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Sezione II
splicing. In seguito, per caratterizzare la regione di legame di Sam68 nel trascritto
di SMN2 sono stati utilizzati oligonucleotidi specifici per l’esone 7 di
SMN2 marcati con biotina, recanti o meno mutazioni nel sito di legame di
Sam68. I probe marcati sono stati legati ad una resina streptoavidin-sepharose
ed utilizzati per un saggio di pull-down da estratti nucleari di cellule
Hek293. Le proteine legate sono state eluite ed analizzate tramite Western
Blot per verificare la presenza di Sam68. È stato osservato che le mutazioni
nella sequenza “ consensus ” per Sam68 compromettono il legame della RBP
al trascritto di SMN2.
Un altro approccio utilizzato per studiare la funzione di Sam68 nel regolare
lo splicing di SMN2 è stato l’utilizzo di minigeni di SMN2 recanti mutazioni
del sito di legame di Sam68 all’esone 7. Questi costrutti sono stati trasfettati
in cellule Hek293 insieme a Sam68 e, mediante RT-PCR, è stato analizzato
l’effetto sull’inclusione dell’esone 7 di SMN2. Questi esperimenti hanno
mostrato che la mutazione del sito di legame di Sam68 su SMN2 compromette
profondamente l’esclusione dell’esone 7, abolendo completamente l’effetto
di Sam68 sullo splicing alternativo di SMN2.
Mutazioni che interferiscono con l’attività di Sam68 ricostituiscono l’inclusione
dell’esone 7 del pre-mRNA di SMN2 – La proteina Sam68 agisce come dimero
in vivo [Lukong, Richard (2003) Biochim Biophys Acta 1653: 73-86] ed interagisce
con hnRNPA1, un altro fattore di splicing che induce l’esclusione dell’esone
7 di SMN2 [Kashima, Manley (2003) Nat Genet 34: 460-463], attraverso il
suo dominio carbossi-terminale di 93 aa [Paronetto et al. (2007) J Cell Biol
176: 929-939]. Per interferire con la funzione di Sam68, sono stati utilizzati
dei dominanti negativi di questa RBP, uno in grado di dimerizzare con Sam68
wild type ma non di legare l’RNA (Sam68 V229F) e un altro in grado di interagire
con hnRNP A1 ma privo del dominio di omodimerizzazione e di legame
all’RNA (Sam68 351-443). Cellule Hek293 sono state trasfettate con i mutanti
di Sam68 insieme a Sam68 wild type o hnRNP A1. Attraverso RT-PCR è stato
osservato che l’over-espressione delle forme mutanti impedisce l’esclusione
dell’esone 7 indotta dalll’over-espressione di Sam68 o di hnRNP A1. I due
dominanti negativi di Sam68 agiscono, quindi, da competitori dell’esclusione
dell’esone 7 di SMN2 in vivo.
Dominanti negativi di Sam68 inducono l’inclusione dell’esone 7 e determinano
un incremento dei livelli della proteina SMN2 in cellule SMA – Per valutare l’effetto
dei dominanti negativi di Sam68 sullo splicing alternativo di SMN2 in un
contesto fisiologico, sono state utilizzate cellule derivanti da pazienti affetti da
SMA. Le cellule sono state infettate con i mutanti di Sam68 (V229F e 351-
443). Tramite RT-PCR, è stato osservato che l’espressione dei dominanti negativi
di Sam68 favorisce la formazione del trascritto full length di SMN2 endogeno
nelle cellule dei pazienti. Mediante Western Blot, è stato osservato un
incremento di SMN anche a livello proteico. Esperimenti di immunofluorescenza
hanno confermato l’aumento della proteina SMN e la sua localizzazione
nel nucleo nelle tipiche “ gemme ”, generalmente assenti nei pazienti
affetti da SMA. Questi esperimenti dimostrano che interferendo con l’attività
di splicing di Sam68 in vivo, attraverso l’uso di dominanti negativi, si è in
122 2009