilglicerolo, secondo le metodiche sperimentali descritte in letteratura
[Bisogno et al. (2003) J Cell Biol 163:463-468]. Le attività di DAGL e MAGL
verranno espresse come pmoli di prodotto rilasciato per milligrammo di
proteine in un minuto. La degradazione della PEA verrà testata valutando
l’attività dell’amidasi acida delle N-aciletanolammine (NAAA) mediante il
substrato radioattivo [ 3 H]PEA, marcato sulla testa etanolamminica. L’attività
NAAA sarà espressa come picomoli di PEA degradata per milligrammo
di proteine in un minuto.
Studi di legame recettoriale
Le attività di legame recettoriale verranno valutate mediante tecniche di
filtrazione ultrarapida [Maccarrone et al. (2000) J Biol Chem 275:31938-
31945], con l’uso di specifici agonisti per i recettori cannabici ([ 3 H]CP55.940)
e vanilloidi (resinferatoxin, [ 3 H]RTX) [Maccarrone et al. (2005) J Cell Sci
118:4393-4404].
Studi di immunolocalizzazione
a) Western blotting. Gli estratti citosolici verranno sottoposti ad analisi
elettroforetica seguita da trasferimento proteico, secondo procedure standardizzate
[Maccarrone et al. (2005) J Cell Sci 118:4393-4404]. Gli elementi del
sistema endocannabinoide verranno evidenziati e quantificati, usando anticorpi
specifici per ciascuno di essi.
b) Microscopia confocale. Le cellule verranno fissate su vetrini coprioggetto,
per essere permeabilizzate con 0.1% Triton-X100 e poi fatte reagire
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