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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
di individuare e caratterizzare quei fattori che sono in primo piano nella fase
infiammatoria e degenerativa immunomediata. Le molteplici metodiche e
competenze professionali coinvolte nel presente progetto permetteranno di
osservare da varie angolazioni gli eventi cellulari, immunologici e biomolecolari
coinvolti nel processo di danno neuronale responsabile di deficit cognitivi
in patologie demielinizzanti, fornendo una visione completa dei meccanismi
patologici operanti.
L’obiettivo finale del progetto è quello di individuare e validare markers
biologici e funzionali associati a deficit cognitivi in pazienti con Sclerosi Multipla.
Per raggiungere tale obiettivo diversi aspetti del problema verranno studiati.
Metodiche di citometria a flusso, elettrofisiologia, biologia molecolare e
metodiche più classicamente immunologiche (ELISA, proliferazioni, assays di
migrazione e di adesione, etc.) verranno impiegati. Sia pazienti con SM sia
topi affetti dalla forma sperimentale di malattia (EAE) con deficit cognitivi e
non verranno impiegati per avere la possibilità di confermare anche in vivo in
topi con EAE ciò che verrà misurato ex-vivo nei pazienti. Il gruppo proponente
è qualificato per svolgere tale progetto, possiede competenze complementari
ed ha una lunga e documentata esperienza nella materia oggetto
dello studio. Il progetto si divide in 2 workpackages che di seguito sono
meglio dettagliati.
WP 1 – L’induzione della EAE dovrà avvenire in topi C57/bl6 femmine
(6-8 settimane) mediante immunizzazione con iniezione sottocutanea di 200
microgrammi di MOG35-55 (o peptide PLP 139-151 per il modello ricorrenteremittente)
in adiuvante di Freund (Difco, Detroit, MI, USA) supplementato
con 4 mg/ml di Micobacterium tuberculosis (ceppo H37Ra; Difco). I topi,
inoltre, riceveranno 500 ng di tossina pertussica ev (Sigma, St. Louis, MI,
USA) al momento dell’immunizzazione e 48 ore dopo.
Nei topi con EAE, le valutazioni comportamentali, immunologiche, biomolecolari
ed elettrofisiologiche verranno effettuate durante le fasi acuta e
cronica di malattia che seguono l’immunizzazione.
Studio comportamentale – Verranno messi a punto test comportamentali
in grado di valutare in topi affetti da EAE funzioni cognitive come la memoria
spaziale, la memoria associativa e la velocità di elaborazione. Ottimizzeremo
i protocolli per il radial maze, il fear-conditioning e il conditioning taste aversion
per topi affetti da EAE cronica o ricorrente remittente, adattandoli alle
loro abilità motorie. Useremo due modelli differenti di EAE, uno cronicoprogressivo
indotto in topi C57/BL6 mediante immunizzazione con MOG35-
55 e uno di EAE ricorrente-remittente indotto in topi SJL mediante immunizzazione
con PLP139-151. La memoria spaziale sarà valutata mediante radial
maze, la memoria associativa mediante fear-conditioning e il conditioning
taste aversion, mentre la velocità di elaborazione sarà indagata usando protocolli
ravvicinati o spaziati dei due test precedenti. Le abilità motorie saranno
valutate prima dei test cognitivi mediante footprint e rotarod.
Studio elettrofisiologico – Mediante l’impiego di un vibratomo verranno
preparate delle fettine di tessuto cerebrale dei topi con EAE che presente-
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