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Esocitosi glutammatergica e cross-talk eccitotossico tra motoneuroni e glia nella Sclerosi…
ARTICOLAZIONE DEL PROGETTO
La ricerca, che utilizzerà topi transgenici SOD1-G93A(+) in fase avanzata
o presintomatica, sarà condotta utilizzando corteccia cerebrale e midollo spinale
prelevati da topo adulto, fettine ottenute dalle aree indicate (modello di
studio per le relazioni morfo-funzionali tra neuroni e glia), colture di motoneuroni
o corteccia motoria, colture di astrociti e microglia.
Il progetto si articolerà nei seguenti punti:
WP 1-2 (U.O. 1-2-3) – Studio delle dinamiche di rilascio delle vescicole
sinaptiche. Ruolo dello stress ossidativo nella modulazione del “ signalling ”
intracellulare nelle patologie su base neurodegenerativa e identificazione di
possibili bersagli molecolari modificati per delineare possibili vie di attivazione
del danno eccitotossico.
WP 3 (U.O. 1-2-3) – Studio delle alterazioni rincontrabili in diverse tappe
della trasmissione glutammatergica negli animali modello della malattia,
nella corteccia cerebrale (area motoria) e nel midollo spinale.
WP 4 (U.O. 1-2-4-5) – Studio degli effetti dell’attivazione microgliale sulla
sopravvivenza dei motoneuroni nel topo SOD1-G93A. Intendiamo focalizzare
il nostro interesse su due aspetti di potenziale impatto per la patologia SLA:
1) espressione da parte di microglia di trasportatori del glutammato; 2) ruolo
neuroprotettivo della proteina Hsp70.
WP 5 (U.O. 1-2-4-5) – Analisi di due diverse strategie terapeutiche:
1) composti SOD-mimetici; 2) terapie combinate.
METODOLOGIA
Le metodiche impiegate per la presente ricerca saranno quelle già
disponibili nei gruppi che partecipano al progetto. In particolare saranno
utilizzate:
– colture primarie di cellule corticali, motoneuroni, glia e microglia;
– co-colture motoneuroni/astrociti, motoneuroni/microglia;
– frazionamenti cellulari da colture e da campioni di tessuto di topi transgenici,
con isolamento di sinaptosomi e gliosomi;
– misura del rilascio di glutammato e acetilcolina da sinaptosomi e gliosomi
di corteccia motoria e midollo spinale;
– dosaggio di glutammato ed acetilcolina endogeni;
– studio dei livelli di calcio intracellulare;
– western blotting e immunoprecipitazione immunocitochimica;
– fluorimetria e citofluorimetria;
– determinazioni spettrofotometriche di attività enzimatiche;
– ibridazione in situ;
– microscopia confocale.
2006 687