0-TESTO COMPLETO.pdf - Fondazione Santa Lucia

Sezione II
Microscopia confocale – La preparazione del tessuto era identico a quello precedentemente
descritto per gli esperimenti di elettrofisiologia. Dopo il taglio, le
fettine sono state divise in 6 camerette contenenti ACSF standard saturato con
O 2
/CO 2
. Nella prima cameretta (CTRL) non è stato aggiunto nessun composto;
nella seconda (BMAA) è stato aggiunta BMAA (3 mM) e nelle altre BMAA più
CPCCOEt (100 mM), o CNQX (10 mM), o JNJ (1 mM), o una miscela di JNJ più
CNQX. Dopo 1h di trattamento, le fettine dalle 6 camerette sono state lasciate
recuperare per 5h in 6 distinte camerette riempite solo con ACSF. Dopo le fettine
sono state fissate tutta la notte in paraformaldeide 4% e, dopo 3 lavaggi in
PB, trasferite in 30% sucrosio/PB a 4°C per 48h. Subito dopo, sono state
tagliate in sotto-fettine dello spessore di 35 mm usando un microtomo e direttamente
montate su vetrini. Le sezioni sono state incubate tutta la notte in una
miscela contenente i seguenti anticorpi primari: anti-tirosina idrossilasi di
capra (TH; 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e anti-citocromo-c
di topo (Cyt-c; 1:100; Promega, Madison, WI, USA).
Dopo questa incubazione, le sezioni sono state incubate per 2h a temperatura
ambiente in una miscela di anticorpi secondari inclusi anti-capra IgG
di asino Cy3-coniugati, e anti-topo IgG di asino Cy2- coniugati (1:100; Jackson
Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA). Le sezioni sono state
poi asciugate all’aria e ricoperte con il Gel/Mount (Biomeda, Foster City, CA,
USA). Le immagini sono state acquisite attraverso un microscopio confocale
(Leica SP5, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) equipaggiato con 4 linee
di luce: a 405 nm, 488 nm, 543 e 633 nm. Le misurazioni quantitative e qualitative
sono state limitate alla SNpc e sono state ottenute da 25 sezioni (5
sezioni per ognuna delle 5 fettine).
Risultati – Azione della BMAA sulle proprietà di membrane e sulle variazioni
di calcio intracellulare nelle cellule della SNpc – Prima di tutto abbiamo indagato,
in modalità current-clamp, gli effetti della BMAA sulla capacità del neurone
di emettere potenziali d’azione (firing). L’applicazione in bagno (1.5-2
minuti) della BMAA (0.1-10 mM) aumentava la frequenza di firing spontaneo
in modo dose-dipendente (progressivamente da 0.7 ± 0.5 Hz a 4.5 ± 1.3 Hz) e
induceva una depolarizzazione di membrana rapida e reversibile (da 1.4 ± 0.1
mV a 19.6 ± 0.7 mV).
Registrazioni in modalità voltage-clamp hanno permesso di dimostrare
che la depolarizzazione di membrana indotta dalla BMAA era dovuta ad una
corrente entrante (inward, I BMAA
), la cui ampiezza media era compresa tra 20.8
± 3.85 pA e 1004 ± 160.3 pA in risposta a concentrazioni crescenti di BMAA
(0.1-10 mM). Per eseguire degli esperimenti di farmacologia della I BMAA
e delle
associate variazioni di calcio intracellulari abbiamo spruzzato la tossina (3
mM) ogni 2 minuti nelle immediate vicinanze della cellula registrata attraverso
applicazione di pressione positiva.
Per mezzo di questo approccio sperimentale, abbiamo ottenuto transienti
rapidi e riproducibili di I BMAAs
di ampiezza media 454.5 ± 34.6 pA (n = 73), che
erano accompagnati da transienti di calcio reversibili e riproducibili di 139.3
± 23.7 nM (n = 13). Poiché la forma b-carbammato della BMAA, prodotta in
una soluzione contenente bicarbonato, ha una struttura chimica simile al glu-
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