0-TESTO COMPLETO.pdf - Fondazione Santa Lucia

Borse di studio
genesi della SMA. I pazienti affetti da questa patologia sono privi del gene
SMN1 e dotati di almeno una copia di SMN2 [Monani (2005) Neuron 48: 885-
896]. Tuttavia, SMN2 è in grado di supplire alla mancanza dell’omologo
SMN1 solo parzialmente. Infatti, SMN2 presenta all’interno dell’esone 7 la
sostituzione di una base (una C in posizione +6 di SMN1 sostituita da una T
in SMN2) che influisce profondamente sullo splicing determinandone l’esclusione
dal trascritto maturo. Questa singola sostituzione è alla base della differenza
di espressione dei due geni SMN1 e SMN2 [Monani et al. (1999) Hum
Mol Genet 8: 1177-1183]. Il trascritto principale che si origina da SMN1 in
condizioni normali è il full length (FL-SMN) che comprende tutti i nove esoni,
mentre il trascritto predominante di SMN2 è quello privo dell’esone 7, che
codifica per una proteina tronca instabile nelle cellule [Lefebvre et al. (1997)
Nat Genet 16: 265-269]. I pazienti affetti da SMA, di conseguenza, esprimono
bassi livelli di proteina funzionale FL-SMN.
Poiché l’esclusione dell’esone 7 di SMN2 è alla base della instabilità della
proteina prodotta e quindi la causa principale della patologia, numerosi studi
hanno focalizzato l’attenzione sulla regolazione di questo evento di splicing.
Un possibile candidato è la proteina Sam68, una RNA-binding protein (RBP)
coinvolta in diversi aspetti del metabolismo degli mRNA quali lo splicing, l’esporto
e la traduzione di mRNA [Lukong, Richard (2003) Biochim Biophys
Acta 1653: 73-86]. Nella sequenza dell’esone 7 di SMN2 è presente un perfetto
sito di legame per Sam68, suggerendo che questa proteina possa svolgere un
ruolo in questo evento di splicing. Il progetto di ricerca si propone di studiare
il possibile ruolo di Sam68 nello splicing alternativo di SMN2.
Risultati – Sam68 influenza lo splicing alternativo dell’esone 7 di SMN2 – Per
studiare l’effetto di Sam68 sullo splicing alternativo dell’esone 7 di SMN2, cellule
Hek293 sono state trasfettate con un costrutto codificante per Sam68 e
con un minigene specifico per SMN2, consentendo di distinguere SMN2
ricombinante dalle forme SMN1 e SMN2 endogene. L’RNA totale è stato
estratto e mediante RT-PCR è stato valutato il rapporto di espressione del trascritto
FL-SMN2 e del trascritto privo dell’esone 7. Questi esperimenti hanno
dimostrato che Sam68 aumenta l’esclusione dell’esone 7 di SMN2. Abbassando
i livelli intracellulari di Sam68 attraverso esperimenti di RNA interference,
trasfettando cellule Hek293 con oligo double strand specifici per
Sam68, è stato invece osservato un aumento dell’inclusione dell’esone 7, confermando
il coinvolgimento di questa RBP nella regolazione dello splicing
alternativo di SMN2.
L’attività di legame all’RNA di Sam68 è necessaria per l’esclusione dell’esone 7 di
SMN2 – Per studiare la funzione di Sam68 nel regolare lo splicing alternativo
di SMN2 sono stati utilizzati dei mutanti di Sam68 in cui viene compromesso
il legame all’RNA [Paronetto et al. (2007) J Cell Biol 176: 929-939]. Questi
costrutti sono stati trasfettati in cellule Hek293 insieme al minigene di SMN2
e mediante RT-PCR è stato valutato l’effetto dell’over-espressione delle forme
mutanti di Sam68 sull’inclusione dell’esone 7. È stato osservato che nessuno
dei mutanti è in grado di indurre l’esclusione dell’esone 7 di SMN2, indicando
che l’attività di legame all’RNA di Sam68 è necessaria per questo evento di
2009 121