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Sezione II
tion” (LTP) e “long term depression “ (LTD) [Martella et al. (2009) Brain
132(9): 2336-2349].
Nello stesso modello animale l’attivazione del recettore D2-like sugli interneuroni
colinergici (LA) di topi mutati, induce un abnorme effetto eccitatorio
assente in condizioni fisiologiche di base [Pisani et al. (2006) Neurobiol Dis
24(2): 318-325]. Inoltre, studi in precedenza condotti dimostrano come l’attività
GABAergica striatale sia significativamente aumentata in topi mutati per
la TorsinA [Sciamanna et al. (2009) Neurobiol Dis 2009 34(1): 133-145], confermando
lo stretto coinvolgimento dello striato nella fisiopatologia della
distonia DYT1. Diversi e distinti fattori sono in grado di modulare l’attività
GABAergica dello striato. Particolare importanza riveste soprattutto l’innervazione
dopaminergica, la cui disfunzione è ritenuta oggi fortemente implicata
nell’insorgenza di fenomeni distonici. In pazienti affetti da distonia DYT1
sono stati individuati dei ridotti livelli di dopamina nel caudato/putamen
[Furukawa et al. (2000) Neurology 54(5): 1193-1195] così come un aumentato
turnover della dopamina [Augood et al. (2004) Adv Neurol 94: 53-60]. Studi di
PET dimostrano, in pazienti con distonia DYT1 non conclamata, la presenza
di una moderata riduzione del binding del recettore striatale D2 [Asanuma et
al. (2005) Neurology 64: 347-349].
Sulla base di tali considerazioni, obiettivo del presente progetto è stato
quindi quello di realizzare un più dettagliato e ampio studio della trasmissione
sinaptica GABAergica striatale in un modello animale di distonia DYT1,
individuando eventuali alterazioni a carico del circuito stesso così come i fattori
in grado di regolarne l’attività.
Materiali e metodi – La realizzazione del suddetto progetto ha visto l’utilizzazione
di tecniche di registrazione elettrofisiologica di tipo patch-clamp in
configurazione whole-cell. Gli esperimenti sono stati condotti su fettine cortico-striatali
di cervello prelevate da topi di controllo (NT), da topi che sovraesprimevano
la proteina umana non-mutata (hWT) e infine da topi che sovraesprimevano
la proteina umana mutata (hMT). Gli animali venivano sacrificati
tramite dislocazione cervicale in stato di anestesia totale e il cervello
immediatamente rimosso. Le fettine sono state preparate tramite utilizzo di
un vibratomo e mantenute costantemente in sospensione in una soluzione
contenente in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl 2
, 1.2 NaH 2
PO 4
, 2.4 CaCl 2
, 10
glucose, 18 NaHCO 3
. Per gli esperimenti concernenti l’analisi di eventi sinaptici
evocati (eIPSCs) e spontanei (sIPSCs) gli elettrodi di registrazione sono
stati riempiti con la seguente soluzione intracellulare in mM: CsCl (110), K + -
gluconate (30), EGTA (1.1), Hepes (10), C a
Cl 2
(0.1), Mg-ATP (2.0), GTP (0.3).
Gli eventi GABAergici evocati venivano indotti ad una frequenza di 0.1
Hz, tramite un elettrodo bipolare posto in prossimità della cellula registrata. I
dati sono stati acquisiti tramite amplificatore Multiclamp 700b (Axon Instruments)
e il software pClamp 9.2. Al fine di evitare la sovrapposizione di attività
di tipo glutammatergico, tutti gli esperimenti sono stati effettuati in presenza
di antagonisti specifici dei recettori del glutammato AMPA e NMDA
(MK801; CNQX). I dati acquisiti sono stati analizzati off-line tramite l’utilizzo
di software specifico: Minianalysis (Synaptosoft), pClamp 9.2 (Molecular
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