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Sezione III: Attività per progetti
U.O. 1 – Unità di Neuroimmunologia
Luca Battistini
OBIETTIVO FINALE DEL CONTRIBUTO
Identificazione di Markers fenotipici o funzionali utili a identificare
nuove sottopopolazioni di linfociti T regolatori nei topi EAE e nei pazienti
affetti da Sclerosi Multipla con disturbi cognitivi.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati finali
Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali.
OBIETTIVI INTERMEDI
Validazione delle tecniche di “ sorting ” ad alta velocità e di analisi fenotipica
a 7 colori mediante citofluorimetria per gli obiettivi prefissati.
Criteri e indicatori per la verifica dei risultati intermedi
Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali. Alla fine della prima
fase del progetto il responsabile dell’U.O. dovrebbe scrivere un riassunto dei
risultati ottenuti, descrivendo le priorità sperimentali nei successivi 12 mesi
per portare a termine gli obiettivi proposti.
METODOLOGIA
L’espressione di recettori per le chemochine e di marcatori della memoria
immunologica verrà analizzata in combinazione con marcatori caratteristici
delle cellule Treg (CD3, CD4, CD25), permettendo così l’identificazione delle
diverse sottopopolazioni Treg. Mediante citofluorimetria policromatica verranno
analizzati fino a 9 parametri su ogni singola cellula, ottenendo così un
“ ritratto ” preciso delle sottopopolazioni linfocitarie.
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) verranno isolate
dal sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla mediante centrifugazione
su gradiente discontinuo di densità (Ficoll-hypaque), seguendo procedure
standard. Per ciascuna marcatura verranno utilizzate 0.5 × 10 6 PBL, in
un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali, coniugati con i fluorocromi
appropriati, verranno aggiunti sterilmente alle concentrazioni ottimali
predeterminate, e le cellule saranno incubate a 4 C per 10 minuti. Le cellule
verranno quindi lavate due volte, risospese in 250 µl PBS con 0,5% FCS, e
passate al citofluorimetro per l’analisi. Per ogni campione verranno acquisiti
2 × 10 6 eventi per permettere una precisa valutazione di ogni sottopopolazione
linfocitaria.
792 2006