Solo testo.pdf - Fondazione Santa Lucia

Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
Successiva conferma dell’esistenza di associazione tra espressione di IL-
18 e/o eventuali molecole ad essa correlate e parametri di deficit cognitivo
rilevati in topi con EAE.
METODOLOGIA
Per lo studio dell’espressione di IL-18 e delle molecole ad essa correlate
nei topi EAE, verranno prelevati dagli animali monociti e macrofagi isolati
dalla milza e/o da lavaggi peritoneali. Più in dettaglio, dai topi EAE sacrificati
in diversi momenti dopo l’immunizzazione, verranno prelevate sterilmente e
disperse le milze mediante disgregazione meccanica. Le sospensioni cellulari
ottenute, dopo lisi dei globuli rossi, verranno lavate in RPMI, contate in
trypan blue ed incubate in terreno completo a +37°C, 5% CO 2
, in assenza o in
presenza di molecole infiammatorie (es. LPS). I sovranatanti di coltura e gli
splenociti verranno rispettivamente analizzati per valutare l’espressione di
IL-18 e IL-18 Binding Protein (IL-18BP) mediante saggi immunoenzimatici
commerciali (MBL e R&D Systems), oppure mediante l’analisi in Real-Time
PCR volta a valutare l’espressione genica della citochina. Verranno inoltre
analizzate tramite citofluorimetria a flusso le due catene recettoriali di IL-18
(IL-18Rα e IL-18Rβ) in associazione all’espressione dei principali marcatori
molecolari caratteristici delle popolazioni cellulari presenti nella milza
(es. CD3, CD4, CD8, CD19, CD94, CD14).
In alternativa, verranno utilizzati i macrofagi peritoneali, ottenuti in
seguito a lavaggio con PBS della cavità peritoneale. I macrofagi ottenuti verranno
messi in coltura in terreno completo in presenza di opportuni stimoli
infiammatori (es. LPS). Anche in questo caso verranno analizzati i livelli di
IL-18, IL-18BP sia in termini di concentrazione proteica nei sovranatanti di
coltura, tramite saggi immunoenzimatici, sia mediante analisi dei livelli di
espressione genica con Real-Time PCR. I macrofagi peritoneali saranno inoltre
analizzati tramite citofluorimetria a flusso per verificare l’espressione di
IL-18Rα e IL-18Rβ in associazione all’espressione dei principali marcatori
molecolari di questa popolazione cellulare murina (es. CD14, CD11b, CD11c,
CD16, CD32, CD64, MHC-I e MHC-II). Allo scopo di verificare l’efficacia del
sistema IL-18 quale possibile marcatore di patologia nell’EAE, in particolare
in associazione al deficit cognitivo, i risultati ottenuti da questa attività verranno
comparati con i risultati derivati dagli altri studi di questo stesso WP1.
Parallelamente, nel WP2 sarà valutata l’espressione dell’IL-18 e delle
molecole ad essa correlate (IL-18BP, IL-18Rα, IL-18Rβ) nel siero e
nei PBMC isolati da pazienti con MS con deficit cognitivi e dei relativi soggetti
di controllo. A tale scopo il sangue proveniente dai pazienti verrà
raccolto per mezzo di provette contenenti un attivatore della coagulazione per
preparare il siero che, aliquotato e conservato a -80°C, sarà utilizzato per
analizzare tramite saggi immunoenzimatici la quantità circolante di IL-18 e di
IL-18BP.
Parallelamente, dallo stesso prelievo, il sangue sarà raccolto anche in provette
contenenti EDTA, quindi in seguito a passaggio su gradiente di densità,
verranno recuperate le cellule mononucleate. Queste cellule saranno stimolate
2006 797