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Sezione III: Attività per progetti
ranno o meno deficit cognitivi. Tali fettine comprenderanno il nucleo striato e
la corrispondente corteccia cerebrale. Da tali fettine, mantenute vitali grazie
ad un sistema di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato e
mantenuto a temperatura costante, verranno effettuate delle registrazioni
elettrofisiologiche da singolo neurone striatale. La tecnica utilizzata sarà
quella del “ whole-cell recording ” in modalità di “ voltage-clamp ”. I neuroni
striatali verranno individuati per le loro proprietà di membrana e morfologiche.
L’identificazione morfologica sarà possibile grazie all’impiego di una tecnica
di microscopia a raggi infrarossi che permetterà di distinguere i neuroni
di minore diametro cellulare (20-30 µm), tipico dei neuroni di proiezione, da
quelli di maggiori dimensioni (30-50 µm), tipico degli interneuroni.
Allo scopo di isolare farmacologicamente gli eventi sinaptici GABAergici
da quelli glutammatergici, tutte le nostre registrazioni verranno inizialmente
effettuate in presenza di CNQX ed MK-801 per bloccare sia i recettori AMPA
che NMDA del glutammato. Grazie ad un elettrodo di stimolazione bipolare
posto all’interno dello striato, stimoleremo le fibre GABAergiche e registreremo
in questo modo delle correnti postsinaptiche inibitorie evocate (eIPSCs)
nei neuroni registrati. Studieremo inoltre la frequenza e l’ampiezza delle correnti
postsinaptiche inibitorie spontanee (sIPSCs), registrate cioè senza
alcuna stimolazione. Così come visto per la trasmissione GABAergica, le eventuali
alterazioni sinaptiche presenti nei topi EAE con e senza deficit cognitivi
verranno valutate sia su correnti postsinaptiche eccitatorie evocate (eEPSCs)
che spontanee (sEPSCs).
Studio immunologico – Dagli animali sacrificati verrà prelevata la milza
per un parallelo studio immunologico.
Nel presente progetto intendiamo studiare le caratteristiche fenotipiche e
funzionali di sottopopolazioni linfocitarie in vivo, nei topi EAE con deficit
cognitivi e non. Studieremo la frequenza e distribuzione delle sottopopolazioni
linfocitarie T effettrici e T regolatorie e le loro caratteristiche di memoria
immunologica e di attivazione nei diversi gruppi di animali. Lo stato di
attivazione linfocitaria verrà poi valutato in relazione alle varie fasi di malattia
e alle eventuali alterazioni cognitive e neurofisiologiche.
Le cellule della milza vengono isolate mediante centrifugazione su gradiente
discontinuo di densità (Ficoll-hypaque). Brevemente, dopo centrifugazione
per 30 minuti a 660g, le cellule mononucleate sono raccolte dall’interfaccia
del gradiente e lavate tre volte in RPMI centrifugando nuovamente a
430g per 10 minuti ed infine sospese in RPMI 1640 supplementato con 10%
FCS, 2mM di L-glutammina e 10 U/ml di penicillina e streptomicina e utilizzate
per l’analisi citofluorimetrica.
Anticorpi specifici per CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD49d, CD62L,
CD69, CCR6, αβ TCR saranno acquistati da Becton-Dickinson. L’analisi
dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro FACSCanto Becton Dickinson,
Cyan e su Sorter MoFlo (Dako). Per ogni campione verranno selezionati
15.000 linfociti in base a criteri di dimensione (FSC) e di granulosità
(SSC). I risultati saranno analizzati usando i software Summit (Cytomation)
e FloJo (TreeStar).
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