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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
CD4+CD25 neg possono essere sortate, e in effetti le cellule CD4+CD25 high sono in
grado di inibire la proliferazione di cellule stimolate con anti-CD3; al contrario,
le cellule CD4+CD25 low proliferano vigorosamente insieme alle cellule “ responder
”, confermando che si tratta di una popolazione di cellule attivate prive di
abilità soppressorie. Come previsto, le cellule CD25 neg , che sono costituite principalmente
da cellule naive non effettrici, non inibiscono la proliferazione.
L’espressione di recettori per le chemochine, e di marcatori della memoria
immunologica verrà analizzata in combinazione con marcatori
caratteristici delle cellule Treg (CD3, CD4, CD25), permettendo così l’identificazione
delle diverse sottopopolazioni Treg. Mediante citofluorimetria
policromatica verranno analizzati fino a 7 parametri su ogni singola cellula,
ottenendo così un “ ritratto ” preciso delle sottopopolazioni linfocitarie. Le
cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) verranno isolate dal
sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla mediante centrifugazione
su gradiente discontinuo di densità (Ficoll-hypaque), seguendo procedure
standard. Per ciascuna marcatura verranno utilizzate 0.5x10 6 PBL,
in un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali, coniugati con i
fluorocromi appropriati, verranno aggiunti sterilmente alle concentrazioni
ottimali predeterminate, e le cellule saranno incubate a 4 C per 10 minuti.
Le cellule verranno quindi lavate due volte, risospese in 250 µl PBS con
0,5% FCS, e passate al citofluorimetro per l’analisi. Per ogni campione verranno
acquisiti 2 × 10 6 eventi per permettere una precisa valutazione di ogni
sottopopolazione linfocitaria.
Per la caratterizzazione delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati
i seguenti reagenti: Pannello linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d.
Pannello cellule effettrici: CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L. Pannello
cellule attivate: CD25, CD56, CD69, CD154.
L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto
(Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High Speed Cell Sorter
MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione dei dati e
il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica.
Valuteremo inoltre l’espressione di IL-18 e delle molecole ad essa correlate
(IL-18 BP, IL-18Rα, IL-18Rβ) nel siero e nei PBMC isolati da pazienti con
MS con deficit cognitivi e non. Mediante analisi immunoenzimatica saranno
valutati i livelli circolanti di IL-18 e del suo antagonista IL-18BP. Inoltre, con
le cellule ottenute dagli stessi individui saranno effettuate delle stimolazioni
in vitro e l’espressione di IL-18, IL-18 Binding Protein e delle due catene recettoriali
di IL-18, verrà valutata mediante PCR quantitativa (Real Time PCR),
saggi immunoenzimatici e citofluorimetrici. Allo scopo di verificare l’efficacia
del sistema IL-18 quale possibile marcatore di patologia nell’MS i risultati
ottenuti da questa attività verranno comparati con i risultati derivati dagli
altri studi di questo stesso WP.
Studio biomolecolare dei processi di morte cellulare nel sistema immune
– Alcuni sistemi ligando-recettore della famiglia dei recettori di morte,
quali il sistema TNF od il sistema CD95/Fas, orchestrano in modo efficace la
risoluzione dell’infiammazione ed il controllo delle reazioni immuni definendo
2006 789