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Sezione III: Attività per progetti
cervicale, previa anestesia. Il cervello sarà rapidamente rimosso dalla scatola
cranica e fettine cerebrali (180-200 µm) saranno estratte dal cervello in toto,
tramite taglio coronale eseguito con l’ausilio di un vibratomo ed in Krebs ossigenato
(vedi oltre per la composizione) mantenuto a 33 °C. Una singola fettina
è trasferita nella camera di registrazione (0.5-1 ml di volume), montata su
un microscopio verticale (BX50WI, Olimpus), equipaggiato con un obiettivo
60 × 0.90 n.a. ad immersione (LUMPlan FI, Olympus), ed è sommersa in una
soluzione a flusso continuo (2-3 ml/min), mantenuta alla temperatura di 32°C
e ossigenata da una miscela di carbossigeno 95% O2/ 5% CO2. La composizione
della soluzione di perfusione è la seguente: (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl,
1.3 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 2.4 CaCl2, 10 glucosio, 18 NaHCO3.
Le registrazioni intracellulari con microelettrodi (riempiti con una soluzione
2 M di KCl, resistenza 40-60 Mega-Ohm) vengono eseguite secondo la
metodica del current-clamp. Un elettrodo bipolare di stimolazione è collocato
vicino all’elettrodo di registrazione, ed entrambi i poli si trovano a contatto con
la sostanza bianca tra la corteccia e lo striato. La stimolazione delle fibre cortico
striatali e di Shaffer ippocampali evoca un potenziale post-sinaptico eccitatorio
(EPSP). Per gli esperimenti di cui sopra, viene utlizzato un Amplificatore,
modello Axoclamp 2B (Axon Instruments). Le tracce elettrofisiologiche sono
visualizzate attraverso l’ausilio di un oscilloscopio (Gould Classic 6000), e
quindi acquisite e catalogate mediante il programma pClamp 9 (Axon Instruments),
ed analizzate successivamente con il programma Clampfit (Axon
Instruments). La stimolazione alta frequenza è ottenuta attraverso uno stimolo
(HFS, 3 treni, 100Hz, 3 secondi per treno, con 20 sec d’intervallo), indotto sulle
fibre afferenti. Le registrazioni di patch clamp, in configurazione whole-cell,
sono eseguite attraverso microcapillari di vetro-borosilicato (3-5 Mega-Ohm di
resistenza), contenenti la seguente soluzione (in mM): 125 K+-gluconate, 10
NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 0.5 acido 1.2-bis(2-aminofenoxy)etano-N,N,N,N –tetracetico,
19 acido N-(2-idrossietil)-piperazina-N-s-etansolfonico, 0.3 guanosina trifosfato
(GTP), 1 Mg-adenosina trifosfato (Mg-ATP), pH finale 7.3 aggiustato con
KOH. La corrente di membrana è monitorata usando un amplificatore Axopatch
1D per patch clamp (Axon Instruments). La resistenza ottenuta dopo
fusione dell’elettrodo con la membrana è misurata in modalità voltage-clamp, e
si assesta in un range di 5-30 Mega- Ohm. I test di voltaggio (Ramps) e le opportune
sottrazioni digitali delle correnti risultanti, sono ottenuti mediante
l’utilizzo del programma pClamp 9 (Axon Instruments). Per comparare chiaramente
le curve corrente-voltaggio, prima e dopo la perfusione di agenti farmacologici,
viene controllata la resistenza attraverso l’ampiezza del picco delle
correnti transienti capacitive indotte con steps di 5 mV, applicati prima del test
di voltaggio (da -120 mV a -40 mV, 6mV/s). I valori saranno poi riportati come
medie +/- SEM dei cambiamenti nelle rispettive popolazioni cellulari.
Microfluorimetria – Le misurazioni di [Na+] and [Ca2+] intracellulare
saranno fatte su neuroni caricati col colorante sodio-sensibile (sodium-binding
benzofuran isophthalate (SBFI))e con il fura-2 (Calcio). (Tutti gli indicatori
fluorescenti saranno applicati attraverso l’elettrodo di patch. Il segnale
fluorescente proveniente dal citoplasma neuronale sarà ottenuto con un
sistema d’eccitazione e detenzione della Photonic Science, UK.
610 2006