0-TESTO COMPLETO.pdf - Fondazione Santa Lucia

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Sezione III: Attività per progetti tory postsynaptic currents (mEPSCs). Mice will be killed under halothane anesthesia, and corticostriatal coronal slices (200 mm) will be prepared from fresh tissue blocks of the brain with the use of a vibratome. A single slice will then be transferred to a recording chamber and submerged in a continuously flowing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) (34°C, 2-3 ml/min) gassed with 95% O 2 - 5% CO 2 . The composition of the control solution will be (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 MgCl 2 , 1.2 NaH 2 PO 4 , 2.4 CaCl 2 , 11 Glucose, 25 NaHCO 3 . Whole-cell patch clamp recordings will be made with borosilicate glass pipettes (1.8 mm o.d.; 2-4 MW), in voltage-clamp mode, at the holding potential (HP) of –80 mV. Bicuculline (10 mM) will be added to the perfusing solution to study glutamate-mediated eEPSCs, sEPSCs, and mEPSCs. Intraelectrode solution will have the following composition (mM): CsCl (110), K + -gluconate (30), ethylene glycol-bis (b-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA; 1.1), HEPES (10), CaCl 2 (0.1), Mg-ATP (4), Na-GTP (0.3). Synaptic events will be stored by using P-CLAMP 9 (Axon Instruments) and analyzed off line on a personal computer with Mini Analysis 5.1 [Synaptosoft, Leonia, NJ, USA] software. In both control and EAE brains, the striatum will be readily identified under low power magnification, whereas individual neurons will be visualized in situ using a differential interference contrast (Nomarski) optical system. This will employ an Olympus BX50WI (Japan) non-inverted microscope with x40 water immersion objective combined with an infra-red filter, a monochrome CCD camera (COHU 4912), and a PC compatible system for analysis of images and contrast enhancement [WinVision 2000, Delta Sistemi, Italy]. Recording pipettes will be advanced towards individual striatal cells in the slice under positive pressure and, on contact, tight GW seals will be made by applying negative pressure. The membrane patch will then be ruptured by suction and membrane current and potential monitored using an Axopatch 1D patch clamp amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA, USA). Wholecell access resistances measured in voltage clamp will be in the range of 5-20 MW. Synaptic events will be stored by using P-CLAMP 9 (Axon Instruments) and analyzed off line on a personal computer with Mini Analysis 5.1 [Synaptosoft, Leonia, NJ, USA] software. The detection threshold of spontaneous and miniature events will be set at twice the baseline noise. The fact that no false events would be identified will be confirmed by visual inspection for each experiment. Offline analysis will be performed on spontaneous and miniature synaptic events recorded during fixed time epochs (3-5 min, 3-6 samplings), sampled every 5 or 10 minutes. Only cells that will exhibit stable frequencies (less than 20% changes during the control samplings) will be taken into account. For kinetic analysis, events with peak amplitude between 10 and 50 pA will be grouped, aligned by half-rise time, and normalized by peak amplitude. Events with complex peaks will be eliminated. In each cell, all events between 10 and 50 pA will be averaged to obtain rise times, decay times, and half widths [Centonze et al. 2009]. One to six cells per animal will be recorded. For each type of experiment and time point, at least four distinct animals will be employed for each experi- 652 2009
MERCK.1 – Effects of interferon b-1a and cladribine on synaptic neurodegenerative damage… mental group. Data will be presented as the mean ± S.E.M. Multiple comparisons will be analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey HSD. Comparisons between two groups will be analyzed by paired or unpaired Student’s t- test or Wilcoxon’s test. The significance level will be established at p
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