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REG.15 – Ricerca di biomarcatori di esposizione a diossine e policlorobifenili diossino-simili…
menti e, di conseguenza, gli AOA a rischio. Sotto questo punto di vista, si
prevede di concentrare l’attenzione sui linfociti, tenuto conto che il sistema
immunitario rappresenta uno dei principali bersagli dell’azione tossica delle
molecole oggetto di studio e della relativamente facile ottenibilità e coltura
di tali cellule.
Il problema sarà affrontato mediante approccio multidisciplinare, in
considerazione dell’evoluzione delle più recenti tecniche volte a mettere in
evidenza le modificazioni indotte da PCDD e DL-PCB sotto il profilo molecolare.
Per quanto riguarda l’approccio genomico, per esempio, alterazioni
dell’espressione dei geni sopra menzionati sono stati evidenziati in linfociti
di soggetti esposti nel 1976 alla contaminazione legata all’incidente di
Seveso. Relativamente all’approccio proteomico, variazioni del profilo proteico
sono state individuate in animali da laboratorio esposti a varie PCDD.
Infine, anomalie cromosomiche sono state evidenziate nei linfociti di pecore
al pascolo naturalmente esposte a PCDD. Nessuno di tali approcci è stato
finora applicato alla specie bovina.
OBIETTIVI
Il presente progetto di ricerca, che si avvarrà della collaborazione e dei
dati analitici raccolti dalla Regione Piemonte (ASPRG), da alcune ASL e dall’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
(IZSTO), mirerà innanzi tutto all’individuazione di aree contaminate regionali,
nelle quali esistano allevamenti di vacche da latte, e di allevamenti con
livelli di contaminazione considerati normali, da usare come controlli. Dagli
animali oggetto di studio verranno prelevati campioni di sangue dai quali, per
centrifugazione a gradiente e con tecniche già collaudate, saranno isolati i
linfociti.
Per gli studi di proteomica, estratti di linfociti verranno sottoposti a
elettroforesi bidimensionale (2DE) secondo tecniche già messe a punto e,
dopo individuazione successiva al matching, verranno valutati gli spot differenzialmente
espressi mediante software dedicati (PDQUEST). Parallelamente
si valuterà l’opportunità di identificare eventuali differenze del profilo
proteico sui linfociti stessi e a livello sierico tramite tecniche di spettrometria
di massa tandem. Identificate in tal modo le proteine espresse in
modo differenziale a seconda dell’esposizione, sarà possibile mettere a
punto test rapidi di immunoblotting mediante l’impiego di anticorpi policlonali
rivolti contro le singole proteine. Per quanto concerne l’approccio genomico,
in rapporto a quanto emerso dalle indagini riportate in letteratura,
saranno presi in considerazione i geni AhR, ARNT, CYP1A1 e CYP1B1.
Mediante PCR qualitativa, clonaggio e sequenziamento saranno messi a
punto protocolli da utilizzare successivamente nella PCR quantitativa allo
scopo di monitorare l’eventuale effetto dell’esposizione a PCDD e DL-PCB
sul livello di trascrizione di tali geni. Quale approccio complementare si
potrà valutare l’opportunità di effettuare analogo procedimento a carico dei
geni che codificano per le proteine eventualmente identificate al termine
delle indagini proteomiche.
2009 675