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Borse di studio
sui neuroni dopaminergici della SNpc e in minore misura i recettori AMPA.
Inoltre, la sua prolungata applicazione induce un massivo rilascio di cyt-c dai
mitocondri che viene mitigato dall’applicazione degli antagonisti dei recettori
mGluR1 e AMPA.
Materiali e metodi – Preparazione del tessuto – Ratti Wistar (P18-P22) (Laboratori
Charles River, Milano, Italia) sono stati anestetizzati profondamente
con l’alotano e decapitati. Il cervello è stato poi rapidamente rimosso dalla
scatola cranica e con il vibratomo sono state tagliate fettine orizzontali dello
spessore di 250 mm contenenti la SNpc. Queste sono state mantenute in una
soluzione (ACSF) contenente (mM): NaCl 126, KCl 2.5, MgCl 2
1.2, NaH 2
PO 4
1.2, CaCl 2
2.4, glucosio 10, e NaHCO 3
24; 290 mOsm -1 saturato con 95% O 2
-5%
CO 2
(pH 7.4). Dopo 30 minuti di stabilizzazione, una singola fettina è stata
trasferita in una cameretta di registrazione (volume 0.6 ml) e continuamente
sommersa da ACSF a 34-35 °C.
Registrazioni di patch-clamp – Registrazioni di whole cell patch clamp, combinate
a microfluorimetria, sono state effettuate sui neuroni della SNpc, localizzati
in una regione ad elevata densità neuronale adiacente al nucleo mediale
terminale del tratto ottico accessorio. La pipetta di registrazione (2-5 MW),
forgiata con il puller PP 83 Narishige (Tokyo, Giappone), è stata riempita con
una soluzione contenente (in mM): K-gluconato (115), CaCl 2
(4), MgCl 2
(2),
KCl (10), EGTA (10), Hepes (10), Mg 2
-ATP (2), Na 3
-GTP (0.3); pH 7.3; osmolarità
280 mOsm. Per esperimenti di microfluorimetria, è stata utilizzata la
seguente soluzione (mM): K-gluconato (135), CaCl 2
(0.1), MgCl 2
(2), KCl (10),
EGTA (0.75) e 0.25 fura-2 pentapotassium salt (Invitrogen, USA); pH 7.3;
osmolarità 280 mOsm.
Gli esperimenti in whole-cell voltage-clamp o current-clamp sono stati
condotti usando l’amplificatore Axopatch 200 B (Molecular Devices, CA,
USA), filtrati ad 1 kHz e digitalizzato a 10 kHz. In voltage-clamp il potenziale
di holding (V hold
) era -60 mV. Non è stata aggiunta nessuna corrente di holding
durante registrazioni in current-clamp. BMAA (3 mM), disciolta in ACSF, è
stata spruzzata nelle immediate vicinanze della cellula per applicazione di
pressione positiva (10 psi, 0.5-1.0 s), attraverso un elettrodo di registrazione
connesso al Pneumatic Pico-pump PV 800 (WPI, Berlino, Germania). Le
applicazioni sono state ripetute costantemente ogni 2 minuti. I dati sono stati
acquisiti usando i software Clampex e AxoScope (v.9, Molecular Devices).
Microfluorimetria – I neuroni sono stati riempiti usando una soluzione in
pipetta di registrazione contenente Fura-2 (sale pentapotassio), composto sensibile
al Ca 2+ (Invitrogen, USA). Un monocromatore (Till Photonics) ha fornito
una luce UV di eccitazione (340 and 380 nm). Le variazioni di fluorescenza
sono state espresse come “ Ratio ” (R) e calcolate con la seguente formula R =
(F 340soma
- F 340bg
)/(F 380soma
- F 380bg
), dove F 340
e F 380
erano le fluorescenze emesse ad
una lunghezza d’onda di eccitazione di 340 e 380 nm, rispettivamente, per il
corpo cellulare (soma) e lo sfondo (bg), misurate da una regione >100 mm
lontana dal corpo cellulare [Guatteo et al. (1998) J Neurophysiol 80: 2237-
2243]. I valori raziometrici sono stati convertiti in concentrazione usando il
metodo di Grynkiewicz et al. [(1985) J Biol Chem 260: 3440-3450].
2009 135