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Sezione II
moli. Per questo motivo è essenziale individuare quali Tirosin fosfatasi (PTP
Protein Tyrosin Phosphatase) possano riconoscere e defosforilare Y380 e contrastare
così gli effetti indotti da Src. A tale scopo sono stati condotti studi di
co-immunoprecipitazione di Caspasi-8 con diversi domini di PTP non cataliticamente
attivi (mutanti Trapping). Questi esperimenti preliminari hanno evidenziato
una possibile interazione funzionale fra la Caspasi-8 fosforilata in
Y380 ed un ampio numero di tirosin-fosfatasi, tra cui SHP1, SHP2, PTP-1B e
TC-PTP. Per quanto riguarda SHP1, questa induce la defosforilazione di molti
substrati di Src, è principalmente espressa in cellule della linea ematopoietica
e la sua alterazione conduce allo sviluppo di neoplasie linfoidi e mieloidi. È
importante sottolineare che un ruolo diretto nella defosforilazione di Caspasi-
8 da parte di SHP1 era stato precedentemente evidenziato in neutrofili apoptotici
[Hui Jia et al. (2008) JBC]. Per quanto riguarda le altre PTP isolate da
questo studio un loro ruolo nella defosforilazione di Caspasi-8 non era stato
finora caratterizzato. SHP2 e PTP1B sono fosfatasi ubiquitarie a differenza di
TC-PTP che è invece principalmente espressa in linfociti T.
Saggi di overespressione in cellule HEK293T e immunoprecipitazione di
Caspasi-8 con conseguente analisi con l’anticorpo anti P-Y380 hanno rilevato
che tutte queste fosfatasi sono in grado di defosforilare la Caspasi, sebbene
con diversa efficienza. Questa osservazione è inoltre stata confermata tramite
saggi di defosforilazione in vitro. In questi esperimenti i domini catalitici delle
diverse PTP sono stati purificati e la loro attività catalitica misurata osservando
la capacità di defosforilazione di un substrato sintetico (pNPP). L’estratto
proteico di cellule HEK293T over-esprimenti Caspasi-8 e Src è stato
quindi posto in incubazione a diversi tempi con le diverse PTP. A pari di attività
enzimatica è stato osservato che SHP1 e SHP2 defosforilano Y380 con
maggiore efficienza rispetto a PTP1B e TC-PTP.
Infine, studi preliminari hanno indicato che l’espressione di SHP1,
PTP1B e TC-PTP è in grado di risensibilizzare cellule DLD1R all’apoptosi
indotta da TRAIL. Ulteriori studi sono in corso per confermare questi dati e
definire un legame funzionale diretto fra defosforilazione di Y380 ad opera di
queste PTP e apoptosi.
IDENTIFICAZIONE DI MARCATORI DI TIPO IMMUNOLOGICO
A SCOPO DIAGNOSTICO E PROGNOSTICO
NELLE DEMENZE DEGENERATIVE (Antonio Ciaramella)
Introduzione – È stato descritto che il cervello delle persone colpite dalla
malattia di Alzheimer (AD) mostra un’intensa attivazione dei processi infiammatori
e della risposta immune innata [Akiyama et al. (2000) Neurobiol Aging
21: 383-421; Wyss-Coray (2006) Nat Med 12: 1005-1015]. Infatti, a livello delle
placche amiloidi, sono state identificate numerose cellule attivate della microglia
ed è stata descritta un’alterata espressione di citochine, chemochine e
proteine del complemento [McGeer et al. (1988) Neurology 38: 1285-1291].
Per questo motivo, di recente è emersa l’ipotesi che le citochine pro-infiammatorie
possano giocare un ruolo nella patogenesi dell’AD. In particolare,
studi condotti nel nostro laboratorio hanno evidenziato come l’interleuchina-
130 2009