0-TESTO COMPLETO.pdf - Fondazione Santa Lucia

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RF07.66 – The italian ALS genetic collaborative project: follow-up genetic association study… Methods We have already built up a collection of cell lines where expression of wild type and mutant SOD1 is either low-level and constitutive (human neuroblastoma SH-SY5Y) or inducible (mouse motoneuronal line NSC-34). The use of an inducible expression system allows ruling out possible “ preconditioning ” effects due to the constitutive expression of the mutant SOD1, while a low-level chronic expression in a human background has the advantage of better mimicking the situation in patients. Therefore, the two models are complementary and will be used in parallel in this study. Studies on mitochondria localization of SOD1 and on mitochondria functionality (ATP production, membrane polarization, cytochome c release) will be performed as described in detail for the same cell lines in our previous papers [Carrì et al. (1997) Febs lett; Ferri et al. (2004) Faseb j; Cozzolino et al. (2006) Neurobiol Disease; Ferri et al. (2006) PNAS]. Briefly, determination of the state of mitochondria polarization in transfected cells will be carried out using fluorescent dye JC-1 by cytofluorimetry; intracellular ATP production will be assessed using ATP Bioluminescence Assay Kit (Sigma, St.Louis, MO, USA); functionality of respiratory complexes will be performed by standard spectrophotometric measurements. Markers of oxidative stress (e.g. total reactive oxygen species, total protein carbonyl content, reduce/oxidized glutathion) will also be determined by standard techniques as previously reported [Gabbianelli et al. (1999); Beretta et al. (2003); Ferri et al. (2004) Faseb j; Ferri et al. (2005) J Neurochem; Ferri et al. (2006) PNAS]. Briefly, whole-cell and mitochondria reactive oxygen species levels will be measured using the dyes 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) and dihydrorhodamine-123 (DRH). The level of fluorescence will be quantified by FACScan. Cytosolic and mitochondrial carbonylated proteins will be detected using an OxyBlot Kit (Intergen, Portland, OR) that employs the reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP). Proteins will be electrophoresed in SDS-PAGE, electrotransfered to a polyvinylidene fluoride membrane, and immunodetected with anti-2,4- dinitrophenyl antibodies. Total and mitochondrial glutathione content (GSH/GSSG ratio) will be assayed by conversion of free amino groups to 2,4- dinitrophenyl derivatives by the reaction with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene and separation by HPLC. Analysis of cytosolic and mitochondrial SOD1 aggregates will be carried out by standard fluorescence microscopy on cells grown on polilysine coated glass slides and fixed and by Western blot analysis of sedimentable particles from whole cells or purified mitichondria as already reported by us [Beretta et al. 2003; Cozzolino et al. (2007) J Biol Chem]. Viability of cell lines will be assessed, using various methods such as: Hoechst staining for nuclear condensation and fragmentation (counting in fluorescence microscopy), staining with propidium iodide (cytofluorimetry), caspases activation (Western blots with commercially available antibodies and determination of activity with fluorescent substrates, also commercially 2009 743
Sezione III: Attività per progetti available), cytocrome c release (fractionation and Western blot, immunocytochemistry). All of these methods have already been successfully used in this lab [Cozzolino et al. 2004]. Overexpression and silencing of candidate factors will be performed through standard Molecular Biology techniques as already reported by our group [Danzeisen et al. (2006) J Biol Inorg Chem]. For all the biochemical studies, statistic analysis will be performed by One or Two Way ANOVA test followed by post/hoc test as appropriate. 744 2009
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GRANDE RACCORDO ANULARE KM 51 Fosso
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Comitato Etico: Fiorenzo Angelini M
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Servizi socio-sanitari Assistente s
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Struttura organizzativa prese a mag
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Struttura organizzativa - libro del
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PAZIENTI DIMESSI PER TIPOLOGIA DI R
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Sezione II danno stesso, ma anche c
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Sezione II Da anni la Fondazione Sa
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Sezione II 8AMMATUNA E, DIVONA M, C
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Sezione II The PRIAMO study: a mult
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Sezione II 38 BRECCIA M, LATAGLIATA
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Sezione II 57 CATANZARO G, RAPINO C
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Sezione II brain of a transgenic mo
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Sezione II 91 DAPRATI E, NICO D, DU
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Sezione II 121 FEDERICI M, NISTICÒ
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Sezione II Normal versus pathologic
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