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Sezione II
resistenza all’apoptosi correla con alti livelli di espressione della proteina antiapoptotica
FLIP.
Basandosi sulla recente osservazione che trattando linee cellulari esprimenti
una forma attiva della chinasi con inibitori del proteosoma si determina
un aumento dei livelli di FLIP (aumento che di contro non si osserva in
linee cellulari non esprimenti una forma attiva della chinsi), si è ipotizzato
che l’attività chinasica di ATM moduli la stabilità di FLIP tramite una via proteosoma
dipendente. In un recente lavoro è stata individuata l’E3 ubiquitina
ligasi ITCH come l’enzima responsabile della degradazione specifica della
proteina FLIP. Si è quindi ipotizzato che ATM possa regolare i livelli di FLIP
modulando l’attività della sua E3 ubiquitina ligasi specifica: ITCH.
Risultati – ITCH svolge un ruolo nella degradazione ATM dipendente di FLIP –
Inibendo l’attività di ITCH mediante specifico siRNA si è verificato che l’attenuazione
dei livelli della E3 ubiqutitina ligasi è in grado di abrogare la degradazione
ATM-dipendente di FLIP indotta da trattamento con Neocarzinostatina
(radiomimetico in grado di indurre lesioni di tipo“ rottura su doppio filamento
” che inducono attivazione della chinasi ATM).
ATM modula l’attività della ubiquitina ligasi ITCH – Allestendo un primo saggio
di ubiquitinazione in cellule 293T in cui si sovra-esprime ITCH-Myc, Ubiquitina-HA
in presenza o meno della chinasi ATM (od in alternativa attivando
o meno la chinasi endogena previo trattamento con Neocarzinostatina), si è
rilevato tramite immunoblotting anti-HA su Immunoprecipitato (IP) di ITCH
un incremento nell’attivazione della ubiquitina ligasi nei soli campioni in cui
la chinasi è attiva.
ATM svolge un ruolo nella modulazione dell’ubiquitinazione di FLIP – Si è allestito
un saggio di ubiquitinazione in cellule 293T in cui si sono co-espresse
FLIP-Flag, Ubiquitina-HA e ITCH-Myc in modo da osservare ATM promuovere
la degradazione di FLIP modulando l’attività di ITCH. Si rileva l’ubiquitinazione
di FLIP tramite immunoblotting anti-HA su IP di FLIP. Si è testato
inoltre il contributo peculiare dell’attività chinasica di ATM utilizzando sia l’inibitore
specifico KU55933, sia la Neocarzinostatina.
I suddetti esperimenti confermano che in risposta a danno al DNA l’attività
di ATM è necessaria per modulare l’attività di ITCH ed i livelli di FLIP
regolandone la sua ubiquitinazione.
ITCH potrebbe essere un substrato diretto di ATM – È riportato in letteratura
che ATM modula l’attività di alcuni suoi effettori mediante la loro diretta
fosforilazione principalmente all’interno di siti specifici definiti “ siti SQ-TQ”,
composti da un residuo di serina o treonina seguito da un glutammato. Da
un’analisi della sequenza genica di ITCH si riscontrano ben nove “ siti SQ-TQ”;
si è ipotizzato che ATM fosse in grado di fosforilare la ligasi. È stato effettuato
un IP su colonna cromatografica partendo da 30mg di estratto proteico da
cellule 293T cotrasfettate con ITCH ed ATM e trattate con Neocarzinostatina.
Il campione è stato separato per elettroforesi su SDS-PAGE ed il gel colorato
con Brilliant Blue per evidenziare le proteine. L’analisi di spettrometria di
massa è stata svolta nel Laboratorio di Spettrometria di Massa, dell’Istituto
DIBIT-H-San Raffaele di Milano. La banda separata tramite elettroforesi su
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