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Borse di studio
Materiali e metodi – Per lo studio sono stati usati ratti wistar maschi (Harlan,
Italia) di 200-220 gr. Gli animali sono stati iniettati con acido quinolinico
come descritto in Fusco et al. [(2003b) Eur J Neurosci 18: 1093-1102]. Gli animali
sono stati trattati con iniezioni quotidiane intraperitoneali di Rolipram o
veicolo ed in seguito sacrificati mediante perfusione transcardiaca a due e a 8
settimane. I cervelli sono stati rimossi, postfissati overnight, e dopo un opportuno
trattamento di crioprotezione sono stati congelati e sezionati al microtomo.
Sono stati valutati 2 parametri: la grandezza delle lesioni striatali con la
sopravvivenza cellulare e il livello di CREB fosforilata.
Le lesioni sono state evidenziate utilizzando un anti-NeuN (1:200) per
marcare i neuroni nello striato tramite colorazione DAB come già precedentemente
descritto [Fusco et al. [(2003b) Eur J Neurosci 18: 1093-1102],
quindi le sezioni sono state esaminate al microscopio. La grandezza delle
lesioni è stata analizzata con software Zeiss LSM TM . Per la sopravvivenza
cellulare è stata calcolata la densità apparente dei neuroni immunoreattivi
su 1mm 2 [Fusco et al. (2003b) Eur J Neurosci 18: 1093-1102], a questo
scopo l’area intorno alle lesioni è stata divisa in dorsale, laterale e mediale
[DeMarch et al. (2007) Neurobiol Dis 25: 266-273] e il centro della lesione
calcolato a parte. Per calcolare i livelli di CREB attivata e del BDNF nei neuroni
sopravvissuti è stato utilizzato un metodo di doppia immunofluorescenza
utilizzando anticorpi specifici per le proteine di interesse (anti-Phospho-CREB
Rabbit e anti-BDNF mouse) entrambi diluiti 1:200, incubati per
72 ore a -4°C. Le sezioni sono state poi incubate con anticorpi secondari
(Goat anti-rabbit Cy3 coniugato e Donkey anti-mouse Cy2 coniugato). I dati
ottenuti sono stati poi analizzati per rilevare gli effetti del farmaco sulla
sopravvivenza cellulare e l’inattivazione di CREB nello striato nei diversi
gruppi di animali. L’analisi statistica è stata effettuata tramite ANOVA
seguita dal test HDS Tukey.
Risultati – Negli animali trattati con TP10 l’estensione delle lesioni risulta
essere diminuita in maniera statisticamente significativa rispetto agli animali
non trattati. Sia nella parte centrale della lesione che nelle aree circostanti è
stata riscontrata una maggior sopravvivenza cellulare negli animali trattati
con TP10 rispetto ai trattati con veicolo ad entrambi i time points considerati.
La perdita di neuroni corticali è ridotta del 27% nei gruppi trattati con TP10.
Negli animali trattati con TP10 l’intensità di CREB attivata aumentava
rispetto a quelli lesionati e trattati con il veicolo. Il trattamento era in grado di
riportare i livelli di CREB fosforilata a livelli molto simili a quelli degli animali
non lesionati. L’analisi della fluorescenza del BDNF ha dimostrato invece
un aumento del 10% di questa proteina negli animali trattati con TP10
rispetto agli animali veicolo. Nella corteccia è stato trovato un aumento del
2,5% (a 2 settimane dopo la lesione) e del 12% (8 settimane dopo la lesione) di
CREB fosforilata negli animali trattati con TP10 rispetto al veicolo. In relazione
al BDNF espresso in corteccia è stato mostrato un incremento del 16%
negli animali trattati e sacrificati dopo due settimane, mentre non è stata rilevata
una differenza significativa negli animali sacrificati a 8 settimane dalla
lesione.
2009 151