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Meccanismi di danno neuronale alla base della neurodegenerazione nelle patologie…
zione di Krebs (2-3 ml/min) gassato con una miscela di carbossigeno e mantenuto
ad una temperatura costante. Il completo ricambio della soluzione nella
camera richiede approssimativamente 90 secondi. La composizione della
soluzione di Krebs è (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 MgCl2, 1.2 Na2HPO4,
2.4 CaCl2, 11 glucosio, 25 NaHCO3. Vengono utilizzati microelettrodi
“ sharp ” per registrazioni intracellulari, riempiti con 2M KCl (35-60 MOhm).
Registrazioni con microelettrodi “ sharp ” – Viene utilizzato un amplificatore
Axoclamp-2A per le registrazioni sia in modalità di current-clamp che di
voltage-clamp. Nella modalità di voltage-clamp a singolo elettrodo, la frequenza
di campionamento è di 3 KHz. Il segnale proveniente dall’headstage è
visualizzato su un differente oscilloscopio. La traccia è visualizzata su un
oscilloscopio e memorizzata in un sistema digitale. Per la stimolazione sinaptica
vengono utilizzati elettrodi bipolari, localizzati nel corpus callosum o
nello striato, vicini all’elettrodo di registrazione (0.3-0.6 mm). I potenziali
sinaptici sono la media aritmetica di 4-8 risposte +/- S.E.M.
Registrazioni in patch-clamp – Le registrazioni in patch-clamp nella configurazione
whole-cell vengono effettuate usando pipette tirate col puller
Flaming-Brown e rifinite con la fiamma prima dell’uso. Le fettine striatali
coronali (300 µm mantenuto a 33°) vengono incubate in tampone HEPES-
HBSS, gassato con 100% O2. Dopo trenta minuti, una fetta viene trasferita in
una camera di registrazione montata su di un microscopio a luce trasmessa.
Le pipette utilizzate per le registrazioni in patch-clamp hanno una resistenza
compresa tra 3 ed 8 MOhm, riempite con la soluzione interna composta da
(in mM): 180 -aminoethylβN-methyl-D-glucamina, 40 HEPES, 10 ethylene
glycol bis (ether)-N,N’-tetraacetic acid, 4 MgCl2, 2-4 ATP, 0-0.2 GTP; il pH
viene corretto a 7.3 con KOH; l’osmolarità è 275-285 mOsmol/l. Dopo aver
ottenuto il seal della cellula, questa viene perfusa con soluzione Krebs (vedi
composizione sopra) a 33°C. Le registrazioni vengono effettuate con un Axopatch
1D. Per l’acquisizione e l’analisi dei dati viene utilizzato il software
pClamp9.
Imaging dei livelli ionici intracellulari – Per registrazioni ottiche ed elettriche
simultanee la punta del microelettrodo sharp viene riempita con una
soluzione 1 mM bisfura2 o 5 mM SBFI in 100 mM KCl, per le misurazioni del
livello intracellulare di calcio o di sodio, rispettivamente; il microelettrodo
viene poi riempito con 2 M KCl. Dopo che è stata impalata, la cellula viene
riempita di bisfura2 o SBFI mediante l’iniezione di corrente negativa (0.1-0.2 nA)
per alcuni minuti. Le sostanze vengono applicate diluendole alla concentrazione
finale desiderata nella soluzione di Krebs e passando dalla perfusione
con Krebs (soluzione salina di controllo) alla soluzione contenente la
sostanza. Per le registrazioni elettrofisiologiche viene utilizzato un amplificatore
Axoclamp-2A (Axon Instruments). Le tracce sono visualizzate su un oscilloscopio
e memorizzate in un sistema digitale. La camera di registrazione è
montata su di un microscopio a luce trasmessa (Zeiss), equipaggiato con
un obbiettivo 60X ad immersione in soluzioni acquose (Olympus). La fluorescenza
degli indicatori bisfura2 ed SBFI è eccitata mediante epi-illuminazione;
la luce è prodotta da una lampada allo Xenon da 75W e la lunghezza
2006 735