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Borse di studio
che descrivono la capacità di ATM di fosforilare almeno tre E3 ubiquitinligasi,
MDM2, COP1, Siah-1 [Maya R (2001) Genes Dev 15: 1067-1077; Dornan
D (2006) Science 313: 1122-1126; Winter M (2008) Nat Cell Biol 10: 812-
824] ed una deubiquitinasi, USP10 [Yuan J (2010) Cell 140: 384-396], mettono
in luce un ipotetico ruolo di ATM nel modulare la via di segnalazione e degradazione
cellulare che si basa sul sistema ubiquitina-proteasoma (Ub-P). A
sostegno di questa ipotesi vi è una ricerca del 2002 [Taylor A (2002) Oncogene
21: 4363-4373] che riporta l’aumento dei coniugati di ubiquitina in risposta al
danno al DNA dovuto a rotture nella doppia elica, processo che induce
appunto l’attivazione di ATM.
È proprio studiare il possibile ruolo di ATM nel processo di degradazione
delle proteine Ub-P dipendente l’obiettivo di questo progetto di ricerca.
Materiali e metodi – I modelli cellulari sperimentali selezionati per l’indagine
di proteomica sono stati la linea linfoblastoide L6, derivata da un
paziente con AT, e la corrispondente linea stabilmente trasfettata con il
costrutto ATM-wt (chinasi funzionale, L6ATM). Entrambe le linee cellulari
sono state incubate o meno con 10mM MG132 (inibitore del proteosoma) per
2 ore e le proteine sono state estratte lisando in 6M Urea, 100mM Tris, 0.5%
CHAPS. È stato effettuato un western blot con l’anticorpo anti-ubiquitina
(Santa Cruz, P4D1) per valutare l’accumulo delle proteine poli-ubiquitinate
nelle cellule trattate. La stessa quantità proteica, per ogni condizione, è stata
digerita con l’enzima tripsina ed i peptidi risultanti son stati identificati e
quantificati grazie alla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di
massa di tipo tandem (LC-MS/MS); 1.7ug di digesto proteico son stati iniettati
in un sistema cromatografico UPLC nanoAcquity accoppiato a spettrometro
di massa nanoESI-Q-TOF (Q-Tof Premiere, Waters Corp.) con acquisizione in
MS E . Nella particolare configurazione strumentale adottata (cromatografia
liquida a fase inversa), la separazione dei peptidi avviene utilizzando una
miscela di acqua e acetonitrile come fase mobile (gradiente da 3 a 40% di
ACN in 120 minuti) e una colonna C18 come fase stazionaria. La successiva
acquisizione dei dati di spettrometria di massa in modalità MS E [Vissers JP
(2007) Mol Cell Proteomics 6: 755-766] consiste in un protocollo di frammentazione
peptidica in parallelo: lo spettrometro di massa fornisce l’energia di
collisione alternando due tipologie di MS ad elevata (15-40 eV) e bassa (4 eV)
energia di collisione.
L’insieme dei dati risultante dagli spettri di massa, contenenti informazioni
sui precursori peptidici e sui relativi ioni figli prodotti, associati con i
corrispondenti tempi di ritenzione, sono stati elaborati con il programma ProteinLynx
Global Server (Waters) che ha permesso sia l’identificazione delle
proteine interrogando la banca dati di UniProtKB/SwissProt (versione 54.0)
sia la quantificazione relativa, tra i diversi campioni, delle proteine identificate
(grazie all’utilizzo di uno standard interno, 200ftmoli del digesto di Enolase
di Saccharomyces cerevisiae) con validazione statistica dei risultati. L’elevata
sensibilità e riproducibilità del sistema nano-cromatografico e l’elevata
efficienza di rivelazione dell’acquisizione MS E rendono questo approccio
“ label free ” il metodo ideale per l’identificazione di proteine in campioni
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