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Valutazione neurofisiologica e immuno-molecolare in topi EAE e in pazienti con SM…
estratti proteici da tessuto verrà inoltre analizzato il grado di attivazione delle
calpaine, il livello di espressione nel tempo delle proteine della risposta allo
shock termico (hsp70, hsp27) e delle superossido dismutasi, per valutare il
grado di stress cellulare in atto. Si valuteranno poi marcatori della progressione
del danno cellulare, ossia i cosiddetti marcatori sub-letali, quali la
localizzazione della catalasi perossisomiale ed il grado di fosforilazione della
proteina tau. Infine sarà analizzato il processo autofagico mediante il rilevamento
ultrastrutturale della presenza di vescicole autofagiche, lo studio della
lipidazione di LC3 e della sua traslocazione agli autofagosomi, la localizzazione
dei precursori autofagici Beclin-1 e Ambra-1. (b) Valutazione in situ su
cellule primarie e preparati freschi (tissue slices) derivati da regioni specifiche
del sistema nervoso di animali EAE mediante le tecniche sopradescritte ed a
tempi diversi di coltura a partire dall’espianto (ad esempio, l’attivazione delle
calpiane verrà valutata dopo 20 giorni d’incubazione). In questi sistemi
in vitro si potrà anche modulare la risposta apoptotica ed autofagica,
mediante induzione di entrambi i processi. Per il rilevamento dell’autofagia
sarà possibile applicare la tecnica della misurazione del grado di acidificazione
vescicolare previo trattamento con il colorante Arancio d’acridina e successiva
valutazione al citofluorimetro dello spettro di emissione.
Test neurofisiologici – La tecnica di registrazione elettrofisiologica da singolo
neurone impiegata sarà quella di “ whole-cell patch clamp recording ”.
TRASFERIBILITÀ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI
Il miglioramento delle conoscenze scientifiche sulla patogenesi dei
disturbi cognitivi associati alla Sclerosi Multipla resta un obiettivo essenziale
per lo sviluppo di interventi terapeutici atti ad arrestare, ed eventualmente far
regredire, l’evoluzione del processo patologico che ne è alla base. Lo scopo
ultimo della nostra ricerca è pertanto quello di individuare dei target molecolari
e cellulari per interventi terapeutici alternativi (o complementari) a quelli
esistenti.
La qualità dei risultati finali raggiunti potrà essere valutata sulla base
della coerenza dei risultati stessi e la correttezza sperimentale utilizzata nel
loro raggiungimento. Per risultati attinenti alla ricerca di base, quali quelli
del presente progetto, lo strumento principale e comunemente accettato
per la verifica della qualità dei risultati sperimentali è dato dal giudizio di
referees internazionali, a seguito di pubblicazioni scientifiche su riviste
nazionali ed internazionali, oltre che da resoconti avuti a seguito di partecipazioni
a congressi.
I sistemi modello allestiti nel presente progetto, inoltre, saranno disponibili
per la comunità scientifica per test pre-clinici di farmaci dopo la pubblicazione
dei risultati. Allo stesso modo, i marcatori recettoriali, postrecettoriali,
sinaptici, molecolari, comportamentali e immunologici messi in luce alla fine
del progetto saranno disponibili per testare ipotesi e per la messa a punto di
trattamenti terapeutici razionali per la cura delle malattie autoimmuni del
sistema nervoso centrale.
2006 783