Solo testo.pdf - Fondazione Santa Lucia

Sezione III: Attività per progetti
immunoistochimica e di valutazioni comportamentali. Saranno utilizzati dei
modelli di topi transgenici portatori di mutazioni genetiche patologiche
nell’uomo. Ci avvarremo di topi DJ-1 come modello di MP, ed R6/1-R6/2 per
CH; utilizzeremo agenti farmacologici tossici capaci di interferire con il metabolismo
mitocondriale (metamfetamina, tricloroetilene, rotenone) al fine di
giungere ad una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che sottostanno
al danno del metabolismo mitocondriale.
Analizzeremo infatti le correnti ioniche che sottendono le risposte di singoli
tipi neuronali a condizioni di stress energetico, identificando i canali ionici
responsabili. Valuteremo l’attività sinaptica striatale e le modificazioni a lungo
termine in modelli patologici sperimentali. In relazione alle alterazioni di plasticità
documenteremo le modificazioni comportamentali degli animali con
appositi test. Identificheremo i meccanismi recettoriali e post-recettoriali
responsabili delle suddette modifiche. Infine analizzeremo i rapporti tra dopamina
e sistema endocannabinoide nel liquido cerebrospinale di pazienti affetti
da MP. La migliore conoscenza di tali meccanismi condurrà alla identificazione
di nuovi bersagli farmacologici capaci di contrastare la progressione di queste
patologie neurodegenerative.
METODOLOGIA
Verranno utilizzati topi transgenici DJ-1 knock-out, R6/1 ed R6/2,
e topi sottoposti ad intossicazione con la tossina mitocondriale metamfetamina.
Saranno effettuati inoltre test di valutazione motoria e cognitiva, e
cioè valutazione cognitiva, cross-maze, e fear conditioning. Le fettine corticostriatali
e di sostanza nera dei topi (200-250 µm spessore), tagliate al
vibratomo, vengono mantenute prima e durante la registrazione elettrofisiologica
in una soluzione fisiologica ossigenata a temperatura costante. Una
singola fettina di tessuto viene quindi trasferita nella camera di registrazione
e perfusa con soluzione fisiologica, ossigenata, così composta: (in
mM) 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 2.4 CaCl2, 11 glucosio e
25 NaHCO3.
Una camera monocromatica verrà usata per visualizzare gli interneuroni.
Le registrazioni elettrofisiologiche vengono effettuate sia nella modalità di
whole-cell patch-clamp che con microelettrodi convenzionali; verranno utilizzati
amplificatori Axon (Axoclamp 2B), e i dati verranno acquisiti registrati ed
analizzati mediante software pClamp 9. Per la stimolazione sinaptica l’elettrodo
bipolare viene localizzato nel corpus callosus. Per le registrazioni fluorimetriche
ed elettriche simultanee il microelettrodo viene riempito con una
soluzione 1 mM bis-fura2 in 100mM KCl.
Test comportamentali
– Open field. Ogni ratto viene posizionato al centro della area recintata e
lasciato libero di esplorarla per 5 minuti. Dopo 5 minuti un oggetto viene
posizionato nel quadrato centrale. Vengono registrati tramite una tastiera
connessa ad un PC il tempo passato per l’inizio dell’esplorazione, motilità.
724 2006