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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
METODOLOGIA
Nell’ambito della prima fase del programma, verranno utilizzate le
seguenti metodologie per l’analisi dei modelli animali EAE a vari stadi di progressione
della malattia, e associata a relativi controlli non trattati.
1. Valutazione in situ su sezioni di tessuto nervoso ex-vivo, mediante tecniche
di analisi istopatologica, immunoistochimica, analisi ultrastrutturale al
microscopio elettronico ed eventualmente immunorivelazione su sezioni
ultrafini pre-incubate con l’anticorpo d’interesse, dei tratti biomorfologici
caratteristici delle cellule apoptotiche e dei canonici marcatori molecolari di
apoptosi (attività caspasica, livelli di espressione dell’apoptosoma, sua localizzazione
sub-cellulare e frammentazione del DNA). Su estratti proteici da tessuto
verrà inoltre analizzato il grado di attivazione delle calpaine, il livello di
espressione nel tempo delle proteine della risposta allo shock termico (hsp70,
hsp27) e delle superossido dismutasi, per valutare il grado di stress cellulare
in atto. Si valuteranno poi marcatori della progressione del danno cellulare,
ossia i cosiddetti marcatori sub-letali, quali la localizzazione della catalasi
perossisomiale ed il grado di fosforilazione della proteina tau. Infine sarà analizzato
il processo autofagico mediante il rilevamento ultrastrutturale della
presenza di vescicole autofagiche, lo studio della lipidazione di LC3 e della
sua traslocazione agli autofagosomi, la localizzazione dei precursori autofagici
Beclin-1 e Ambra-1.
2. Valutazione in situ su cellule primarie e preparati freschi (tissue slices)
derivate da regioni specifiche del sistema nervoso di animali EAE mediante le
tecniche sopradescritte ed a tempi diversi di coltura a partire dall’espianto (ad
esempio, l’attivazione delle calpiane verrà valutata dopo 20 giorni d’incubazione).
In questi sistemi in vitro si potrà anche modulare la risposta apoptotica
ed autogafica, mediante induzione di entrambi i processi. Per il rilevamento
dell’autofagia sarà possibile applicare la tecnica della misurazione del grado di
acidificazione vescicolare previo trattamento con il colorante Arancio d’acridina
e successiva valutazione al citofluorimetro dello spettro di emissione.
Nella seconda fase del programma, si utilizzeranno diverse metodologie
per l’analisi dei processi di morte cellulare in diverse popolazioni di cellule
Treg di pazienti affetti da MS in presenza o assenza di deficit cognitivo. In
particolare, verranno testati in sospensioni cellulari in situ mediante tecniche
di microscopia confocale ed in vitro, su estratti derivati, i livelli di mRNA e
proteine codificati da geni chiave dei percorsi metabolici (pathways) intrinseci
ed estrinseci dell’apoptosi, quali Fas, FasL, TNF, TNFR, TRAIL, APAF1,
CASP9, CASP7, CASP3, CASP12. Verrà anche valutata la capacità di tali cellule
di attivare il pathway mitocondriale dell’apoptosi, mediante la rilevazione
dell’avvenuto rilascio del citocromo c dal mitocondrio, un marcatore dell’attivazione
dell’apoptosoma, in seguito ad esperimenti di frazionamento subcellulare
e successivi esperimenti di immunoblotting. Seguiranno approcci
biochimici e fluorimetrici per l’analisi dell’attivazione delle caspasi in tali
popolazioni cellulari ed in modo differenziale fra gruppi di pazienti selezionati
dalle altre U.O.
2006 795