0-TESTO COMPLETO.pdf - Fondazione Santa Lucia

Sezione II
Questi dati suggeriscono che l’assunzione di integratori alimentari a base
di BCAA può essere dannosa, essendo in grado di alterare le proprietà elettrofisiologiche
dei neuroni corticali.
ANALISI DELLA FOSFORILAZIONE DI CASPASI-8 NELLA TUMORIGENESI
E NELLA METASTATIZZAZIONE (Caterina Cenci)
Il progetto di lavoro svolto si è basato sull’analisi dei meccanismi che
regolano il ruolo non apoptotico di Caspasi-8, una proteina principalmente
nota per svolgere un ruolo essenziale nell’attivazione dei processi che inducono
alla morte cellulare. Cellule in cui Caspasi-8 è assente o inattiva sono
resistenti all’apoptosi indotta dai ligandi per i recettori di morte (Fas e
TRAIL). Sorprendentemente però, diversi studi hanno rilevato un ruolo non
apoptotico per questa proteina [per delle reviews Maelfait, Beyaert (2008) Biochem
Pharmacol 76: 1365-1373; Frisch SM (2008) Cancer Res 68: 4491-4493]
evidenziando una nuova funzione della Procaspasi-8 nel promuovere l’adesione
e la motilità cellulare, processi che contribuiscono in modo significativo
alla metastatizzazione dei tumori. Uno studio precedente ha indicato Caspasi-
8 come un nuovo substrato delle chinasi appartenenti alla famiglia Src [Cursi
et al. (2006) EMBO J 19: 931-941]. Src, che risulta aberrantemente attiva in
diversi tipi di tumori, fosforila Caspasi-8 alla Tirosina 380 (Y380), un residuo
aminoacidico situato nella regione di legame fra la subunità maggiore e
quella minore di Procaspasi-8. La fosforilazione di Y380 ad opera di Src
(Caspasi-8 P-Y380) interferisce col processamento della Procaspasi-8 e ne
impedisce l’attività proapoptotica. Src non è invece in grado di bloccare l’induzione
dei processi apoptotici in cellule in cui è espressa una variante di
Caspasi-8 che non può essere fosforilata (Caspasi-8Y380F).
Ruolo della fosforilazione di Caspasi-8 nei processi di ancoraggio e migrazione
cellulare – Diversi studi hanno evidenziato un ruolo della Procaspasi-8 nei processi
di migrazione cellulare. Sulla base di queste osservazioni è stato scelto di
analizzare il possibile ruolo della forma fosforilata di Caspasi-8 nella promozione
della crescita tumorale e della metastatizzazione. Per questo progetto
sono stati prodotti cloni di cellule in cui l’espressione della forma wild-type o
di quella non fosforilabile di Caspasi-8 è regolata tramite induzione con doxiciclina.
È stato scelto di utilizzare la linea DLD1R, cellule derivate da un
tumore del colon. Queste sono caratterizzate da livelli estremamente bassi di
Caspasi-8 e dalla presenza di Src attivo, da cui ne segue una resistenza all’apoptosi
indotta da Fas e TRAIL. I vettori inducibili pSMVcaspasi-8WT e
pSMVcaspasi-8Y380F sono stati clonati in laboratorio e trasfettati nelle cellule
che quindi sono state selezionate stabilmente e caratterizzate per la capacità
di esprimere Caspasi-8 in seguito a trattamento con doxiciclina. Esperimenti
di immunoprecipitazione anti-Caspasi-8 e conseguente immuno-detezione
con anticorpo anti fosfo-tirosina hanno permesso di confermare che Src
endogeno fosforila la forma wild type ma non quella mutata in Y380 della proteina.
Inoltre è stata calcolata l’efficienza di induzione della morte cellulare in
seguito a trattamento di queste cellule con TRAIL. Ciò è stato effettuato tramite
analisi al FACS dell’incorporazione cellulare di Propidio Ioduro ed ha
128 2009