Solo testo.pdf - Fondazione Santa Lucia

Sezione III: Attività per progetti
la camera di training ha quattro pareti opache e una griglia elettrificata. Il
training e il test di contesto verranno effettuati in questa camera. Il test
dello stimolo viene effettuato in una camera differente. Il rumore di background
deve essere inferiore a 55dB. Un altoparlante e una videocamera
miniaturizzata saranno sospesi sopra le camere. I topi saranno esposti alla
camera di conditioning per 10min per i due giorni precedenti il training. Ai
topi verrà quindi somministrato il fear-conditioning consistente in 1min di
adattamento, 3min di conditioning che iniziano con 15sec di presentazione
del suono con shock elettrico negli ultimi due sec (delay fear-conditioning)
o 15sec dopo la fine del suono (trace fear-conditioning). Il test di contesto
consiste di 2min senza tono, mentre il test di stimolo di un min senza stimolo
e 1min con stimolo. Durante ogni trial verranno registrati la frequenza
di freezing in continuo sia in manuale che con registrazione automatica. (c)
Conditioned taste aversion: topi saranno messi in deprivazione d’acqua somministrando
acqua due volte al giorno per mezz’ora. Nel giorno del condizionamento
avranno a disposizione una soluzione di saccarina al 5% per
mezz’ora alla fine della quale i topi riceveranno un’iniezione intraperitoneale
di LiCl (0.15M, 20ml/kg) per causare nausea. Dopo 48, 72, e 96 h, ai
topi viene presentata saccarina o acqua per testare l’evitamento i contenitori
contenenti i fluidi per misurare il consumo.
Test immunologici – Le cellule mononucleate del sangue periferico
(PBMC) verranno isolate dal sangue periferico dei pazienti affetti da Sclerosi
Multipla mediante centrifugazione su gradiente discontinuo di densità (Ficollhypaque),
seguendo procedure standard. Per ciascuna marcatura verranno
utilizzate 0.5×10 6 PBL, in un volume finale di 100 µl. Gli anticorpi monoclonali,
coniugati con i fluorocromi appropriati, verranno aggiunti sterilmente
alle concentrazioni ottimali predeterminate, e le cellule saranno incubate a
4 C per 10 minuti. Le cellule verranno quindi lavate due volte, risospese in
250 µl PBS con 0,5% FCS, e passate al citofluorimetro per l’analisi. Per
ogni campione verranno acquisiti 2x10 6 eventi per permettere una precisa
valutazione di ogni sottopopolazione linfocitaria. Per la caratterizzazione
delle cellule T effettrici regolatorie, verranno usati i seguenti reagenti: Pannello
linfocitario: CD3, CD4, CD25, CCR6 e CD49d. Pannello cellule effettrici:
CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD62L, pannello cellule attivate: CD25,
CD56, CD69, CD154. L’analisi dei campioni verrà effettuata su citofluorimetro
FACSCanto (Becton Dickinson), su citofluorimetro CyAn (Dako) e su High
Speed Cell Sorter MoFlo (Dako), utilizzando il software Summit per l’acquisizione
dei dati e il software FlowJo per l’analisi e la compensazione multiparametrica.
Test biomolecolari –(a) Valutazione in situ su sezioni di tessuto nervoso
ex-vivo, mediante tecniche di analisi istopatologica, immunoistochimica, analisi
ultrastrutturale al microscopio elettronico ed eventualmente immunorivelazione
su sezioni ultrafini pre-incubate con l’anticorpo d’interesse, dei tratti
biomorfologici caratteristici delle cellule apoptotiche e dei canonici marcatori
molecolari di apoptosi (attività caspasica, livelli di espressione dell’apoptosoma,
sua localizzazione sub-cellulare e frammentazione del DNA). Su
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