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Sezione III: Attività per progetti U.O. 1 – Unità di Neuroimmunologia Luca Battistini OBIETTIVO FINALE DEL CONTRIBUTO Identificazione di Markers fenotipici o funzionali utili a identificare nuove sottopopolazioni di linfociti T regolatori nei topi EAE e nei pazienti affetti da Sclerosi Multipla con disturbi cognitivi. Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali. OBIETTIVI INTERMEDI Validazione delle tecniche di “ sorting ” ad alta velocità e di analisi fenotipica a 7 colori mediante citofluorimetria per gli obiettivi prefissati. Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali. Alla fine della prima fase del progetto il responsabile dell’U.O. dovrebbe scrivere un riassunto dei risultati ottenuti, descrivendo le priorità sperimentali nei successivi 12 mesi per portare a termine gli obiettivi proposti. METODOLOGIA L’espressione di recettori per le chemochine e di marcatori della memoria immunologica verrà analizzata in combinazione con marcatori caratteristici delle cellule Treg (CD3, CD4, CD25), permettendo così l’identificazione delle diverse sottopopolazioni Treg. Mediante citofluorimetria policromatica verranno analizzati fino a 9 parametri su ogni singola cellula, ottenendo così un “ ritratto ” preciso delle sottopopolazioni linfocitarie. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) verranno isolate dal sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla mediante centrifugazione su gradiente discontinuo di densità (Ficoll-hypaque), seguendo procedure standard. Per ciascuna marcatura verranno utilizzate 0.5 × 10 6 PBL, in un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali, coniugati con i fluorocromi appropriati, verranno aggiunti sterilmente alle concentrazioni ottimali predeterminate, e le cellule saranno incubate a 4 C per 10 minuti. Le cellule verranno quindi lavate due volte, risospese in 250 µl PBS con 0,5% FCS, e passate al citofluorimetro per l’analisi. Per ogni campione verranno acquisiti 2 × 10 6 eventi per permettere una precisa valutazione di ogni sottopopolazione linfocitaria. 792 2006
Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM… Per la caratterizzazione delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati i seguenti reagenti: Pannello linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d. Pannello cellule effettrici: CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L. Pannello cellule attivate: CD25, CD56, CD69, CD154. L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto (Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High Speed Cell Sorter MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione dei dati e il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica. 2006 793
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